Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen

Durch die Elektroporation wird die Durchlässigkeit der Zellmembran mittels elektrischer Hochspannungsimpulse vorübergehend erhöht. Es gibt mehrere sich schnell entwickelnde klinische Behandlungen, die auf Elektroporation basieren und auf Muskel- und Neurozellen abzielen. Es ist daher wichtig zu untersuchen, wie sich die Elektroporation auf die Fähigkeit dieser erregbaren Zellen auswirkt, Aktionspotentiale auszulösen.

In-vitro-Experimente sind sehr wichtig, um die Auswirkungen der Elektroporation auf erregbare Zellen zu verstehen. Primäre Myozyten und Neuronen haben jedoch ein sehr komplexes Ionenkanal-Expressionsprofil, das es äußerst schwierig macht, das Zusammenspiel zwischen Erregung und Elektroporation zu entwirren. Wir haben ein Protokoll entwickelt, um elektroporationsinduzierte Veränderungen der Aktionspotentialerzeugung mit Hilfe von Tet-on-Spiking-HEK-Zellen zu überwachen.

Diese Zellen exprimieren ein Minimum an Natrium- und Kaliumkanälen, die sie erregbar machen. Daher vereinfachte diese Zelle die Experimente und die theoretische Analyse der erhaltenen Ergebnisse. Mit unserem Protokoll haben wir festgestellt, dass eine sehr milde Elektroporation die Zellakzeptanz bereits dramatisch beeinflussen kann.

Diese Ergebnisse werden den Weg für die Entwicklung theoretischer Modelle der Elektroporation und Zellakzeptanz ebnen, und dies wird der Gemeinschaft helfen, die schnell aufkommenden Elektroporations-basierten Therapien im Herzen, im Gehirn und in der Skelettmuskulatur zu verbessern. Pipettieren Sie zunächst einen Milliliter PBS in eine Vertiefung der Objektträger mit zwei Vertiefungen aus Deckglas. Fügen Sie 10 Mikroliter sterile Poly-L-Lysin-Lösung von einem Milligramm pro Milliliter hinzu und mischen Sie sie gut mit einer Pipette.

1,5 Stunden bei Raumtemperatur unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube inkubieren, dann das PBS mit Poly-L-Lysin ohne weiteres Waschen entfernen. Um die Zellen zu säen, bereiten Sie eine Verdünnung von Doxycyclin-Stammlösung in einem Kulturmedium in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen vor. Entfernen Sie nun das Nährmedium aus dem T-25-Kolben.

Trypsinisieren Sie die Zellen mit 2,5 Millilitern Trypsin-EDTA-Lösung in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten. Fügen Sie 2,5 Milliliter frisches Nährmedium hinzu und pipettieren Sie die Zellen vorsichtig, um sie von der Oberfläche zu lösen. Berechnen Sie das Volumen der trypsinisierten Zellsuspension, die für die Etablierung der Kultur benötigt wird.

Subtrahieren Sie das zuvor berechnete Zellsuspensionsvolumen von 1.470 Mikrolitern, um das Volumen des Kulturmediums zu berechnen. Um Proben mit erregbaren S HEK-Zellen vorzubereiten, pipettieren Sie das berechnete Volumen des Kulturmediums und der trypsinisierten Zellsuspension in eine Vertiefung. Fügen Sie 30 Mikroliter der Doxycyclin-Verdünnung hinzu.

Mischen Sie gut, indem Sie vorsichtig pipettieren, bevor Sie die Kammern in den Kohlendioxid-Inkubator einsetzen. Zur Vorbereitung von Proben mit nicht erregbaren NS HEK-Zellen pipettieren Sie das berechnete Volumen des Kulturmediums in eine Vertiefung und fügen Sie 90 % des berechneten Volumens der Zellsuspension für S HEK-Zellen ohne Doxycyclin hinzu. Inkubieren Sie die Kammern in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für zwei bis drei Tage vor dem Experiment.

Pipettieren Sie vor dem Experiment drei Mikroliter potentiometrische Farbstoff-Stammlösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie das offene Röhrchen etwa 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Laminar-Flow-Haube, damit das Ethanol verdampfen und der potentiometrische Farbstoff trocknen kann, und geben Sie dann 997 Mikroliter kaltes Kulturmedium bei vier Grad Celsius in das Röhrchen, um den Farbstoff auf eine Endkonzentration von 12 Mikromolaren aufzulösen. Entfernen Sie anschließend das Nährmedium aus der Vertiefung.

Geben Sie einen Milliliter potentiometrische Farbstofflösung in die Zellen. Kühlen Sie die Zellen bei vier Grad Celsius und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang. Entfernen Sie anschließend die potentiometrische Farbstofflösung und bewahren Sie sie in einer Tube zur weiteren Wiederverwendung für bis zu sechs aufeinanderfolgende Experimente an einem Tag auf.

Waschen Sie die Zellen dreimal vorsichtig mit Tyrodenlösung. Pipettieren Sie nach dem letzten Waschen einen Milliliter kaliumarme Tyrodlösung in die Vertiefung. Bereiten Sie zunächst die HEK-Zellen für die Elektroporation vor und konfigurieren Sie dann die Synchronisation der Pulsabgabe mit der Bildaufnahme unter Verwendung eines TTL-Signals vom Mikroskopsystem, das den Pulsgenerator auslöst.

Platzieren Sie am Boden der Kammer zwei parallele Platin-Iridium-Drahtelektroden mit einem Durchmesser von 0,8 Millimetern und einem Abstand von fünf Millimetern zwischen den Innenkanten. Befestigen Sie die Kammer unter dem Mikroskop und verbinden Sie dann die Elektroden mit dem Impulsgenerator. Verbinden Sie den Ausgang des Impulsgenerators mit einer Spannungs- und einer Stromsonde mit einem Oszilloskop, um die Überprüfung der korrekten Impulsabgabe während des Experiments zu ermöglichen.

Fokussieren Sie die Zellen auf das Hellfeld und bilden Sie die Zellen ab, die sich in der Mitte zwischen den Elektroden befinden. Nehmen Sie 80 Bilder im Zeitraffermodus mit einer Geschwindigkeit von mindestens 25 Bildern pro Sekunde auf. Beleuchten Sie die Zellen mit einer Anregungswellenlänge von 635 Nanometern, stellen Sie die Belichtungszeit auf 10 Millisekunden ein und detektieren Sie die Emission bei etwa 700 Nanometern.

Warten Sie nach der Erfassung zwei Minuten. Stellen Sie die Spannung an der Impulsgenerator-Schnittstelle auf 63 Volt ein. Nehmen Sie alle zwei Minuten auf die gleiche Weise einen Zeitraffer auf.

Während dieser Aufnahmen wird zum Zeitpunkt der Aufnahme des 10. Bildes ein einzelner 100-Mikrosekunden-Impuls angewendet. Erfassen Sie Bilder mit Impulsspannungen von 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 und 200 Volt. Schätzen Sie das elektrische Feld, dem die Zellen ausgesetzt sind, als angelegtes Spannungs-Elektroden-Abstandsverhältnis.

Exportieren Sie für die Datenanalyse die Zeitrafferaufnahmen in das TIFF-Format und legen Sie dann alle Zeitrafferaufnahmen der angelegten Spannungen aus einem einzelnen Experiment in einem einzigen Ordner ab. Benennen Sie jede Zeitrafferaufnahme so um, dass MATLAB das elektrische Feld erkennen kann. Für die Erfassung zu Beginn des Experiments, bei der kein Impuls angelegt wird, benennen Sie sie mit der Phrase 000Vcm um.

Öffnen Sie als Nächstes die von GitHub heruntergeladene Anwendung. Klicken Sie auf Datenordner auswählen", um den Ordner auszuwählen, der die Zeitrafferaufnahmen eines Experiments enthält. Um die Pixel auszuwählen, verwenden Sie zwei Schieberegler, um den unteren Schwellenwert für ein klares Bild der Membranen und den oberen Schwellenwert für die Beseitigung von Ablagerungen aus der Analyse zu bestimmen.

Klicken Sie nun auf Daten analysieren. Auf der Registerkarte "Analyse" erscheint eine Tabelle mit extrahierten Parametern. Auf der rechten Seite der Tabelle werden Diagramme der relativen Fluoreszenz über die Zeit für jedes verwendete elektrische Feld angezeigt.

Wählen Sie die Diagramme für ein bestimmtes elektrisches Feld aus dem Dropdown-Menü auf der linken Seite über der Tabelle aus. Untersuchen Sie alle Diagramme und führen Sie eine manuelle Korrektur durch, falls falsche Spitzen erkannt werden. Wählen Sie "AUTO-Peaks löschen" am unteren Rand der Registerkarte "Analyse", um die automatisch erkannten Peaks zu löschen.

Klicken Sie auf das Diagramm, um manuell einen neuen Spitzenzeitpunkt zu bestimmen. Wählen Sie bei Bedarf die Option AUTO Peak-Erkennung erneut ausführen "am unteren Rand der Registerkarte Analyse", um die automatische Peak-Erkennung erneut durchzuführen. Die extrahierten Parameter werden nun an den neuen Peak angepasst.

Wählen Sie anschließend unten rechts auf der Registerkarte "Analyse" die Option "Daten exportieren" aus, um Daten in denselben Ordner zu exportieren wie eine Dotmap-Datei, eine Tabellenkalkulationsdatei und PNG-Bilder für jedes verwendete elektrische Feld. Elektrische Pulse von 126 Volt pro Zentimeter lösten in erregbaren Zellen mehrere Fluoreszenzspitzen aus, wie die deutlichen Oszillationen in der Fluoreszenzänderung über die Zeit zeigen. Mit zunehmender elektrischer Feldstärke änderte sich die Reaktion und zeigte eine anhaltende Depolarisation bei 400 Volt pro Zentimeter.

Nicht erregbare Zellen zeigten keine signifikanten Peaks als Reaktion auf die geringsten elektrischen Feldstärken, was auf keine Anregung hindeutet. Bei höheren elektrischen Feldstärken zeigten die nicht erregbaren Zellen auch eine anhaltende Depolarisation, was auf eine Elektroporation hindeutet. Die maximale Anzahl von Peaks in erregbaren Zellen wurde bei 150 Volt pro Zentimeter beobachtet, mit einem abnehmenden Trend in der Anzahl der Peaks, wenn die Spannung über diesen Punkt hinaus anstieg.