Name: iPSC-abgeleitete Co-Kultur von Epithel-, mesenchymalen, endothelialen und Immunzellen zur Modellierung der Integrität der Atemwegsbarriere bei Lungengesundheit und -erkrankung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Erstellung eines komplexen iPSC-basierten Atemwegsbarriere-Modells mit Epithel-, Mesenchym-, Endothelzellen und Makrophagen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Atemwegsremodellierung und Toxinreaktionen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Atemwegsmodell zur Untersuchung der Integrität der Lungenbarriere, von Krankheiten und der Wirkstoffforschung

<ol><li>Wu, M., Zhang, X., Lin, Y., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+airway+basal+stem+cells+in+lung+homeostasis+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of airway basal stem cells in lung homeostasis and regenerative medicine.</a> Respir Res. 23 (1), 122(2022).</li>
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<li>Khalilgharibi, N., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+form+and+function%3A+On+the+role+of+basement+membrane+mechanics+in+tissue+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">To form and function: On the role of basement membrane mechanics in tissue development, homeostasis and disease.</a> Open Biol. 11 (2), 200360(2021).</li>
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<li>Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+emerging+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in emerging viral infections.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 619690(2021).</li>
<li>Wang, Y., Zheng, J., Wang, X., Yang, P., Zhao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+and+airway+hyperresponsiveness+associated+with+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages and airway hyperresponsiveness associated with respiratory syncytial virus infection.</a> Front Immunol. 13, 1012048(2022).</li>
<li>Costa, A., De Souza Carvalho-Wodarz, C., Seabra, V., Sarmento, B., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+co-culture+of+human+alveolar+epithelium%2C+endothelium+and+macrophages+for+studying+the+interaction+of+nanocarriers+with+the+air-blood+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Triple co-culture of human alveolar epithelium, endothelium and macrophages for studying the interaction of nanocarriers with the air-blood barrier.</a> Acta Biomater. 91, 235-247 (2019).</li>
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<li>Hao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+modeling+of+SARS-COV-2+infection+of+in+vitro+cultured+polarized+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Long-term modeling of SARS-COV-2 infection of in vitro cultured polarized human airway epithelium.</a> mBio. 11 (6), e02852-e02920 (2020).</li>
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<li>Pouyanfard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+ameliorate+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human-induced pluripotent stem cell-derived macrophages ameliorate liver fibrosis.</a> Stem Cells. 39 (12), 1701-1717 (2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>12-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Einsätze, 0,4 & Mikro; m, transluzent&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>All-trans-Retinsäure (RA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 ohne Retinsäure</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BMP4&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) Fraktion V, 7,5%ige Lösung&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CD 14 (FITC)</td><td>BioLegend</td><td>982502</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 PECAM-1(APC)</td><td>R& D System</td><td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>CD 45 (PE)</td><td>BD Biosciences</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>CD 68 (PE)</td><td>BioLegend</td><td>33808</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Fujifilm</td><td>014-27501</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>R& D Systems</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD/CD 324 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324107</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM/CD 326 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324212</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D Systems</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>F& T & T D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Fisher</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Abcam</td><td>ab120058</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Modifizierter Dulbecco" s Medium (IMDM) + Glutamax&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31980030 Knockout-Serumersatz</td><td></td></tr><tr><td>(KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerin &</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus Kit (10/Karton)</td><td>Stammzelle Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>SMA</td><td>Invitrogen</td><td>50-9760-80</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5275</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>VEGF165</td><td>Preprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin-Zellsignalisierung</td><td></td><td>5741S</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Gesteinsinhibitor)&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>339100</td><td></td></tr></tbody></table>

ipsc-abgeleitete co-kultur von epithel-, mesenchymalen, endothelialen und immunzellen zur modellierung der integrität der atemwegsbarriere bei lungengesundheit und -erkrankung

iPSC-Derived Epithelial, Mesenchymal, Endothelial, and Immune Cell Co-Culture to Model Airway Barrier Integrity in Lung Health and Disease

Es gibt mehrere Phasen, in denen die Differenzierung von iPSC-abgeleiteten Atemwegsorganoiden, Endothelzellen, Immunzellen und Co-Kulturen als erfolgreich abgeschlossen beurteilt werden kann. Differenzierungen können in verschiedenen iPS-Linien durchgeführt werden, und dieses Protokoll wurde in mindestens fünf verschiedenen Linien getestet. Das Protokoll muss an jede neue iPSC-Linie angepasst werden, insbesondere durch Modifikation und Optimierung der Seeding-Dichte.
Die erfolgreiche Ausbeute von iPSC-abgeleiteten Atemwegsorganoiden kann per Hellfeld beurteilt werden und weist vier Merkmale auf: definierte Grenzen/Kanten, transluzente/zystische Morphologie, Fähigkeit zur Proliferation/Expansion und Mangel an nekrotischen Zellen. Atemwegsorganoide, die unscharf erscheinen, nehmen im Laufe der 2 Wochen der Kultur nicht an Größe zu und sollten nicht für Co-Kulturexperimente verwendet werden. Organoide mit einer dicken luminalen Schicht an der Peripherie vs. Die transluzenten/zystischen Organoide können weiterhin für nachfolgende Experimente verwendet werden. Die transluzenten/zystischen Atemwegsorganoide bestehen jedoch überwiegend aus Basalzellen, während die dicken Dualmembran-Organoide überwiegend aus Keulenzellen bestehen. Da sich Basalzellen leicht vermehren und ausdehnen können, eignen sie sich besser für die Luft-Flüssig-Interphasenkultur und Polarisation. Weitere Methoden zur Beurteilung der erfolgreichen Ausbeute an iPSC-abgeleiteten Lungenorganoiden sind die Durchflusszytometrie-Analyse im Lungenvorläuferstadium (Tag 16 der Differenzierung) für Oberflächenmarker CPM (Tabelle 1), eine erfolgreiche Differenzierungsausbeute &gt;50% CPM+ Zellen.
Stellen Sie bei der Dissoziation der Atemwegsorganoide und der Luft-Flüssig-Interphase-Kultur sicher, dass das gesamte EZM-Polymer entfernt wurde, da es sonst verhindert, dass sich die Zellen auf der Membran ausdehnen. Die Zellen sollten am 3. Tag der Kultur, vor dem Airlifting, konfluierend sein. Die Bestätigung der Zelltypen in den iAirways kann durch Färbung der jeweiligen zelltypspezifischen Marker beurteilt werden: Basalzellen (p63+), Clubzellen (SCGB1A1+), Becherzellen (MUC5AC+) und Flimmerzellen (AcTub+). Die Charakterisierung und die charakteristischen Lungenzelltyp-spezifischen Marker werden auf dem LungMAP21 verifiziert. Mesenchym kann mit Antikörpern gegen Vimentin oder Aktin der glatten Muskulatur nachgewiesen werden. Um mehr Flimmerzellen zu erzeugen, können die Kulturen über einen längeren Zeitraum ein Luftlifting oder die Zugabe von DAPT erfordern.
Die erfolgreiche Ausbeute an iPSC-abgeleiteten Endothelzellen kann mittels Hellfeld beurteilt werden, wobei eine kopfsteinpflasterartige Morphologie gezeigt wird (Tag 6 der iPSC-abgeleiteten Endotheldifferenzierung). Eine erfolgreiche iPSC-abgeleitete Endothelkultur enthält &gt;50 % CD31+-Zellen, und es sollten genügend Zellen erzeugt werden, so dass die Ausbeute nach der Sortierung mehr als 500.000 Zellen betragen sollte. Zellen können passageiert oder kryokonserviert werden, und der CD31-Marker sollte bei jeder Passage oder neuen Kultur über den Fluss getestet werden. Zellen sollten nicht über P4 hinaus passaget werden. Als Referenz siehe iPSC-abgeleitete Endothelzellen vor/nach CD31-Sortierung (Abbildung 1C). Die Endothelzellen sind flach und haben einen großen Zellkörper mit länglicher und spindelförmiger Morphologie.
Für die Makrophagendifferenzierung sollten die Embryoidkörper am Boden der ULA-Vertiefung verbleiben, und nur ein EB sollte sich in jeder Vertiefung befinden. Sie sollten bis zum 5. bis 7. Tag zystische Veränderungen zeigen. Wenn sie nach der Zentrifugation kein EB bilden, säen Sie die iPSCs ohne Schleudern in die 96-Well-ULA-Platte. Möglicherweise ist es erforderlich, die Anzahl der iPSCs zu erhöhen. Die erfolgreiche Ausbeute von iPSC-abgeleiteten Immunzellen hängt vollständig von der Fähigkeit der Embryoidkörper (EBs) ab, sich zu Zysten zu entwickeln (Tag 7 der Differenzierung). iPSC-abgeleitete Immun-EBs, die keine Zysten entwickeln, bilden kein Stroma, wenn sie auf Gelatine plattiert werden, und produzieren keine myeloischen Vorläuferzellen. Nach dem Transfer auf die mit Gelatine beschichtete Platte sollten die EBs am Boden der Platte haften bleiben. Die Bewegung der Platte sollte vorsichtig erfolgen, um sie nicht zu verschieben. Die Platten sollten zweimal pro Woche manuell gewechselt werden, und die suspendierten Zellen sollten in Mac-CM2 eingeführt oder kryokonserviert werden. Darüber hinaus sollten sie nach der Ernte der suspendierten myeloischen Vorläuferzellen an dem unbeschichteten Kunststoffkolben haften und unter Hellfeld helle Zellen mit Vakuolen erzeugen, die auf Makrophagen hinweisen. Der Marker für Monozyten, CD14+, sollte in den suspendierten Zellen &gt;90% betragen. Der Makrophagenmarker, CD68, sollte im Laufe der Zeit zunehmen, wobei ~50% der Makrophagen nach 2 Wochen CD68+ exprimieren (Abbildung 1D). Die Adhäsionseffizienz sollte für jede Zelllinie bestimmt werden. Wir erreichen einen durchschnittlichen Haftungsgrad von 20 %. Für die Polarisation werden M0-Makrophagen für 48 h entweder mit M1 (iPSC-M1) oder M2 (iPSC-M2) Makrophagen im Differenzierungsmedium II polarisiert, ergänzt mit verschiedenen Stimuli: 100 ng/mL LPS und 20 ng/mL IFN-g für die M1-Polarisation oder 50 ng/mL IL-4 und 20 ng/mL IL-13 für die M2-Polarisation. Der Marker für die M1-Polarisation ist CD80+ und die M2-Polarisation ist CD206+.
Die erfolgreiche Generierung der Triple-Co-Kultur kann durch Immunfluoreszenz für die epithelialen Tight Junction-Marker EPCAM, ECAD oder ZO-1 oder den endothelialen Tight Junction-Marker CD31 beurteilt werden (Abbildung 2C, Tabelle 1). Die Funktionalität der Triple-Co-Kultur kann auch über den transelektrischen Epithel-/Endothelwiderstand (TEER) beurteilt werden. Gut zusammengesetzte Organoid- und Endothel-Cokulturen der Atemwege weisen einen höheren elektrischen Widerstand auf, was auf eine optimale Zellkommunikation und -verbindung hinweist. Umwelteinflüsse wie E-Zigaretten oder virale Herausforderungen beeinträchtigen die Integrität der Epithel- und Endothelbarriere, was zu einem verringerten elektrischen Widerstand der Co-Kultur (Abbildung 3A,B) und unorganisierten Tight Junctions (Abbildung 3C) führt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig01v2.jpg"> 
Abbildung 1: Differenzierung und Charakterisierung von iPSC-abgeleiteten Atemwegsepithel-, Endothel- und Immunkulturen. (A) Schematische Darstellung der iPSC-gerichteten Differenzierungen für den Aufbau des iAirways. (B) iPSC-abgeleitete Organoide des Atemwegsepithels, charakterisiert durch Hellfeld- (links) und Durchflusszytometrie-Analyse (rechts) für EPCAM und ECAD. (C) iPSC-abgeleitetes Atemwegsendothel, charakterisiert durch Hellfeld- (links), Immunfluoreszenz- und Durchflusszytometrie-Analyse (rechts) für CD31. Rechts ist das jeweilige Hellfeld nach der CD31-Sortierung dargestellt. (D) iPSC-abgeleitete Makrophagen werden durch Hellfeld- (links) und Durchflusszytometrie-Analyse (rechts) für den pan-hämatopoetischen Marker CD45, den Monozytenmacher CD14 und den Makrophagenmarker CD68 charakterisiert. Maßstabsbalken: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Co-Kultur von iPSC-abgeleiteten Epithel-, mesenchymalen, Endothel- und Makrophagenzellen. (A) Schematische Darstellung des Zusammenbaus des iAirways. (B) Hellfeldbilder der jeweiligen epithelialen und endothelialen Monokultur, der epithelialen und endothelialen Bikultur und der epithelialen, endothelialen und Makrophagen-Cokultur. Makrophagen, die mit rotem Cytotracker markiert sind. Maßstabsbalken: 100 μm. (C) Immunfluoreszenzfärbung für den Tight-Junction-Marker ZO-1 auf der apikalen Seite des Zellkultureinsatzes und CD31 auf der basolateralen Seite. Maßstabsbalken: 100 μm. (D) Querschnitt des Zellkultureinsatzes mit dissoziierten Atemwegsorganoiden auf der apikalen Seite, 1 Woche nach dem Luftlift. Das linke Feld mit H&amp;E-Färbung mit dem schwarzen Pfeil zeigt Flimmerzellen. Das mittlere Bild mit Immunfluoreszenzbildgebung zeigt den epithelialen Marker E-Cadherin (ECAD). Das rechte Bild mit Immunfluoreszenzbildgebung zeigt mesenchymale Marker wie Vimentin (VIM) und Aktin der glatten Muskulatur (SMA). Maßstabsbalken: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Veränderungen der Barrierefunktion der Atemwege von iAirways, die E-Zigaretten und Viren ausgesetzt waren. (A) Schematische Darstellung des Messwerkzeugs für den transelektrischen Epithel-/Endothelwiderstand (TEER). (B) Balkendiagramm des TEER nach 7 Tagen Zugabe von Menthol-E-Zigaretten zu den Medien. Mittleres Konfidenzintervall von +/- 95 %. N = 5 biologische und 3 technische Replikate; p-Wert &lt;0,001. (C) Immunfluoreszenzfärbung des Tight-Junction-Proteins ZO-1 vor und nach einer Infektion mit SARS-CoV-2. Beachten Sie das ungeordnete Layout von ZO-1 nach der Infektion. Maßstabsstäbe: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antikörper</td>
			<td>Anwendung</td>
			<td>Verdünnung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 31 PECAM-1(APC)</td>
			<td>Durchflusszytometrie (FC)</td>
			<td>10 μl in 100 ul Puffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPCAM/CD 326 (APC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-CAD/CD 324 (APC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl in 100 ul Puffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPM</td>
			<td>FC</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 45 (PE)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl in 100 ul Puffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 14 (FITC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl in 100 ul Puffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 68 (PE)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl in 100 ul Puffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1</td>
			<td>Immunfluoreszenz (IF)</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>WENN</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>WENN</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Antikörper, die bei FACS und Immunfluoreszenz verwendet werden.
Ergänzende Datei 1: Medien- und Pufferzusammensetzungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

iPSC-abgeleitete Co-Kultur von Epithel-, mesenchymalen, endothelialen und Immunzellen zur Modellierung der Integrität der Atemwegsbarriere bei Lungengesundheit und -erkrankung

Human lung tissue is composed of an interconnected network of epithelium, mesenchyme, endothelium, and immune cells from the upper airway of the ...

ipsc-derived-epithelial-mesenchymal-endothelial-immune-cell-co

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Präsentiert wird hier ein Protokoll zur primären monozyten Isolation des menschlichen Blutes sowie deren Differenzierung in Makrophagen und dendritische Zellen und die Zusammenstellung mit Epithelzellen zu einem mehrzelligen menschlichen Lungenmodell. Biologische Reaktionen von Kokulturen, die sich aus Immunzellen zusammensetzen, die sich entweder von frisch isolierten oder aufgetauten Monozyten unterscheiden, werden bei Exposition gegenüber proinflammatorischen Reizen verglichen.

Multizelluläres humanes Alveolarmodell bestehend aus Epithelzellen und primären Immunzellen zur Gefahrenbeurteilung

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Methodik für Gewebedissoziation und zelluläre Fraktionierungsansätze, die die Anreicherung lebensfähiger Epithelzellen aus proximalen und distalen Regionen der menschlichen Lunge ermöglichen. Hierin werden diese Ansätze für die funktionelle Analyse von Lungenepithel-Vorläuferzellen durch den Einsatz von 3D-Organoid-Kulturmodellen angewendet.

Isolierung und Anreicherung menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen für Organoidkulturen

Das vorliegende Protokoll beschreibt humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete alveoläre Epithel-ähnliche Zellen (iAT2s) vom Typ 2. Diese Zellen können als selbsterneuernde Kugeln in 3D-Kultur kultiviert oder an die Luft-Flüssigkeits-Interface-Kultur (ALI) angepasst werden.

Erzeugung von 3D-Kugeln und 2D-Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten alveolären Epithelzellen vom Typ 2

Jüngste Fortschritte bei humaninduzierten pluripotenten Stammzelldifferenzierungsprotokollen ermöglichen die schrittweise Ableitung organspezifischer Zelltypen. Hier stellen wir detaillierte Schritte zur Erhaltung und Expansion von iPSC-abgeleiteten Atemwegsbasalzellen und deren Differenzierung zu einem mukoziliären Epithel in Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen zur Verfügung.

Erzeugung von Atemwegs-Epithelzell-Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Entwicklung und den Einsatz einer Phalloidin-basierten filamentösen Aktin-Färbetechnik mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) zur Visualisierung der adhärenten Zellschichtstruktur in mikrofluidischen dynamischen Kulturkanälen und traditionellen statischen Fix-Well-Kulturkammern. Dieser Ansatz hilft bei der Bewertung der Zellschichtkonfluenz, der Monolagenbildung und der Gleichmäßigkeit der Schichtdicke.

Präparation und strukturelle Bewertung von Epithelzell-Monoschichten in einer physiologisch dimensionierten mikrofluidischen Kulturanlage

In dieser Arbeit wird eine reproduzierbare, kostengünstige und robuste Methode zur Isolierung und Expansion von primären Bronchialepithelzellen für das langfristige Biobanking und die Erzeugung differenzierter Epithelzellen durch Kultur an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche vorgestellt.

Isolierung von Bronchialepithelzellen aus reseziertem Lungengewebe für Biobanken und Etablierung gut differenzierter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen

Dieser Bericht enthält Protokolle für den Aufbau, die Zellkultur und die Assays auf der μSiM-Plattform für den Aufbau von Blut-Hirn-Schrankenmodellen.

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

Hier wird ein Protokoll für die Kultivierung von humanen Ösophagus-Organoiden und Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen bereitgestellt. Die Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur von Ösophagus-Organoiden kann verwendet werden, um den Einfluss von Zytokinen auf die Epithelbarriere der Speiseröhre zu untersuchen.

Dreidimensionale Zellkulturmodelle zur Untersuchung der Epithelbarriere bei eosinophiler Ösophagitis 

In dieser Arbeit beschreiben wir ein in vitro Modell zur Isolierung und Differenzierung von murinen Atemwegsepithelzellen, wobei der Schwerpunkt auf ihrer Akklimatisierung an chronischen Zigarettenrauchextrakt (CSE) liegt. Das Modell könnte verwendet werden, um die Multi-Omics-Auswirkungen von CSE umfassend zu charakterisieren, was möglicherweise Einblicke in die zellulären Reaktionen unter chronischer Rauchbelastung liefert.

In vitro Modell zur Untersuchung der Differenzierung und Veränderung von Multi-Omics an murinen Atemwegsepithelzellen, die mit Zigarettenrauchextrakt stimuliert wurden

Dieses Protokoll beschreibt die Primärkultur / Co-Kultur von Maus-Eierstockgewebe, mit Eierstöcke von neugeborenen Mäusen und individuelle Eibläschen von präpubertären Mäusen. Die Kulturtechniken unterstützt Entwicklung in einer hoch physiologischer Weise ermöglicht Untersuchung der Wirkung von äußeren Mitteln an den Eierstöcken und der Wechselwirkungen zwischen Follikeln.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

Erfahren Sie die Erstellung eines komplexen iPSC-basierten Atemwegsbarriere-Modells mit Epithel-, Mesenchym-, Endothelzellen und Makrophagen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Atemwegsremodellierung und Toxinreaktionen.

iPSC-abgeleitete Co-Kultur von Epithel-, mesenchymalen, endothelialen und Immunzellen zur Modellierung der Integrität der Atemwegsbarriere bei Lungengesundheit und -erkrankung (Video) | JoVE Journal

iPSC-abgeleitete Co-Kultur von Epithel-, mesenchymalen, endothelialen und Immunzellen zur Modellierung der Integrität der Atemwegsbarriere bei Lungengesundheit und -erkrankung

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