Modellierung der endothelialen Glykokalyx nach der Pneumonektomie in einem 3D-Fluidik-Chip - Ein Ansatz zur Herstellung eines vaskulär basierten Organ-on-Chip-Systems

Das Mensah Lab konzentriert sich auf die Gefäßforschung und entwickelt neue Techniken zur Erforschung der endothelialen Glykokalyx und ihrer Rolle bei Gefäßerkrankungen. Zu den jüngsten Entwicklungen gehören die Entwicklung fortschrittlicherer In-vitro-Modelle für die Glykokalyxforschung und die Erforschung therapeutischer Strategien, um die Gesundheit und Reparatur von Endothelglykokalyxen bei Krankheiten zu fördern. Zu den experimentellen Herausforderungen gehören unvollständige In-vitro-Modelle, die gesunde Glykokalyx nicht genau replizieren, sowie schwierige Quantifizierungs- und Messtechniken.

Unser aktueller Beitrag auf diesem Gebiet hat das derzeitige Verständnis der endothelialen Glykokalyx erweitert, insbesondere in Bezug auf ihre Rolle bei der Metastasierung von Krebs, der Regeneration geschädigter Glykokalyx und den Wechselwirkungen mit vaskulären Oberflächenrezeptoren. Unsere Methode stellt eine kostengünstige und effektive Methode zur Herstellung von Organ-on-a-Chip-Gefäßsystemen dar, die im Vergleich zu herkömmlichen Techniken eine besser entwickelte und biomimetische endotheliale Glykokalyx exprimieren. Wiegen Sie zunächst 10 Teile Silikonelastomerbasis in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Gießen Sie einen Teil des Härters bis zu einem Endvolumen von 30 Millilitern in die Tube mit der Silikonelastomerbasis. Gründlich mischen, um eine gleichmäßige Lösung zu erhalten. Gießen Sie nun die gut gemischte Lösung in die Formen und stellen Sie die Formen dann in eine Vakuumkammer, um das PDMS 30 bis 60 Minuten lang zu entgasen oder bis keine Blasen mehr übrig sind.

Nehmen Sie das entgaste PDMS aus der Vakuumkammer und lassen Sie es 48 Stunden lang bei Raumtemperatur aushärten. Extrahieren Sie das ausgehärtete PDMS aus der PLA-Form. Legen Sie dann zwei Stücke doppelseitiges Klebeband in jede Zellkulturplatte.

Positionieren Sie anschließend jedes PDMS-Gefäß zur Hälfte auf dem Tape in einer eigenen Zellkulturschale. Platzieren Sie mehrere 30-Mikroliter-Tropfen Fibronektin mit einer Mikropipette entlang des PDMS-Gefäßsystems. Kippen Sie das PDMS nach Bedarf und verwenden Sie eine Pipettenspitze, um die Oberfläche gleichmäßig zu beschichten.

Nach einer 30-minütigen Inkubation aspirieren Sie die Fibronektinlösung aus dem PDMS. Lassen Sie die Stücke dann im Schrank an der Luft trocknen. Platzieren Sie 3D-gedruckte Stopfen an jedem Ende der PDMS-Gefäßhälften, um ein Auslaufen der Zellsuspension zu verhindern, indem Sie zwei Stopfen pro Stück verwenden.

Mit einer Mikropipette 300 Mikroliter HLMVEC-Zellsuspension in jedes PDMS-Stück säen und inkubieren. Lege dann die Hälften wieder in den Schrank zurück und entferne die vier Stecker. Fügen Sie HLMVEC-Kulturmedium hinzu, um die PDMS-Gefäßhälften einzutauchen, und inkubieren Sie erneut sechs bis 10 Stunden lang.

Aspirieren Sie nun das HLMVEC-Medium aus der Petrischale, in der sich die Gefäßhälften befinden. Platzieren Sie jede PDMS-Hälfte in den Polycarbonatblöcken und stellen Sie sicher, dass sie richtig ausgerichtet sind. Tragen Sie Silikondichtstoff auf die Enden des PDMS-Gefäßsystems auf.

Führen Sie einen zentimeterlangen Schlauch in beide Enden des unteren PDMS-Stücks ein. Drehen Sie dann den oberen Acrylblock mit der oberen PDMS-Hälfte auf den unteren Acrylblock. Schrauben Sie die Acrylblöcke zusammen und stellen Sie sicher, dass sich der Gewindeblock auf der Unterseite befindet.

Verstopfen Sie die freien Enden des Schlauchs mit 3D-gedruckten Steckern. Entfernen Sie einen Stopfen und injizieren Sie vorsichtig 500 Mikroliter HLMVEC-Nährmedium mit einer Mikropipette in das Gefäßsystem. Kippen Sie, um Luftblasen zu entfernen, und setzen Sie dann den Stecker wieder ein.

Bringen Sie den zusammengebauten Chip und die sterilen Komponenten in die Biosicherheitswerkbank. Schließen Sie alle Schläuche an und montieren Sie das Durchflusssystem, wobei Sie sicherstellen, dass der Einlassschlauch mit dem Boden des Spritzenbehälters verbunden ist, um den Schwerkraftfluss zu erleichtern. Nun wird das Strömungssystem vorsichtig mit HLMVEC-Medium angesaugt.

Verwenden Sie eine serologische 50-Milliliter-Pipette. Injizieren Sie 30 Milliliter Medium in den oberen Teil des Spritzenbehälters und betreiben Sie die Schlauchpumpe mit niedriger Drehzahl, um den Schlauch zu füllen. Waschen Sie jede PDMS-Gefäßhälfte fünf Minuten lang in PBS und fügen Sie genügend Lösung hinzu, um den Gefäßabschnitt vollständig einzutauchen.

Die Fluidsimulation zeigte im Pneumonektomiemodell im Vergleich zum Kontrollmodell eine signifikant erhöhte Scherspannung an den Gefäßgabelungen. Die Hellfeldmikroskopie bestätigte eine gleichmäßige HLMVEC-Zelladhäsion sowohl unter statischen als auch unter Flussbedingungen bei 93,1 Millilitern pro Minute nach 24 Stunden. Die Fluoreszenzbildgebung der Einlassbifurkation zeigte sowohl im Kontroll- als auch im Pneumonektomiemodell intakte und gut verteilte Zellschichten.

Die Bildgebung unmittelbar nach der zweiten Bifurkation zeigte einen erheblichen Zellverlust sowohl im Kontroll- als auch im Pneumonektomiemodell. Die Zellen blieben adhärent und zeigten in beiden Modellen eine konsistente Färbung in der Region stromabwärts der zweiten Bifurkation. Einheitlich DAPI-gefärbte Zellkerne in den Gefäßmodellen zeigten, dass die Konfluenz trotz Flow-Exposition aufrechterhalten wurde.

Ein früher Versuch mit einem Kontrollmodell führte zu einer ungleichmäßigen Zellverteilung aufgrund von Luftblasen, die während des Primings des Systems eingebracht wurden.