Name: Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Erfahren Sie, wie Elektroporation Aktionspotenziale in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen beeinflusst. Optische Überwachung ermöglicht präzise Analyse der Membranpermeabilität und Zellerregbarkeit für klinische Anwendungen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung der Elektroporationseffekte auf gentechnisch veränderte Spiking-HEK-Zellen

<ol><li>Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+and+electropermeabilization%3A+Mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation and electropermeabilization: Mechanisms and models.</a> Ann Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).</li>
<li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+technologies+for+medicine%3A+principles%2C+applications%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Ann Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li>
<li>Kotnik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based applications in biotechnology.</a> Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).</li>
<li>Mahnič-Kalamiza, S., Vorobiev, E., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+food+processing+and+biorefinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Memb+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation in food processing and biorefinery.</a> J Memb Biol. 247 (12), 1279-1304 (2014).</li>
<li>Reddy, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+field+or+conventional+thermal+ablation+for+paroxysmal+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Pulsed field or conventional thermal ablation for paroxysmal atrial fibrillation.</a> New Engl J Med. 389 (18), 1660-1671 (2023).</li>
<li>Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+contractions+and+pain+sensation+accompanying+high-frequency+electroporation+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses.</a> Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).</li>
<li>Tung, L., Tovar, O., Neunlist, M., Jain, S. K., O'neill, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+strong+electrical+shock+on+cardiac+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of strong electrical shock on cardiac muscle tissue.</a> Ann New York Acad Sci. 720 (1), 160-175 (1994).</li>
<li>Batista Napotnik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+HEK+cells+as+a+valuable+tool+for+studying+electroporation+in+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered HEK cells as a valuable tool for studying electroporation in excitable cells.</a> Sci Rep. 14 (1), 720(2024).</li>
<li>McNamara, H. M., Zhang, H., Werley, C. A., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+controlled+oscillators+in+an+engineered+bioelectric+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+X%22%5BJournal%5D)">Optically controlled oscillators in an engineered bioelectric tissue.</a> Phys Rev X. 6 (3), 031001(2016).</li>
<li>Tian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-based+pooled+screening+yields+improved+far-red+genetically+encoded+voltage+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Video-based pooled screening yields improved far-red genetically encoded voltage indicators.</a> Nat Methods. 20 (7), 1082-1094 (2023).</li>
<li>Sweeney, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+membrane+permeability+induced+by+monopolar+and+high-frequency+bipolar+bursts+of+electrical+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell membrane permeability induced by monopolar and high-frequency bipolar bursts of electrical pulses.</a> Biochim Biophys Acta Biomembranes. 1858 (11), 2689-2698 (2016).</li>
<li>Pakhomov, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+plasma+membrane+permeabilization+in+mammalian+cells+by+nanosecond+pulsed+electric+field+%28nsPEF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics%22%5BJournal%5D)">Long-lasting plasma membrane permeabilization in mammalian cells by nanosecond pulsed electric field (nsPEF).</a> Bioelectromagnetics. 28 (8), 655-663 (2007).</li>
<li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+ratiometric+optical+mapping+enables+high-resolution+cardiac+electrophysiology+in+pig+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo ratiometric optical mapping enables high-resolution cardiac electrophysiology in pig models.</a> Cardiovasc Res. 115 (11), 1659-1671 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>Ratiolab&nbsp;</td><td>5615000</td><td></td></tr><tr><td>2-Well Nunc Lab-Tek II Chambered #1.5 Deutsches Deckglassystem</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>155379</tr><tr><td>ADP305 Differenzspannungssonde</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AP015 Stromzange</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1113903</tr><tr><td>CO2-Inkubator&nbsp;</td><td>PHCbi&nbsp;</td><td>MCO -230AICUV</td><td></td></tr><tr><td>Doxycyclin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifed Eagle" s Mittelhohes Glukosewachstumsmedium</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>ElektroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)</td><td>Potentiometrische Sonden</td><td>31795</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10131035</tr><tr><td>Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Haube</td><td>Iskra Pio&nbsp;</td><td>MC 15-2</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin&ndash; Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P07681</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysinhydrobromid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P9155-5MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Impulsgenerator&nbsp;</td><td>Sonderanfertigungen</td><td></td><td>siehe Referenz11</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1113803</tr><tr><td>T25 25 cm & sup2; Gewebekulturflasche</td><td>TPP&nbsp;</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>HEK-Zellen mit Tet-on-Spiking</td> American <td>Type Culture Collection ATCC</td><td>CRL-3479</td><td></td></tr><tr><td>Thunder Imager Lebendzellensystem für die Fluoreszenzmikroskopie</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>WavePro 7300A Oszilloskop</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Überwachung von elektroporations-induzierten veränderungen der aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten tet-on-spiking-hek-zellen

Monitoring Electroporation-Induced Changes in Action Potential Generation in Genetically Engineered Tet-On Spiking HEK cells

Veränderungen des TMV in erregbaren Zellen in vitro , die durch elektrische Pulse ausgelöst werden, können mit diesem Protokoll optisch überwacht werden, und die Fluoreszenzsignale können analysiert werden, um ihre relevanten Parameter zu extrahieren.
Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1A dargestellt. Ein typisches Signal von 100 μs elektrischem Impuls, das in Experimenten verwendet wird, ist in Abbildung 1B dargestellt. Zel...

Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be ...

monitoring-electroporation-induced-changes-action-potential

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Einzel-Zell-Elektroporation (SCE) ist eine spezialisierte Technik, die Abgabe von DNA oder andere Makromoleküle in einzelne Zellen innerhalb intakten Gewebe, auch in vivo Präparate. Hier haben wir ausführlich das Verfahren für die SCE von einem fluoreszierenden Farbstoff-oder Plasmid-DNA in die Neuronen im intakten Gehirn des Xenopus laevis Kaulquappen.

Single Cell Elektroporation in vivo innerhalb der intakten sich entwickelnde Gehirn

Wir werden zeigen, wie man die Wirkung einer einzelnen Punktmutation auf die Funktion eines Ionenkanals zu studieren.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

Craniofacial Knorpel entwickeln in engem Kontakt mit anderen Geweben und sind schwer zu lebenden Tieren zu manipulieren. Wir sind mit Elektroporation, um molekulare Werkzeuge während des Wachstums des kraniofazialen Skeletts liefern unter Umgehung der frühen Embryonalentwicklung Effekte. Dieser Ansatz erlaubt es uns, effizient Testkandidat...

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Quelle: Keener, D. G., et al. Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Schnittkulturen von erregenden und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen des Hippocampus der Maus. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video zeigt den Prozess der Einzelzell-Elektroporation, um Plasmid-DNA in Neuronen in hippokampalen Schnittkulturen von Mäusen einzuführen. Das Verfahren umfasst eine präzise Pipettenpositionierung, Druckanpassungen und Elektroporationsimpulse, um die neuronale Membran...

Genexpression durch Einzelzell-Elektroporation in hippokampalen Schnittkulturen der Maus

In diesem Video zeigen embryonale Nierenzellkulturen, die lichtabhängige Ionenkanalproteine exprimieren, die mit einem fluoreszierenden Reporter fusioniert sind, die Wirkung von Licht auf die Ionenbewegung. Die Ganzzell-Patch-Klemme wird verwendet, um die Bewegung von Ionen zu überwachen.

Optogenetische Elektrophysiologie Erfassung von Zellen mit lichtabhängigen Ionenkanälen

Diese Präsentation demonstriert eine Methode, bei der die Elektroporation von adhärenten, kultivierten Zellen zur Untersuchung der interzellulären, junktionalen Kommunikation verwendet wird, während die Zellen auf einem Objektträger wachsen, der mit leitfähigem und transparentem Indium-Zinnoxid beschichtet ist.

Ein Funktionstest für Gap Junction-Prüfung; Elektroporation von adhärenten Zellen auf Indium-Zinn-Oxid

Elektroporation wurde verwendet, um gereinigte bakterielle Virulenzeffektorproteine direkt in lebende eukaryotische Zellen einzubringen. Die Proteinlokalisation wurde durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie überwacht. Diese Methode ermöglicht Studien zum Transport, zur Funktion und zu Protein-Protein-Wechselwirkungen mit aktiven exogenen Proteinen, wodurch die Notwendigkeit einer heterologen Expression in eukaryotischen Zellen vermieden wird.

Elektroporation von Functional bakterielle Effektoren in Säugerzellen

Es wird ein Verfahren zur Abbildung von Änderungen des Membranpotentials unter Verwendung genetisch kodierter Spannungsindikatoren beschrieben.

Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

Hier wird ein Protokoll für die Einzelzellelektroporation vorgestellt, das Gene sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen über eine Reihe von In-vitro-Hippocampus-Schichtkulturaltern hinweg liefern kann. Unser Ansatz bietet eine präzise und effiziente Expression von Genen in einzelnen Zellen, mit denen zellautonome und interzelluläre Funktionen untersucht werden können.

Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Mikrofabrikationstechniken, die erforderlich sind, um ein mikrofluidisches Lab-on-a-Chip-Elektroporationsgerät zu bauen. Der Versuchsaufbau führt kontrollierte Transfektionen auf Einzelzellebene in einem kontinuierlichen Fluss durch und kann mit populationsbasierter Kontrolle auf höhere Durchsätze erweitert werden. Es wird eine Analyse bereitgestellt, die die Fähigkeit zeigt, den Grad der Permeabilisierung der Zellmembran in Echtzeit elektrisch zu überwachen.

Herstellung und Betrieb eines kontinuierlichen Durchfluss-Mikroelektroporationssystems mit Permeabilisierungsdetektion

Erfahren Sie, wie Elektroporation Aktionspotenziale in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen beeinflusst. Optische Überwachung ermöglicht präzise Analyse der Membranpermeabilität und Zellerregbarkeit für klinische Anwendungen.

Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen (Video) | JoVE Journal

Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen

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