Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren

Unsere Forschung zielt darauf ab, die mikrobielle Vernetzung in synthetischen Konsortien zu verstehen, an denen Saccharose-sezernierende Cyanobakterien und heterotrophe Pilze beteiligt sind. In der Vergangenheit untersuchten Mikrobiologen in der Regel Reinkulturen einzelner Mikroorganismen. In der Natur kommen Mikroben jedoch meist in Konsortien vor, daher ist es wichtig, auch die mikrobielle Vernetzung in Mischkulturen zu verstehen.

Eine große Herausforderung besteht darin, geeignete Wachstumsbedingungen zu finden, einschließlich eines Mediums, das das Wachstum aller Konsortialmitglieder ermöglicht. Hier konzentrieren wir uns hauptsächlich auf die Optimierung für die höchste Saccharoseproduktion und -sekretion durch das phototrophe Element, das die Grundlage für das Wachstum der heterotrophen Mitglieder bildet. Zur Verfolgung des Wachstums in axenischen Kulturen können gängige Techniken wie optische Dichte- oder Rückstreumessungen verwendet werden.

Diese Techniken gelten jedoch nicht für Co-Kulturen, bei denen wir die Zellzahl der einzelnen Spezies benötigen. In unserem Protokoll wenden wir eine Kombination aus Fluoreszenzmarkierung und Zellzählung an, um zwischen verschiedenen Co-Kulturpartnern zu unterscheiden. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass ähnliche Ergebnisse mit verschiedenen Methoden erzielt werden können, die von einfachen, kostengünstigen bis hin zu teuren Methoden mit hohem Durchsatz reichen.

Zu Beginn pelletieren Sie die Cyanobakterienzellen, nachdem Sie die Kultur drei Tage lang gezüchtet haben. Resuspendieren Sie das Pellet in 25 Millilitern sterilem CoYBG-11-Medium. Zentrifugieren Sie die Probe bei 4.000 g für 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Entsorgen Sie dann den Überstand durch Dekantieren. Sobald die optische Dichte bestimmt ist, wird die berechnete Menge CoYBG-11 unter sterilen Bedingungen in einen 250-Milliliter-Kolben mit Blende gegeben. Anschließend werden die berechneten Volumina der cyanobakteriellen und heterotrophen Zellsuspensionen addiert, um ein endgültiges Kulturvolumen von 50 Millilitern zu erreichen.

Verwenden Sie 50 Mikroliter aus dem einmolaren IPTG-Stamm für eine 50-Milliliter-Kultur. Stellen Sie dann den Kolben bei etwa 200 Mikromol Photonen pro Quadratmeter und Sekunde in den Photoinkubator. Ergänzen Sie die Umgebung mit 2 % Kohlendioxid bei 30 Grad Celsius, orbitalem Schütteln bei 150 U/min und 75 % Luftfeuchtigkeit.

Nehmen Sie zur Probenahme den Kolben aus dem Inkubator und entnehmen Sie unter sterilen Bedingungen eine Ein-Milliliter-Probe aus der Kultur. Zur Vorbereitung der mikroskopischen Quantifizierung ist darauf zu achten, dass die Zählkammer und das Deckglas frei von Staub und Küvetten sind. Positionieren Sie das Deckglas richtig, indem Sie es mit etwas Druck auf die beiden Stützstangen schieben, ohne dass es zu Bruch kommt.

Sobald das Deckglas richtig positioniert ist, beobachten Sie die Newtonschen Ringe zwischen den beiden Glasoberflächen und stellen Sie sicher, dass das Deckglas nicht verrutscht. Mischen Sie nun die Zellsuspension gründlich und geben Sie einige Mikroliter auf den Rand der Kammer. Lassen Sie die Kammer durch Kapillarkraft vollständig füllen.

Verwenden Sie dann ein entsprechendes Objektiv eines Lichtmikroskops und fokussieren Sie auf die Gitterlinien der Zählkammer. Zählen Sie die Zellen in den Quadraten, die für die angegebene Zellengröße geeignet sind. Für die Quantifizierung durch Partikelzählung stellen Sie die optische Dichte der Probe auf 0,1 ein.

Geben Sie dann 10 Mikroliter der Probe auf 10 Milliliter isotonischen Messpuffer. Sichern Sie den Deckel des Probenbechers und mischen Sie die Probe vorsichtig, indem Sie den Becher leicht kippen. Nachdem Sie den Probenbecher in den Partikelzähler gestellt haben, führen Sie eine Kapillare mit der für die verwendeten Zellen geeigneten Porengröße in den Probenbecher ein und schließen Sie die Tür der Maschine.

Starten Sie die Messung und zeichnen Sie in einem geeigneten Bereich auf. Zellen mit unterschiedlichen Zellgrößen können in diesem Stadium unterschieden werden. Für die Quantifizierung durch Einzelzell-Durchflusszytometrie ist die optische Dichte der Proben so einzustellen, dass sie für die zytometrische Messung geeignet ist.

Wenden Sie die angegebene Formel an, um sicherzustellen, dass die Zellzahl bei einer Flussrate von 10 Mikrolitern pro Minute in einem Bereich von 1.000 bis 10.000 Zellen pro Sekunde bleibt. Übertragen Sie 300 Mikroliter jeder Probenzellensuspension in eine einzelne Vertiefung in einer 96-Well-Platte. Übertragen Sie dann die 96-Well-Platte in die automatische Probe des Zytometers.

Offene Punktdiagramme und Histogramme für die für die Proben relevanten Fluoreszenz- und Streukanäle. Um die Zellkonzentration zu bestimmen, erfassen Sie ein definiertes Probenvolumen mit der Aufzeichnungsfunktion. Trennen Sie die Signale für photo- und heterotrophe Organismen basierend auf der roten Autofluoreszenz des phototrophen Organismus unter Verwendung des Histogramms des APC-H-Kanals.

Verwenden Sie dann das Histogramm des FITC-H-Kanals, das nur die heterotrophe Population anzeigt, um die heterotrophen Zellen zu identifizieren, die grün fluoreszierendes Protein enthalten. Verwenden Sie das Histogramm des PC5.5-H-Kanals, um zwischen heterotrophen Zellen mit rot fluoreszierendem Protein und solchen ohne rot fluoreszierendes Protein zu unterscheiden.