iPSC-abgeleitete Co-Kultur von Epithel-, mesenchymalen, endothelialen und Immunzellen zur Modellierung der Integrität der Atemwegsbarriere bei Lungengesundheit und -erkrankung
6. Dezember 2024
Dieser Artikel beschreibt die Generierung eines komplexen, mehrzelligen Atemwegsbarrieremodells, das aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleitetem Lungenepithel, Mesenchym, Endothelzellen und Makrophagen in einer Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur besteht.
Meine Forschung konzentriert sich auf das Verständnis des Umbaus der menschlichen Atemwege. Die menschlichen Atemwege dienen als Barriere gegen Umweltgifte, einschließlich Viren, Luftverschmutzung und Tabakrauch. Diese Giftstoffe können die Atemwege verletzen, so dass sie sich verändern oder umgestalten und das Atmen erschweren.
Das Modellsystem umfasst nicht nur die Epithelzellen, die die Barriere bilden, sondern auch andere Zellen, die für die Homöostase der Atemwege wichtig sind, darunter Blutgefäßzellen und Immunzellen, die Makrophagen genannt werden. Zu den aktuellen experimentellen Herausforderungen gehört die Modellierung der menschlichen Lunge in einem in vitro Modellsystem. Die Gewinnung von primären Lungenproben ist schwierig und sie sind auch sehr schwer zu kultivieren.
Daher ist die Verwendung von aus Stammzellen gewonnenen Lungenatemwegszellen, die mit Endothelzellen und Makrophagen angereichert sind, der nächste Schritt, um diese Herausforderungen zu meistern. Beschichten Sie zunächst die apikale Seite von Polyester-Zellkultureinsätzen mit 3 Mikrometer Poren mit 4 Milligramm pro Milliliter extrazellulärer Matrixlösung (ECM). Pipettieren Sie die restliche ECM-Lösung heraus.
Legen Sie die Platte dann für 1 Stunde bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Übertragen Sie die Zellkultureinsätze mit einer sauberen Pinzette steril von der 12-Well-Platte in eine große Petrischale. Beschichten Sie anschließend die basolaterale Seite der Zellkultureinsätze mit ECM-Lösung.
Nachdem Sie die restliche ECM-Lösung abgepipettiert haben, stellen Sie die Petrischale in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um sie über Nacht zu trocknen. Der T75-Kolben mit iPSC-abgeleiteten Endothelzellen wird mit PBS gewaschen. Nach dem Aspirieren der Lösung werden 5 Milliliter trypsinähnliche Protease in den Kolben gegeben und 8 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.
Tippen Sie auf den Kolben, um sicherzustellen, dass sich die Endothelzellen lösen. Anschließend werden die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Fügen Sie 5 Milliliter Stoppmedium hinzu, um die Dissoziation zu stoppen.
Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 300 g. Sobald der Überstand aspiriert ist, wird das Zellpellet in 1 Milliliter Endothelkulturmedium mit 10 Mikromolar ROCK-Inhibitor erneut suspendiert. Nachdem Sie 150.000 Zellen aliquotiert haben, resuspendieren Sie sie in 100 Mikrolitern Medium und pipettieren Sie sie mit der basolateralen Seite nach oben auf den invertierten Zellkultureinsatz.
Setzen Sie die Zellen vorsichtig in den Inkubator um und lassen Sie sie 3 Stunden lang ungestört. Geben Sie anschließend in einer 12-Well-Platte 1 Milliliter Endothelkulturmedium in jede Vertiefung. Nehmen Sie die Petrischale mit den Endothelzellen aus dem Inkubator.
Übertragen Sie die Zellkultureinsätze mit einer sauberen Pinzette vorsichtig in die Platte mit Endothelkulturmedien. Nachdem Sie visuell überprüft haben, ob die Endothelzellen anhaften, stellen Sie die Platte über Nacht in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Nachdem Sie Organoide aus dem EZM-Polymer isoliert und 15-20 Minuten lang trypsinisiert haben, fügen Sie 3 Milliliter Stoppmedium hinzu, um die Proteasereaktion zu stoppen.
Die Lösung mit einer P1000-Pipette resuspendieren und 5 Minuten lang bei 400 g zentrifugieren. Aspirieren Sie dann den Überstand aus den Organoiden der Atemwege und resuspendieren Sie die Organoide in 1 Milliliter Atemwegsexpansionsmedium mit 10 Mikromolar ROCK-Inhibitor. Entnehmen Sie eine 10-Mikroliter-Probe für eine Hämozytometer-Zellzählung und legen Sie die restlichen Zellen während der Zählung auf Eis.
Anschließend werden 300.000 iPSC-abgeleitete Atemwegszellen in 500 Mikroliter Atemwegsexpansionsmedium pro 12-Millimeter-Zellkultureinsatz gesät. Entnehmen Sie die Platte mit Zellkultureinsätzen mit Endothelzellen aus dem 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Resuspendieren Sie iPSC-Atemwegszellen und pipettieren Sie 500 Mikroliter mit 300.000 Zellen in die apikale Kammer jedes Zellkultureinsatzes.
Legen Sie die Platte für 48 Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator und halten Sie die apikalen Zellen in Flüssig-Flüssigkeit-Bedingungen. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium von der apikalen Seite des Zellkultureinsatzes. Wechseln Sie das basolaterale Medium zu einer 1:1-Mischung aus Atemwegsdifferenzierungsmedien und Endothelkulturmedien.
Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Dissoziation von iPSC-abgeleiteten Makrophagen aus dem Kolben mit Hilfe eines Zellschabers. Bei 300 g 5 Minuten zentrifugieren.
Danach aspirieren Sie den Überstand. Dann resuspendieren Sie iPSC-Makrophagen in 1 Milliliter MAC-CM2-Medien. Entnehmen Sie eine 10-Mikroliter-Probe für die Zellzählung und legen Sie die restlichen Zellen während der Zählung auf Eis.
Nach der Zählung werden 300.000 Makrophagen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Das Röhrchen bei 200 g 5 Minuten lang zentrifugieren. Nach der Zentrifugation den Überstand aus dem Röhrchen pipettieren.
Entfernen Sie die Einsätze mit Co-Kulturen von Endothel- und Atemwegszellen aus dem Inkubator. 300.000 Makrophagen in 35 Mikrolitern MAC-CM2 auf die apikale Seite des Zellkultureinsatzes säen.
Übersicht
In diesem Artikel wird die Erzeugung eines komplexen, mehrzellulären Atemwegsbarrieremodells beschrieben, das aus aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abgeleitetem Lungenepithel, Mesenchym, endothelialen Zellen und Makrophagen in einer Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur besteht. Das Modell zielt darauf ab, das Verständnis der menschlichen Atemwegsremodeling und deren Reaktion auf Umweltgifte zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Atmungsphysiologie
Hintergrund
- Die menschliche Atemwege wirken als Barriere gegen Umweltgifte.
- Toxine können Atemwegsverletzungen und -umbildungen verursachen, die die Atmung beeinträchtigen.
- Die Modellierung der menschlichen Lunge in vitro stellt erhebliche Herausforderungen dar.
- Primäre Lungenproben sind schwer zu gewinnen und zu kultivieren.
Zweck der Studie
- Erstellung eines multizellulären Modells der Atemwegsbarriere.
- Einschluss verschiedener Zelltypen, die für die Homöostase der Atemwege wichtig sind.
- Unterstützung der Forschung zu Atemwegsremodeling und Reaktionen auf Toxine.
Verwendete Methoden
- Erzeugung von aus iPSCs abgeleiteten Lungenepithelzellen.
- Einbindung von mesenchymalen und endothelialen Zellen.
- Kultivierung der Zellen an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche.
- Beurteilung der Modellfunktionalität und zellulären Interaktionen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erzeugung eines komplexen Atemwegsbarrieremodells.
- Das Modell umfasst wichtige Zelltypen: epitheliale, mesenchymale, endotheliale Zellen und Makrophagen.
- Nachgewiesenes Potenzial zur Untersuchung von Atemwegsreaktionen auf Umweltfaktoren.
- Bewältigung von Herausforderungen bei der Modellierung von menschlichem Lungengewebe in vitro.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Modell liefert Einblicke in die Umbildung der Atemwege.
- Es dient als wertvolles Werkzeug für zukünftige Forschung zur Lungengesundheit.
- Mögliche Anwendungen bei der Untersuchung von Krankheitsmechanismen und therapeutischen Maßnahmen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Modellierung der Integrität der menschlichen Atemwegsbarriere mit aus iPSCs abgeleiteten epithelialen, mesenchymalen, endothelialen und immunen Zellen schließt eine entscheidende Lücke in der translationale Atemwegsforschung. Dieses mehrlinienstrategische Kokultursystem ermöglicht die vorhersagende Untersuchung der Atemwegsreaktionen auf Toxine und Pathogene und unterstützt die mechanistische Risikominderung sowie die Zielvalidierung in der frühen Entdeckungsphase. Die physiologische Relevanz und die patientenspezifische Anpassungsfähigkeit der Plattform erhöhen das Vertrauen in die Portfolioentwicklung für Atemwegserkrankungsprogramme.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die mechanistische Aufklärung der Atemwegsbarrierefunktion und des Remodelings unter krankheitsrelevanten Stimuli.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung durch Modellierung multi-zellulärer Interaktionen und immunologischer Reaktionen.
- Erleichtert die Vorhersagegenauigkeit bei der Untersuchung von Signalwegen für Ziele bei Atemwegserkrankungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein physiologisch relevantes, reproduzierbares Kokultursystem für die Wirkstoffscreening.
- Ermöglicht die quantitative Beurteilung der Barrierefunktion und zellulärer Reaktionen auf Testsubstanzen.
- Ermöglicht die Standardisierung und Skalierbarkeit von Assays für Anwendungen im Hochdurchsatz-Screening mit hohem Informationsgehalt.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die translationale Erforschung von Biomarkern unter Berücksichtigung der krankheitsrelevanten menschlichen Atemwegsbiologie.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung mithilfe von aus Patienten gewonnenen iPSC-Linien.
- Verringert die Risiken bei Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem Reaktionen auf Pathogene und Toxine in einem für den Menschen relevanten System modelliert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses aus iPSCs stammende Atemwegs-Ko-Kultivierungsmodell ist in den Entwicklungs- bis präklinischen Kontinuum für die Forschung zu Atemwegserkrankungen integriert.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Schleimhautbarrierefunktionen und zellulärer Kommunikation.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte zur Barriereintegrität und Immunaktivierung.
- Analytik: Ermöglicht den vergleichenden Nachweis zellulärer Reaktionen auf Umweltschäden und potenzielle Therapeutika.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit präklinischen Modellen durch patientenspezifische Anpassung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine modulare, anpassbare Plattform für vielfältige Forschungspipelines in der Atemwegs- und Immunforschung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Modellierung von Atemwegserkrankungen.
- Operativer Wert: Standardisiert Mehrfachlinien-Ko-Kultivierungsabläufe hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch und optimiert die Ressourcenallokation in Atemwegs-Forschungsportfolios.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen und therapeutischen Kandidaten für Atemwegserkrankungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Differenzierung von iPSCs und in Multi-Lineage-Kokultivierungstechniken.
- Benötigt Zugang zu spezialisierten Zellkulturgefäßen und analytischen Plattformen zur Untersuchung der Barrierefunktion.
- Erfordert eine standardisierte Protokollabstimmung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen, um die Reproduzierbarkeit an verschiedenen Standorten zu gewährleisten.
- Eignet sich zur Anwendung mit verschiedenen, aus patienteneigenen Zellen gewonnenen iPSC-Linien für die Krankheitsmodellierung und personalisierte Forschung.
- Zu den Einschränkungen gehören die technische Komplexität sowie die Notwendigkeit einer sorgfältigen Validierung zellulärer Phänotypen.
