Name: Umfassende Charakterisierung der Gewebemineralisierung in einem ex vivo Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Erfahren Sie die umfassende Charakterisierung der Gewebemineralisierung in einem ex vivo Modell zur Evaluation der Knochenregeneration. Diese multimodale Analyse mit Mikro-CT, Deep Learning und Nanoindentation liefert qualitative und quantitative Daten für die regenerative Medizin.

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<meta charset="utf8"></head><body>Multimodale Analyse der Knochenbildung mit Hilfe von Explantatmodellen

<ol><li>Feroz, S., Cathro, P., Ivanovski, S., Muhammad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+bone+grafts+and+substitutes%3A+A+review+of+recent+advancements+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Adv%22%5BJournal%5D)">Biomimetic bone grafts and substitutes: A review of recent advancements and applications.</a> Biomed Eng Adv. 6, 100107(2023).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP2+activity%2C+although+dispensable+for+bone+formation%2C+is+required+for+the+initiation+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing.</a> Nat Genet. 38 (12), 1424-1429 (2006).</li>
<li>Hadjidakis, D. J., Androulakis, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boneremodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Boneremodeling.</a> Ann N Y Acad Sci. 1092, 385-396 (2006).</li>
<li>Boivin, G., Meunier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degree+of+mineralization+of+bone+tissue+measured+by+computerized+quantitative+contact+microradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tiss+Int%22%5BJournal%5D)">The degree of mineralization of bone tissue measured by computerized quantitative contact microradiography.</a> Calcified Tiss Int. 70 (6), 503-511 (2002).</li>
<li>Boivin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+remodeling+on+the+mineralization+of+bone+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporo+Int%22%5BJournal%5D)">Influence of remodeling on the mineralization of bone tissue.</a> Osteoporo Int. 20 (6), 1023-1026 (2009).</li>
<li>Zanghellini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+analysis+and+comparison+of+stoichiometric+and+structural+characteristics+of+parosteal+and+conventional+osteosarcoma+with+massive+sclerosis+in+human+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Multimodal analysis and comparison of stoichiometric and structural characteristics of parosteal and conventional osteosarcoma with massive sclerosis in human bone.</a> J Str Biol. 216 (3), 108106(2024).</li>
<li>Trento, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((formation+around+two+titanium+implant+surfaces+placed+in+bone+defects+with+and+without+a+bone+substitute+material%3A+A+histological%2C+histomorphometric%2C+and+micro-computed+tomography+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Implant+Dent+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">formation around two titanium implant surfaces placed in bone defects with and without a bone substitute material: A histological, histomorphometric, and micro-computed tomography evaluation.</a> Clin Implant Dent Relat Res. 22 (2), 177-185 (2020).</li>
<li>Palmquist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiscale+analytical+approach+to+evaluate+osseointegration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration.</a> J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).</li>
<li>Budán, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+radiomics+evaluation+of+bone+formation+utilizing+multimodal+%28SPECT%2FX-ray+CT%29+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel radiomics evaluation of bone formation utilizing multimodal (SPECT/X-ray CT) in vivo imaging.</a> PLoS ONE. 13 (9), e0204423(2018).</li>
<li>Hulsart-Billström, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surprisingly+poor+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+testing+of+biomaterials+for+bone+regeneration%3A+results+of+a+multicentre+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cells+Mater%22%5BJournal%5D)">A surprisingly poor correlation between in vitro and in vivo testing of biomaterials for bone regeneration: results of a multicentre analysis.</a> Eur Cells Mater. 31, 312-322 (2016).</li>
<li>Cramer, E. E. A., Ito, K., Hofmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+bone+models+and+their+potential+in+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Osteoporo+Rep%22%5BJournal%5D)">Ex vivo bone models and their potential in preclinical evaluation.</a> Curr Osteoporo Rep. 19 (1), 75-87 (2021).</li>
<li>Chan, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trabecular+bone+explant+model+of+osteocyte-osteoblast+co-culture+for+bone+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A trabecular bone explant model of osteocyte-osteoblast co-culture for bone mechanobiology.</a> Cell Mol Bioeng. 2 (3), 405-415 (2009).</li>
<li>Doke, S. K., Dhawale, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+animal+testing%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharma+J%22%5BJournal%5D)">Alternatives to animal testing: A review.</a> Saudi Pharma J. 23 (3), 223-229 (2015).</li>
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<li>Roschger, P., Fratzl, P., Eschberger, J., Klaushofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+quantitative+backscattered+electron+imaging+for+the+measurement+of+mineral+density+distribution+in+human+bone+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Validation of quantitative backscattered electron imaging for the measurement of mineral density distribution in human bone biopsies.</a> Bone. 23 (4), 319-326 (1998).</li>
<li>Roschger, P., Plenk, H., Klaushofer, K., Eschberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+scanning+electron+microscopy+approach+to+the+quantification+of+bone+mineral+distribution%3A+backscattered+electron+image+grey-levels+correlated+to+calcium+K+alpha-line+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Micro%22%5BJournal%5D)">A new scanning electron microscopy approach to the quantification of bone mineral distribution: backscattered electron image grey-levels correlated to calcium K alpha-line intensities.</a> Scanning Micro. 9 (1), 75-86 (1995).</li>
<li>Porter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+inexpensive+paraffin-embedding+method+for+dynamic+bone+formation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quick and inexpensive paraffin-embedding method for dynamic bone formation analyses.</a> Sci Rep. 7, 42505(2017).</li>
<li>Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undecalcified+bone+preparation+for+histology%2C+histomorphometry+and+fluorochrome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis.</a> J Vis Exp. (35), e1707(2010).</li>
<li>Kazanci, M., Roschger, P., Paschalis, E. P., Klaushofer, K., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+osteonal+tissues+by+Raman+spectral+mapping%3A+Orientation-composition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone osteonal tissues by Raman spectral mapping: Orientation-composition.</a> J Str Biol. 156 (3), 489-496 (2006).</li>
<li>Unal, M., Ahmed, R., Mahadevan-Jansen, A., Nyman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+assessment+of+bone+by+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Compositional assessment of bone by Raman spectroscopy.</a> Analyst. 146 (24), 7464-7490 (2021).</li>
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<li>Kleuskens, M. W. A., van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+human+osteochondral+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">An ex vivo human osteochondral culture model.</a> J Ortho Res. 39 (4), 871-879 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.20 Filter</td><td>VWR&nbsp;</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>18 G Nadel (1,2x40 mm)</td><td>Sterican</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Spritze</td><td>HENKE-JECT</td><td>8300005762</td><td></td></tr><tr><td>37% Salzsäure</td><td>VWR&nbsp;</td><td>1.00317.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure (eiszeitlich)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Nr. A6283&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aceton&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20063-365&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>361186</tr><tr><td>Ammoniumhydroxid</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>318612</tr><tr><td>Apatitisches Tricalciumphosphat&nbsp;</td><td>Zentrum für Biomedizin- und Gesundheitstechnik (Mines Saint Etienne, Frankreich)</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azophloxin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>210633</tr><tr><td>Benzoylperoxid</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8.01641.0250</td><td></td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Medtronic&nbsp;</td><td>Induktion 1,5 mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Brillant Crocein &nbsp;</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>2107507</tr><tr><td>CTVox&nbsp;</td><td>Bruker-DataViewer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Skyscan-Diamanttrennscheibe</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Struers</td><td>MOD13</td><td></td></tr><tr><td>Diamantsäge</td><td>Struers</td><td>Accutom-50</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Mol B3 Diamantlösung</td><td>Struers</td><td>40600379</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Nap B1 Diamantlösung</td><td>Struers</td><td>40600373</td><td></td></tr><tr><td>Dibasisches Natriumphosphat (Na2HPO4)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>102404598</tr><tr><td>Dibutylphthalat</td><td>Chimie-Plus Laboratoires</td><td>28656</td><td></td></tr><tr><td>DragonFly Software&nbsp;</td><td>ORS</td><td>2022.1.0.1231.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoher Glukosegehalt, GlutaMAX(TM), Pyruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y- Surgipath&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>1002830105</tr><tr><td>Erythrosin B</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>102141057</tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>20820362</tr><tr><td>Eukitt&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>6.00.01.0003.06.01.01</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Eisenchlorid-Hexahydrat (FeCl3, 6H2O)&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1.03943.0250</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00</td><td></td></tr><tr><td>Fuchsinsäure</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1.05231.0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Bioseren</td><td>MS01NG100J</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin-Sigma</td><td>&nbsp;</td><td>86.118.9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Isostatische Presse</td><td>Nova Suisse</td><td>Pmax 1500 bar</td><td></td></tr><tr><td>Laserbeugungsgranulometrie</td><td>&nbsp; Malvern</td><td>Mastersizer 3000</td><td></td></tr><tr><td>Hellgrün</td><td>Prolabo&nbsp;</td><td></td><td></td>28947135</tr><tr><td>Lithiumcarbonat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Nr. A13149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MD-Mol Poliertuch</td><td>Struers</td><td>40500077</td><td></td></tr><tr><td>Methylcyclohexan</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Methylcyclohexan&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Methylcyclohexan&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Methylmethacrylat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8.00590.2500</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-CT, Mikroscanner &nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1272</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat (NAH2PO4)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>71496</td><td></td></tr><tr><td>Mörser</td><td>Fritsch&nbsp;</td><td>Pulverisette 6</td><td></td></tr><tr><td>N,N, Dimethylanilin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>803060</td><td></td></tr><tr><td>Nanoindentationsstation</td><td>Anton Paar</td><td>NHT2</td><td></td></tr><tr><td>ND-Nap Poliertuch</td><td>Struers</td><td>40500080</td><td></td></tr><tr><td>OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-04S</td><td></td></tr><tr><td>OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-08S</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Ral</td><td>M15</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Einweg-Einstreuformen</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18646C-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (P/S)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phosphomolybdsäure&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>221856-100 g</td><td></td></tr><tr><td>Phosphowolframsäure</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td>12863-5&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poliermaschine</td><td>Sturers</td><td>Dap V</td><td></td></tr><tr><td>Poupinel</td><td>MEMMERT</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Raman-Mikrospektrometer</td><td>Renishaw</td><td>InVia Qontor</td><td></td></tr><tr><td>Safran du G&acirc; tinais&nbsp;</td><td>Labonord&nbsp;</td><td></td><td></td>11507737</tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Evo LS 10</td><td></td></tr><tr><td>REM</td><td>Zeiss</td><td>Carl Zeiss Evo LS10</td><td></td></tr><tr><td>SiC Folien/Schleifpapiere</td><td>Struers</td><td>40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)</td><td></td></tr><tr><td>Silberfarbe</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>12686-15</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Stutzen mit Faraday-Becher, Kohlenstoff-, Aluminium- und Silikonstandards</td><td>Micro-Analysis Consultants Ltd</td><td>8602</td><td></td></tr><tr><td>T25 Kolben</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>VWR&nbsp;</td><td>28975.325</td><td></td></tr><tr><td>Xylidin Ponceau</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td>19.976-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

umfassende charakterisierung der gewebemineralisierung in einem ex vivo modell

Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model

Ein Mikro-CT-Bild des Explantats ist in Abbildung 2 dargestellt. Die manuelle Segmentierung kann den Knochen nicht optimal vom Zement trennen, der im Zentralkanal vorhanden ist, indem die globale Schwellenwertierung verwendet wird. Um die Erkennung von trabekulärem Knochen und Zement zu verbessern, schlagen wir den Einsatz von Deep Learning vor. Deep Learning ist leistungsstark für die Erkennung von Biomaterialeigenschaften und hilft, die Trennung zwischen Knochen und Zement zu verbessern, was eine bessere Bewertung der Zement-Knochen-Wechselwirkungen ermöglicht. Dies ist von größter Bedeutung, um die Menge des an der Grenzfläche mit Zement gebildeten Knochens genau zu quantifizieren und keine falschen Pixel in diese Berechnung einzubeziehen.
Die einfache Quantifizierung von Knochen an der Grenzfläche reicht jedoch nicht aus, um neu gebildeten Knochen zu charakterisieren. Eine eingehendere Untersuchung der Qualität der Knochenmatrix und der zellulären Zusammensetzung ist erforderlich, um die Stärke des neuen Knochens und die zellulären Mechanismen, die zur Bildung dieser neuen Matrix geführt haben, besser zu verstehen. Die Knochenmatrix kann mit zwei komplementären Ansätzen charakterisiert werden: qBEI und Raman-Mikrospektroskopie. Ein Beispiel für ein qBEI-Bild ist in Abbildung 3 dargestellt. Mit qBEI wird jedes Graustufen-kodierte Pixel in eine Kalziumkonzentration umgewandelt. Dies ist eine Voraussetzung für die Beurteilung der Verteilung des Calciumgehalts im trabekulären Knochen und für das Verständnis (i) des Mineralisierungsgrades des neu gebildeten Knochens an der Grenzfläche mit Zement und (ii) der Frage, ob das Vorhandensein von Zement die Mineralisierung des trabekulären Knochens stört. Der Vorteil von qBEI ist seine Fähigkeit, in sehr kurzer Zeit ein hochauflösendes Bild aufzunehmen, im Gegensatz zur Raman-Mikrospektroskopie, die eine längere Erfassungszeit erfordert. qBEI-Parameter wieCa-Mittelwert,Ca-Peak undCa-Breite können dann aus der Kalziumverteilung abgeleitet und zum Vergleich der Reaktion zwischen zwei Zementen oder Biomaterialien verwendet werden.
Auf der anderen Seite liefert qBEI keine Informationen über die Qualität der organischen Phase der Knochenmatrix an der Grenzfläche zum Biomaterial. Zusätzliche Informationen zu den Materialeigenschaften der organischen Phase werden aus der Raman-Mikrospektroskopie gewonnen. Die Raman-Mikrospektroskopie wird an derselben Probe durchgeführt, die auch für qBEI verwendet wird, nachdem die Oberfläche schnell geschliffen und poliert wurde, um die leitfähige Kohlenstoffschicht zu entfernen. Bei der Raman-Mikrospektroskopie werden Spektren an jeder Pixelposition aufgenommen. Beispiele für rohe, unverarbeitete und verarbeitete Raman-Spektren sind in Abbildung 4 dargestellt. Jedes Spektrum enthält Informationen über die Zusammensetzung des analysierten Pixels und enthält Peaks, die sich auf das Einbettungsharz beziehen, in diesem Fall pMMA, die mineralische Phase, die Peaks v1PO4 und v1CO3, und die organische Phase, die Peaks Pro, Hyp, CML, Amide III, PG, CH2, Pen. und Amide I. Im Beispiel in Abbildung 4 zeigt das unbehandelte Spektrum den Beitrag des Beschichtungsharzes bei ~812 cm-1 und einer gekrümmten Basislinie ungleich Null aufgrund der Fluoreszenz, obwohl ein roter Laser im nahen Infrarot verwendet wird. Die Spektrumsverarbeitung ist eine Voraussetzung für die genaue Berechnung der verschiedenen Raman-Parameter, insbesondere der Eliminierung der Hintergrundfluoreszenz. Bei der Datenerfassung sollte der Benutzer sowohl auf eine genaue Positionierung als auch auf die Vermeidung einer Detektorsättigung achten, um das Vorhandensein des v1PO4-Peaks in einem Abstand von ~960 cm-1 zu bestätigen. Nach der Nachbearbeitung werden die Spitzenintensitätsverhältnisse entsprechend der Position des charakteristischen Schwingungsmodus berechnet.
Es ist jedoch fraglich, ob Veränderungen in der Materialzusammensetzung zu Veränderungen der biomechanischen Reaktion führten. Um Informationen über die Biomechanik des neu gebildeten Knochens zu gewinnen, führen wir systematisch Nanoindentationsuntersuchungen an derselben Probe durch, die für die Raman-Mikrospektroskopie verwendet wird. Mechanische Informationen zum Gewebe werden aus Nanoindentationskurven gewonnen, die durch Last-Tiefen-Kurven dargestellt werden (Abbildung 5). Es ist erwähnenswert, dass die Tiefe am Ende des Tests nicht auf Null zurückgeht, was die plastische Verformung und die dauerhafte Schädigung des Materials darstellt. Die Kriechgeschwindigkeit des Eindrucks wird aus der Tiefen-Zeit-Kurve abgeleitet.
Schließlich wird die histologische Färbung verwendet, um die Reaktion des Gewebes auf das Biomaterial auf zellulärer Ebene zu beurteilen (Abbildung 6). Die vorgeschlagenen histologischen Färbungen ermöglichen es uns, das Vorhandensein von Osteoidgewebe zu bestimmen, aber auch die Identifizierung von Zellen (Makrophagen, mehrkernige Riesenzellen, Osteoklasten, Osteoblasten) und das mögliche Vorhandensein einer fibrösen Kapsel an der Grenzfläche zum Biomaterial. Dies ist sehr wichtig für das Verständnis der Biokompatibilität eines Biomaterials, aber auch für die Persistenz von neuem Knochen, wenn das Biomaterial abgebaut wird.
Insgesamt ermöglicht der Multi-Methoden-Ansatz eine eingehende Untersuchung der Knochenbildung, der Qualität des neu gebildeten Knochens und der zellulären Zusammensetzung. Wenn sie in der vorgeschlagenen Reihenfolge durchgeführt werden, können alle Untersuchungen an derselben Probe durchgeführt werden, was Kosten und Bearbeitungszeit reduziert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig01.jpg"> Abbildung 1: Grafische Zusammenfassung. Eine Zusammenfassung der Protokollschritte finden Sie hier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig02.jpg"> Abbildung 2: Mikro-CT und Deep Learning Analysen. (A) 3D-Rekonstruktion von Mikro-CT-Bildern. (B) Segmentierung von Knochen und Zement: Vergleich zwischen manueller Segmentierung und Deep Learning. Maßstabsleiste = 5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig03.jpg"> Abbildung 3: Quantitative Rückstreuelektronenbildgebung zur Bestimmung des Calciumgehalts. (A) Das Rückstreubild, das aus den Graustufen besteht, die in der Rasterelektronenmikroskopie (REM) erhalten wurden, wird von der Bildanalysesoftware in (B) eine Kalziumkarte umgewandelt, die die Hot Spots der Knochenprobe zeigt. (C) Die Verteilung des Kalziumgehalts gegenüber der Knochenfläche wird aufgetragen und die drei wichtigsten qBEI-Parameter, Camean, Capeak undCa-Breite, werden berechnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig04.jpg"> Abbildung 4: Beispiel für Raman-Spektren. (A) Rohes, unbearbeitetes Raman-Spektrum, erhalten im Spektralbereich von 800 - 1800 cm-1. Der Fluoreszenzhintergrund ist deutlich sichtbar, da die Spektren nicht bei 0 beginnen. Der Harzbeitrag (pMMA) ist mit ~812 cm-1 deutlich sichtbar. (B) Verarbeitetes Spektrum. Die Position der verschiedenen Schwingungsmodi, die von Interesse sind, wird auf dem Spektrum angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig05.jpg"> Abbildung 5: Untersuchung der mechanischen Eigenschaften des Gewebes durch Nanoindentation. (A) Die Nanoindentationsvorrichtung besteht aus einem optischen Teil, der zur Definition der Position des interessierenden Bereichs an der Oberfläche des Probenblocks verwendet wird, und dann wird der Block unter dem Eindringteil verschoben. (B) Die Belastung über die Zeit und die Tiefe über der Zeit werden während des Eindringtests aufgetragen und zur Erzeugung der (C) Last-Tiefen-Kurve. In diesem Beispiel wurde die gewählte Tiefe auf 400 nm festgelegt. Aus der Last-Tiefen-Kurve (W plast) werden die maximale Belastung (Lm), die Tiefe am Ende der Belastung (hl), die Tiefe nach der Pausenphase (hm), die Steigung des Entladesegments (S) und die Fläche unter der Be- und Entladephase des Versuchs (Wplast) abgeleitet und zur Berechnung der verschiedenen Nanoindentationsparameter verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig06.jpg"> Abbildung 6: Histologische Analyse von osteochondralen Explantaten, die nach 28 Tagen Kultur mit Zement behandelt wurden. (A) Die Movat-Färbung zeigt die Gewebestruktur, einschließlich des Knochens und des Zementes, der den Defekt ausfüllt. (B) Die HES-Färbung veranschaulicht die Gewebeintegration und die zelluläre Reaktion um den Zement herum. Maßstabsleiste: 2,5 mm. (C) Vergrößerung des hervorgehobenen Bereichs in (B), der die Grenzfläche zwischen dem Zement und dem umgebenden Gewebe darstellt, an der Zellen beobachtet werden können, die in den Zement eindringen. Maßstab: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Umfassende Charakterisierung der Gewebemineralisierung in einem ex vivo Modell

The extensive characterization of tissue mineralization in the context of bone regeneration represents a significant challenge, given the numerous ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Zerstörungsfreie Volumen-Visualisierung können nur von tomographischen Techniken, von denen die am effizientesten ist die x-ray micro-Computertomographie (CT) erreicht werden.

Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Tiermodelle werden häufig genutzt, um Krebs Metastasen in Knochen zu untersuchen. In diesem Protokoll werden wir zwei gängige Methoden der Tumorinokulation für Knochenmetastasen Studien beschreiben und beschreiben Sie kurz einige Analysen genutzt werden, um zu überwachen und zu quantifizieren diese Modelle.

Models von Knochenmetastasen

In diesem Video beschreiben wir eine Methode zum Nachweis von Osteoblasten-sezernierten Kalziumablagerungen mit einem anionischen Farbstoff, Alizarin Red S. Die kultivierten Osteoblasten werden zuerst gefärbt und dann wird der Farbstoff für die kolorimetrische Quantifizierung von Kalziumablagerungen oder des Grades der Osteoblastenmineralisierung zurückgewonnen.

In-vitro-Mineralisierungsassay: Eine kolorimetrische Methode zur Quantifizierung von Osteoblasten-Kalziumablagerungen auf Knochentransplantatersatz durch Alizarinrot-Färbung und -Extraktion

In diesem Manuskript stellen wir eine halbautomatische Kryohistologie-Plattform mit hohem Durchsatz vor, um ausgerichtete Kompositbilder von Mehrfachreaktionsmessungen aus mehreren Runden der Fluoreszenzbildgebung an gefrorenen Schnitten mineralisierter Gewebe zu erstellen.

Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology von mineralisiertem Gewebe

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um den Zustand der Mineralien in Vesikeln veröffentlicht von zwei menschlichen Knochen Zelllinien zu vergleichen: hFOB 1,19 und Saos-2. Ihre Mineralisierung Profile wurden von Alizarin rot-S (AR-S) Färbung, ultravioletten (UV) Licht Visualisierung, Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bildgebung und Energie dispersiven Röntgen-Mikroanalyse (EDX) analysiert.

Analyse der Mineralien von hFOB 1.19 produziert und Saos-2 Zellen mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie mit Energy Dispersive x-ray Mikroanalyse

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache. Gefäßverkalkungen tragen wesentlich zur Belastung durch kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität bei. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Quantifizierung der durch vaskuläre glatte Muskelzellen vermittelten Kalziumfällung in vitro durch fluoreszierende Bildgebung.

Eine halbautomatische und reproduzierbare biologisch basierte Methode zur Quantifizierung der Kalziumablagerung in vitro

Hier beschreiben wir ein einfach zu implementierendes, standardisiertes, mikrophysiologisches System, das die Komplexität der in vivo-Struktur des menschlichen Knochenmarks widerspiegelt und ein relevantes Modell zur feinen Untersuchung eines breiten Spektrums normaler und pathologischer Ereignisse bietet.

Ein menschliches Knochenmark-3D-Modell zur Untersuchung der Dynamik und Interaktionen zwischen residenten Zellen in physiologischen oder tumoralen Kontexten

In diesem Artikel wird die Methodik zur Gewinnung und Bewertung der Gefäßverkalkung durch Isolierung von murinen Aorten und anschließender Extraktion verkalkter extrazellulärer Vesikel zur Beobachtung des Mineralisierungspotenzials vorgestellt.

Analyse der extrazellulären Vesikel-vermittelten Gefäßverkalkung mittels In-vitro- und In-vivo-Modellen

Dieses Protokoll stellt eine kostengünstige und effiziente Methode zur quantitativen Bewertung der Knochenmikroarchitektur in einem Mausmodell der Osteoporose dar, indem Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) kombiniert werden.

Bewertung der trabekulären Knochenmikroarchitektur in einem Osteoporose-Mausmodell

Wir schlagen ein Protokoll zur Bewertung der Knochenregeneration auf verschiedenen hierarchischen Ebenen vor. Dieser multimodale Ansatz ermöglicht Strukturanalysen über verschiedene Längenskalen hinweg und adressiert so effektiv Herausforderungen bei der Probenvorbereitung. Es bietet zudem einen zuverlässigen Arbeitsablauf zur Bewertung der Wirksamkeit von Biomaterialien bei der Förderung der Knochenregeneration.

Multimodaler Ansatz zur Bewertung der Knochenregeneration und der Gerüstleistung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von 3D-Knochenkonstrukten unter Verwendung menschlicher Osteozyten, die in Methacrylgelatine-(GelMA)-Hydrogelen eingebettet sind und mit einer decellularisierten extrazellulären Matrix ergänzt werden. Die Methode ist kostengünstig, skalierbar und kompatibel mit einfachen Laborgeräten und bietet eine translationale Plattform zur Untersuchung von Prozesse muskuloskelettaler Erkrankungen.

Eine 3D-Knochenkulturplattform mit menschlichen Osteozyten und einer dezellularisierten extrazellulären Matrix zur Modellierung muskuloskelettaler Erkrankungen

Erfahren Sie die umfassende Charakterisierung der Gewebemineralisierung in einem ex vivo Modell zur Evaluation der Knochenregeneration. Diese multimodale Analyse mit Mikro-CT, Deep Learning und Nanoindentation liefert qualitative und quantitative Daten für die regenerative Medizin.

Umfassende Charakterisierung der Gewebemineralisierung in einem ex vivo Modell

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