Name: Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen aus phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien und heterotrophen Hefen. Diese Methode ermöglicht die Überwachung mikrobieller Netzwerke in synthetischen Konsortien.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protokoll zur Co-Kultivierung von Saccharose-sezernierenden Cyanobakterien mit Pilzpartnern

<table><tbody><tr><td>10x Ph1 Objektiv</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>46 04 01-9904</td><td></td></tr><tr><td>525/40 nm Bandpassfilter</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0051</td><td>FITC-Filter (in 488 nm Laser)</td></tr><tr><td>660/10 nm Bandpassfilter</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0055</td><td>APC-Kanal (in 638 nm Laser)</td></tr><tr><td>710/50 nm Bandpassfilter</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B71092</td><td>PC5.5 Kanal (in 561 nm Laser)</td></tr><tr><td>Accuvetten für Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A35473</td><td>Probenbecher mit Deckel Öffnungsrohr</td></tr><tr><td>30 &mu; M für Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C92760</td><td></td></tr><tr><td>Kapillar-Autoklav</td><td>Lab Associates</td><td>EQM-ARBP</td><td>zur Sterilisation von Material</td></tr><tr><td>Prallkolben ROTILABO&reg;, Gerals, 250 ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>LY95.1</td><td></td></tr><tr><td>BG11 / CoYBG11 Komponenten</td><td>verschiedene Lieferanten</td><td></td><td>siehe Tabelle 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Sterilfilter mit Flaschenaufsatz</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z222593</td><td>für sterile Medien, wenn Sie den Autoklaven</td></tr><tr><td>Capillary 45 & micro; m</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651738</td><td></td></tr><tr><td>CASY Zellzähler Modell TTC</td><td>Schaerfe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY Cups</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651794</td><td></td></tr><tr><td>CASYclean</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651786</td><td>Reinigungslösung</td></tr><tr><td>CASYton Lösung</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651808</td><td>Isotonische Lösung&nbsp;</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (50 mL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>BOC</td><td>270182-L</td><td>zur Versorgung von Cyanobakterien-Axenkulturen und Co-Kulturen</td></tr><tr><td>CONTRAD&reg; 70</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>81911</td><td>Tiefenreinigungslösung</td></tr><tr><td>Deckglas 20 x 26 x 0,4 mm</td><td>VWR International GmbH</td><td>631-1190</td><td>Deckglas für Zählkammer</td></tr><tr><td>Küvetten</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Cyanobakterien BG-11 Süßwasserlösung</td><td>Merck KGaA</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert Software v. 2.6</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Anwendungssoftware für Zytometer</td></tr><tr><td>CytoFLEX Sheath Fluid</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B51503</td><td>Sheat</td></tr><tr><td>Fluid Cytometer CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>BE51180</tr><tr><td>DxH Reiniger für Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>628022</td><td>Reinigungslösung</td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchenzentrifuge (klein)</td><td>Labstac</td><td>CEN16-15</td><td>zum Zentrifugieren von weniger als 2mL Kultur</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K928.1</td><td></td></tr><tr><td>FACS Röhrchen</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>2523749</td><td>Tuben für den halbautomatischen Betrieb</td></tr><tr><td>FlowClean Reinigungsmittel, 500ml</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C48093</td><td>Täglich saubere Lösung</td></tr><tr><td>Messzylinder</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z131121</td><td>für die Vorbereitung von Medien</td></tr><tr><td>HEPPSO</td><td>Merck KGaA</td><td>R426725</td><td></td></tr><tr><td>Infors MultiTron Photoinkubator</td><td>Infors AG</td><td></td><td>weißes LED-Licht</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Merck KGaA</td><td>I6758</td><td>Aliquots vorbereiten, lagern bei -20°; C, auftauen und auf Eis halten&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoton II für Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>8448011</td><td>Isotonische Lösung&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaluza gegen 2.2</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B16406</td><td>Software zur Datenanalyse der Zytometrie</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR International GmbH</td><td>115-2221</td><td>Fusselfreie Gewebe</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>KPO3</td><td>Noah Chemicals</td><td>7790-53-6</td><td></td></tr><tr><td>Messbecher</td><td>VWR</td><td>213-3747</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotestplatte, 96 Well, Stülpdeckel, flacher Boden, PS, transparent</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopsockel</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 09 18-9902/16</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopischer Kopf</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 30 14</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Wasseraufbereitungssystem</td><td>Merck Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Mulitisizer 4e Partikelzähler</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B23005</td><td>Alternative zum CASY Zellzähler</td></tr><tr><td>Neubauer verbessert, Tiefe 0,02 mm</td><td>Assistent Deutschland</td><td></td><td>Zählkammer</td></tr><tr><td>Neubauer verbessert, Tiefe 0,1 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>640010</td><td>Zählkammer</td></tr><tr><td>Sofort einsatzbereit Täglich QC Fluorosphären</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C65719</td><td>Referenz für QC</td></tr><tr><td>SCHOTT Flaschen</td><td>Dutscher</td><td>90347</td><td>zur Lagerung</td></tr><tr><td>Specord&reg; 200 Plus Spektralphotometer</td><td>Analytic Jena GmbH</td><td></td><td>OD600/750</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck KGaA</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge (groß)</td><td>Labstac</td><td>CEN18-06R</td><td>Sammelkultur Biomasse</td></tr><tr><td>Hefe Stickstoff Base, ohne Aminosäuren, ohne Ammoniumsulfat</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>11743014</tr></tbody></table>

assemblierung und quantifizierung von co-kulturen, die heterotrophe hefe mit phototrophen zuckersezernierenden cyanobakterien kombinieren

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

Etablierung von Co-Kulturen aus phototrophen S. elongatus und heterotrophen Hefen Wir haben bereits über detaillierte Ergebnisse aus der Co-Kultivierung von Synechococcus elongatus PCC 7942 mit einer Vielzahl von Unterstämmen von S. cerevisiae berichtet. Eine umfassende Beschreibung der Co-Kulturergebnisse mit diesem Cyanobakterien/Hefe-Paar finden Sie unter8. Aus Gründen der Kürze und Genauigkeit werden diese Ergebnisse hier nicht wiedergegeben. Kurz gesagt, die bisherigen Ergebnisse weisen auf eine Reihe von Überlegungen hin, die für die Etablierung von Langzeit-Cyanobakterien-Hefe-Cokulturen wichtig sind. Von größter Bedeutung ist, dass die Fähigkeit der Hefe, unter Bedingungen zu überleben, unter denen Cyanobakterien die einzigen Formen von fixiertem Kohlenstoff liefern, stark von der Effizienz abhängt, mit der der Hefestamm Saccharose verwerten kann. S. cerevisiae-Stämme, die so entwickelt oder verändert wurden, dass sie Saccharose effizienter metabolisieren27,28, überlebten mit größerer Wahrscheinlichkeit den Übergang in den Co-Kultur-Wachstumsmodus, erreichten höhere Zelldichten und zeigten eine höhere Robustheit in Langzeitexperimenten (Tage bis Wochen) cyanobakterieller Co-Kulturexperimente8. Die Anfangsphase der Inokulation einer Co-Kultur war besonders wichtig für die Lebensfähigkeit der Hefe, wahrscheinlich aufgrund von Belastungen durch die Verdünnung der Kultur, den Wechsel der Medienzusammensetzung und/oder den Entzug einer konzentrierteren Kohlenstoffquelle. Daher können Bemühungen, den Übergang von einem reichhaltigeren Wachstumsmedium zu einer minimalen Kohlenstoffverfügbarkeit zu Beginn der Co-Kultur zu erleichtern, die experimentelle Leistung und Konsistenz verbessern (siehe Schritt 1.2.1.1). Darüber hinaus zeigten S. cerevisiae Stressreaktionen, die mit Hyperoxie vereinbar sind, wenn sie in dichte Kulturen von S. elongatus inokuliert wurden, was mit der Bildung von O2 als primärem Nebenprodukt der oxygenen Photosynthese übereinstimmt. Daher könnten Bemühungen, das übermäßige Wachstum des cyanobakteriellen Partners und/oder abwechselnde "Tag/Nacht"-Lichtzyklen zu verhindern, die Lebensfähigkeit von S. cerevisiae in Langzeit-Cokulturen erheblich verlängern. Im Abschnitt Diskussion finden Sie eine zusätzliche Zusammenfassung der Phänomene, die in Kokulturen im Vergleich zu axenischen Kontrollproben häufig auftreten.
Überwachung des Wachstums von Kokulturen mit verschiedenen Methoden Im folgenden Abschnitt wird die exemplarische Quantifizierung eines künstlich gemischten dreigliedrigen Konsortiums aus Synechocystis und den beiden Hefen S. cerevisiae und U. maydis mit drei verschiedenen Methoden beschrieben. Für die Mischung wurden OD750 (für Cyanobakterien) und OD600 (für die Heterotrophen) von Einzelkulturen bestimmt und auf OD 0,1 angepasst. Einzelkulturen wurden in einem Verhältnis von 1:1:1 unter Verwendung der optischen Dichte (die sich von der Zellzahl unterscheidet, siehe oben) gemischt. Um die Unterscheidung der Hefen im Zytometer zu erleichtern, wurden Reporterstämme von gentechnisch veränderten S. cerevisiae FY1679-O1B29 , die konstitutiv zytoplasmatisches mKate2 (Genotyp: URA3Δ/pTDH3::mKate2; Stamm: S. cerevisiae mKate230) produzieren, und U. maydis Stamm AB3331 , konstitutiv produzierendes eGFP (Genotyp: pep4Δ/pRpl40::egfp; Stamm: U. maydis eGFP32)) verwendet wurden. Bemerkenswert ist, dass der Cyanobakterienstamm mit einem replikativen Plasmid ausgestattet war, das die konstitutive, starke Expression der gelb fluoreszierenden Proteinversion mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, Stamm Synechocystis mVenus, ähnlich33) und weist darüber hinaus aufgrund des Vorhandenseins der Photosynthesemaschinerie die typische starke Autofluoreszenz auf.
Mikroskopische Quantifizierung mit Zählkammern: Alle Zelltypen in der verwendeten künstlichen Mischung aus drei Mikroorganismen lassen sich mikroskopisch leicht unterscheiden (Abbildung 2A): Synechocystis und S. cerevisiae sind durch kugelförmige Zellen vertreten, die sich jedoch in ihrem Durchmesser stark unterscheiden (Synechocystis: ca. Durchmesser von 1,5-3 μm, S. cerevisiae: ca. Durchmesser von 3-6 μm), während U. maydis-Zellen eine längliche, zigarrenförmige Morphologie und eine Länge von mindestens 10 μm aufweisen (Abbildung 2A). Diese eindeutigen morphologischen Merkmale ermöglichen eine genaue Quantifizierung jedes Partners in der Mischung. Als anschauliches Beispiel werden 37, 18, 36 und 21 S. cerevisiae-Zellen in den jeweils vier großen Quadraten gezählt (Abbildung 2B). Der Mittelwert liegt bei 28 Zellen. Da ein großes Quadrat des verwendeten Hämozytometers eine Fläche von 1mm2 hat und die Kammertiefe 0,02 mm betrug, ergeben sich 28 Zellen pro 0,02 μL. Dies entspricht 1.400 Zellen/μL, was 1,4 x 106 Zellen/ml entspricht. Die anderen Zelltypen wurden gezählt und die Konzentrationen entsprechend bestimmt (Abbildung 2C, Tabelle 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Mikroskopische Quantifizierung eines dreigliedrigen Konsortiums bestehend aus Synechocystis und den Hefen S. cerevisiae und U. maydis. (A) Mikroskopisches Differenzkontrastbild (DIC) einer künstlich kombinierten Mischung der angegebenen Mikroorganismen. Alle Arten lassen sich leicht anhand ihrer Morphologie unterscheiden. Maßstabsbalken: 10 μm. (B) Beispielhafte Zählergebnisse für eine künstlich zusammengesetzte Mischung der angegebenen Stämme auf der Grundlage axenischer Kulturen mit einem OD von 0,1. Die vier großen Quadrate an den Gitterkanten wurden analysiert (rote Markierung in Abbildung 1D). (C) Der Mittelwert der verschiedenen Zellen, die in den vier Quadraten gezählt wurden, wurde verwendet, um die Konzentration der Zellen in der Suspension unter Verwendung der folgenden Gleichung zu berechnen: Mittelwert/(Kammertiefe [0,02 mm] x Größe des gezählten Quadrats [1 mm2] x 1.000). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Quantifizierung mit Partikelzählern: Partikelzähler bestimmen die Anzahl der Partikel in einer Suspension in Abhängigkeit von ihrer Größe. Im Beispieldatensatz wurde ein Partikelzähler mit einer 45 μm Kapillare verwendet. Da S. cerevisiae - und U. maydis-Zellen ähnliche Abmessungen aufweisen, können sie im Partikelzähler nicht unterschieden werden, während die kleineren Synechocystis-Zellen eindeutig voneinander getrennt werden können. Die Analyse von Einzelkulturen zeigt daher Peaks an identischen Positionen, bezogen auf 3 bis 6 μm für die beiden Hefen (Abbildung 3A). Während der Messung wird ein Unterdruck angelegt, der dazu führt, dass die Zellen in die Kapillare gelangen. Dadurch wird der elektrische Widerstand kurzzeitig verändert, so dass das Gerät anhand der Veränderung die Partikelgröße bestimmen kann. In der Mischkultur können zwei unterschiedliche Peaks nachgewiesen werden, von denen einer mit den kleineren Cyanobakterienzellen assoziiert ist und der andere eine gemeinsame Fraktion der beiden Hefearten darstellt (Abbildung 3B). Wichtig ist, dass zusätzlich zu den Peaks, die die lebenden Zellen widerspiegeln, zusätzliche Peaks bei etwa 1 μm (Abbildung 3) detektiert wurden, die Zelltrümmern und kleineren Partikeln entsprechen. Signale, die bei größeren Durchmessern als erwartet auftreten würden, können durch Zellaggregationen verursacht werden. Bemerkenswert ist, dass die Form der Peaks die Homogenität der Zellen widerspiegelt: Ein scharfer Peak zeigt sehr homogene Zellen, was für eine Co-Kultur unwahrscheinlich ist. In einer Co-Kultur ist mit einem sehr breiten Peak oder sogar zwei Peaks zu rechnen, wenn die Partner der Co-Kultur deutlich unterschiedlich groß sind. Für die axenischen Kulturen heterotropher Pilze könnte der Peak ein mittelbreiter Peak sein.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2.jpg"> 
Abbildung 3: Quantifizierung eines dreigliedrigen Konsortiums bestehend aus Synechocystis mVenus und den Hefen S. cerevisiae mKate2 und U. maydis eGFP mit Hilfe eines Partikelzählers. (A) Visuelle Ausgabe der Analysen von axenischen Kulturen der drei Stämme, wie in den Grafiken dargestellt (Zellzähler mit 45 μm Kapillare). (B) Beispielhafte visuelle Ausgabedatei für die Analyse des künstlichen dreigliedrigen Konsortiums unter identischen Bedingungen. Der Partikelzähler unterstützt nicht die Unterscheidung der beiden Hefearten, die beide durch den zweiten Peak repräsentiert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Quantifizierung mittels Einzelzellzytometrie: Mit dem Einzelzell-Durchflusszytometer können die verschiedenen Zellpopulationen anhand ihrer (Auto-) Fluoreszenz- und Lichtstreueigenschaften leicht unterschieden werden. Phototrophe Zellen (Synechocystis) können von heterotrophen Zellen (U. maydis und S. cerevisiae) anhand der roten Autofluoreszenz der photosynthetischen Pigmente unterschieden werden, die im APC-H-Kanal gemessen wird (Abbildung 4A). Basierend auf dieser anfänglichen Trennung von phototrophen und heterotrophen Zellen können die beiden heterotrophen Populationen anhand ihrer Fluoreszenzmarker eGFP im FITC-H-Kanal und mKate2 im PC5.5-Kanal unterschieden werden (Abbildung 4B,C). In einem Punktdiagramm, das die Streueigenschaften aller drei Populationen (FSC-H und FSC-Width) zeigt, können die Populationen auch mit nur geringfügigen Überlappungen der Populationen unterschieden werden (Abbildung 4D).
Mit dieser Methode wurden 10 μL der verdünnten Proben mit einer Flussrate von 10 μL/min analysiert, was eine Quantifizierung von ca. 70.000 Zellen in 1 min ermöglichte. Etwa 60 % dieser Zellen konnten Synechocystis zugeordnet werden (4,23 x 106 Zellen/ml), während die restlichen 40 % gleichmäßig auf U. maydis (1,35 x 106 Zellen/ml) und S. cerevisiae (1,36 x 106 Zellen/ml, Abbildung 4E, Tabelle 2) verteilt waren.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Quantifizierung eines dreigliedrigen Konsortiums bestehend aus dem Cyanobakterium Synechocystis mVenus und den Hefen U. maydis eGFP und S. cerevisiae mKate2 mittels Einzelzell-Durchflusszytometrie. Beispieldiagramme nach Messung einer Mischkultur von Synechocystis mVenus (dunkelgrün), U. maydis eGFP (hellgrün) und S. cerevisiae mKate2 (rot) in einem Verhältnis von 1/3 OD750 / 1/3 OD600 / 1/3 OD600 auf einem Zytometer (A) mit einem Histogramm der Ereigniszahl und der Fluoreszenz im APC-H-Kanal (z. B. 638 nm, Em.: 660/10 nm) aller Zellen, die zur Unterscheidung von phototrophen und heterotrophen Zellen anhand ihrer Autofluoreszenz verwendet werden. (B) Ein Histogramm der Ereigniszahl und der Fluoreszenz im FITC-H-Kanal (z. B. 488 nm, em.: 525/40 nm) aller heterotrophen Zellen, die zur Unterscheidung von U . maydis eGFP- und S. cerevisiae mKate2-Zellen auf der Grundlage ihrer grünen Fluoreszenzeigenschaften verwendet werden. (C) Ein Histogramm der Ereigniszahl und der Fluoreszenz im PC5,5-H-Kanal (z. B. 561 nm, em.: 710/50 nm) aller heterotrophen Zellen, die zur Unterscheidung von U . maydis eGFP- und S. cerevisiae mKate2-Zellen auf der Grundlage ihrer roten Fluoreszenzeigenschaften verwendet werden. (D) Ein Punktdiagramm der Streusignale in der FSC-Breite über dem FSC-H-Kanal, das zur Identifizierung der Zellpopulationen ohne Fluoreszenzeigenschaften verwendet wird. (E) Die Populationsstatistik einschließlich der Ereigniszahlen, Prozentsätze sowie arithmetischen Mittelwerte und Standardabweichungen (SD) der relevanten Fluoreszenzkanäle. Die Gesamtmenge der Zellen, zusammen mit ihrer Größe und Fluoreszenz, wurde in einem Volumen von 10 μL mit einer Flussrate von 10 μL/min bestimmt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Um den Output der verschiedenen Quantifizierungsmethoden vergleichend zu visualisieren, werden die ermittelten Zellzahlen in den folgenden beiden Tabellen (Tabelle 2 und Tabelle 3) dargestellt. Die Endkonzentrationen von Zellen, die mit den drei zuvor beschriebenen Methoden bestimmt werden, liegen bei allen Methoden in einem ähnlichen Bereich. Das Zytometer liefert die höchste Probengröße, gefolgt vom Partikelzähler und der mikroskopischen Quantifizierung, mit einer Abnahme von etwa einer Größenordnung zwischen den Methoden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Co-Kultur 1:1:1</td>
			<td>Photometer</td>
			<td colspan="2">Zytometer</td>
			<td colspan="2">Partikel-Zähler</td>
			<td colspan="2">Zählkammer für Mikroskopie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organismus</td>
			<td>AD750/600</td>
			<td>Zellzahl</td>
			<td>Zellen/ml</td>
			<td>Zellzahl</td>
			<td>Zellen/ml</td>
			<td>Zellzahl</td>
			<td>Zellen/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,618</td>
			<td>1,36 x 106 cm</td>
			<td rowspan="2">1,546*</td>
			<td rowspan="2">2,58 x 106*</td>
			<td>112</td>
			<td>1,40 x 106 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,541</td>
			<td>1,35 x 106 cm</td>
			<td>89</td>
			<td>1,11 x 106 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">PCC 6803 mVenus</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>42,330</td>
			<td>4,23 x 106 cm</td>
			<td>3,094</td>
			<td>5,16 x 106 cm</td>
			<td>271</td>
			<td>3,39 x 106 cm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Vergleich der verschiedenen Quantifizierungsmethoden: Künstliche Mischkultur. Beachten Sie, dass U. maydis und S. cerevisiae nicht mit einem Partikelzähler (*) unterschieden werden können.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Einheitliche Kultur</td>
			<td>Photometer</td>
			<td colspan="2">Zytometer</td>
			<td colspan="2">Partikel-Zähler</td>
			<td colspan="2">Zählkammer für Mikroskopie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organismus</td>
			<td>AD750/600</td>
			<td>Zellzahl</td>
			<td>Zellen/ml</td>
			<td>Zellzahl</td>
			<td>Zellen/ml</td>
			<td>Zellzahl</td>
			<td>Zellen/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.1</td>
			<td>38,936</td>
			<td>3,89 x 106 cm</td>
			<td>1,928</td>
			<td>3,21 x 106 cm</td>
			<td>403</td>
			<td>4,03 x 106 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.1</td>
			<td>36,927</td>
			<td>3,69 x 106 cm</td>
			<td>2,465</td>
			<td>4,11 x 106 cm</td>
			<td>307</td>
			<td>3,07 x 106 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">PCC 6803 mVenus</td>
			<td>0.1</td>
			<td>127,864</td>
			<td>1,28 x 107 cm</td>
			<td>8,186</td>
			<td>1,36 x 107 cm</td>
			<td>428</td>
			<td>1,07 x 107 cm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 3: Vergleich der verschiedenen Quantifizierungsmethoden: Kalibrierung mit Einzel-/Axenkulturen.

Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

Unsere Forschung zielt darauf ab, die mikrobielle Vernetzung in synthetischen Konsortien zu verstehen, an denen Saccharose-sezernierende Cyanobakterien und heterotrophe Pilze beteiligt sind. In der Vergangenheit untersuchten Mikrobiologen in der Regel Reinkulturen einzelner Mikroorganismen. In der Natur kommen Mikroben jedoch meist in Konsortien vor, daher ist es wichtig, auch die mikrobielle Vernetzung in Mischkulturen zu verstehen.Eine große Herausforderung besteht darin, geeignete Wachstumsbedingungen zu finden, einschließlich eines Mediums, das das Wachstum aller Konsortialmitglieder ermöglicht. Hier konzentrieren wir uns hauptsächlich auf die Optimierung für die höchste Saccharoseproduktion und -sekretion durch das phototrophe Element, das die Grundlage für das Wachstum der heterotrophen Mitglieder bildet. Zur Verfolgung des Wachstums in axenischen Kulturen können gängige Techniken wie optische Dichte- oder Rückstreumessungen verwendet werden.Diese Techniken gelten jedoch nicht für Co-Kulturen, bei denen wir die Zellzahl der einzelnen Spezies benötigen. In unserem Protokoll wenden wir eine Kombination aus Fluoreszenzmarkierung und Zellzählung an, um zwischen verschiedenen Co-Kulturpartnern zu unterscheiden. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass ähnliche Ergebnisse mit verschiedenen Methoden erzielt werden können, die von einfachen, kostengünstigen bis hin zu teuren Methoden mit hohem Durchsatz reichen.Zu Beginn pelletieren Sie die Cyanobakterienzellen, nachdem Sie die Kultur drei Tage lang gezüchtet haben. Resuspendieren Sie das Pellet in 25 Millilitern sterilem CoYBG-11-Medium. Zentrifugieren Sie die Probe bei 4.000 g für 20 Minuten bei Raumtemperatur.Entsorgen Sie dann den Überstand durch Dekantieren. Sobald die optische Dichte bestimmt ist, wird die berechnete Menge CoYBG-11 unter sterilen Bedingungen in einen 250-Milliliter-Kolben mit Blende gegeben. Anschließend werden die berechneten Volumina der cyanobakteriellen und heterotrophen Zellsuspensionen addiert, um ein endgültiges Kulturvolumen von 50 Millilitern zu erreichen.Verwenden Sie 50 Mikroliter aus dem einmolaren IPTG-Stamm für eine 50-Milliliter-Kultur. Stellen Sie dann den Kolben bei etwa 200 Mikromol Photonen pro Quadratmeter und Sekunde in den Photoinkubator. Ergänzen Sie die Umgebung mit 2 % Kohlendioxid bei 30 Grad Celsius, orbitalem Schütteln bei 150 U/min und 75 % Luftfeuchtigkeit.Nehmen Sie zur Probenahme den Kolben aus dem Inkubator und entnehmen Sie unter sterilen Bedingungen eine Ein-Milliliter-Probe aus der Kultur. Zur Vorbereitung der mikroskopischen Quantifizierung ist darauf zu achten, dass die Zählkammer und das Deckglas frei von Staub und Küvetten sind. Positionieren Sie das Deckglas richtig, indem Sie es mit etwas Druck auf die beiden Stützstangen schieben, ohne dass es zu Bruch kommt.Sobald das Deckglas richtig positioniert ist, beobachten Sie die Newtonschen Ringe zwischen den beiden Glasoberflächen und stellen Sie sicher, dass das Deckglas nicht verrutscht. Mischen Sie nun die Zellsuspension gründlich und geben Sie einige Mikroliter auf den Rand der Kammer. Lassen Sie die Kammer durch Kapillarkraft vollständig füllen.Verwenden Sie dann ein entsprechendes Objektiv eines Lichtmikroskops und fokussieren Sie auf die Gitterlinien der Zählkammer. Zählen Sie die Zellen in den Quadraten, die für die angegebene Zellengröße geeignet sind. Für die Quantifizierung durch Partikelzählung stellen Sie die optische Dichte der Probe auf 0,1 ein.Geben Sie dann 10 Mikroliter der Probe auf 10 Milliliter isotonischen Messpuffer. Sichern Sie den Deckel des Probenbechers und mischen Sie die Probe vorsichtig, indem Sie den Becher leicht kippen. Nachdem Sie den Probenbecher in den Partikelzähler gestellt haben, führen Sie eine Kapillare mit der für die verwendeten Zellen geeigneten Porengröße in den Probenbecher ein und schließen Sie die Tür der Maschine.Starten Sie die Messung und zeichnen Sie in einem geeigneten Bereich auf. Zellen mit unterschiedlichen Zellgrößen können in diesem Stadium unterschieden werden. Für die Quantifizierung durch Einzelzell-Durchflusszytometrie ist die optische Dichte der Proben so einzustellen, dass sie für die zytometrische Messung geeignet ist.Wenden Sie die angegebene Formel an, um sicherzustellen, dass die Zellzahl bei einer Flussrate von 10 Mikrolitern pro Minute in einem Bereich von 1.000 bis 10.000 Zellen pro Sekunde bleibt. Übertragen Sie 300 Mikroliter jeder Probenzellensuspension in eine einzelne Vertiefung in einer 96-Well-Platte. Übertragen Sie dann die 96-Well-Platte in die automatische Probe des Zytometers.Offene Punktdiagramme und Histogramme für die für die Proben relevanten Fluoreszenz- und Streukanäle. Um die Zellkonzentration zu bestimmen, erfassen Sie ein definiertes Probenvolumen mit der Aufzeichnungsfunktion. Trennen Sie die Signale für photo- und heterotrophe Organismen basierend auf der roten Autofluoreszenz des phototrophen Organismus unter Verwendung des Histogramms des APC-H-Kanals.Verwenden Sie dann das Histogramm des FITC-H-Kanals, das nur die heterotrophe Population anzeigt, um die heterotrophen Zellen zu identifizieren, die grün fluoreszierendes Protein enthalten. Verwenden Sie das Histogramm des PC5.5-H-Kanals, um zwischen heterotrophen Zellen mit rot fluoreszierendem Protein und solchen ohne rot fluoreszierendes Protein zu unterscheiden.

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Biotechnik

Quelle: Jiang, H., Ho, M. Isolierung und Charakterisierung von intaktem Phycobilisom in Cyanobakterien. J. Vis. Exp.(2021).Dieses Video zeigt das Verfahren zur Kultivierung von Cyanobakterien zur Gewinnung von Biomasse durch Züchtung von Zellen unter kontinuierlicher Beleuchtung mit Kohlendioxidzufuhr und nährstoffreichen Bedingungen, gefolgt von der Ernte durch Zentrifugation.

Vorbereitung der Cyanobakterienkultur für die Biomasseproduktion

Wir haben eine kontinuierliche Kultivierungsvorrichtung zur Verwendung mit optogenetische Systeme Kulturen von Mikroben zu beleuchten und regelmäßig Bildzellen in dem Abwasser mit einem umgekehrten Mikroskop. Die Kultivierung, Probenahme, Bildgebung und Bildanalyse sind voll automatisiert, so dass dynamische Reaktionen auf Beleuchtung kann über mehrere Tage gemessen werden.

Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie i) einen sich selbst replizierenden Vektor mithilfe des modularen Klon-Toolkits CyanoGate zusammenstellen kann, ii) den Vektor durch Konjugation in einen cyanobakteriellen Wirt einführt und iii) transgene Cyanobakterienstämme mit einem Plattenleser oder Durchflusszytometrie.

Genetische Modifikation von Cyanobakterien durch Konjugation mit dem CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung von Hauptklassen wasserlöslicher Metaboliten in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die beschriebene Methode ist vielseitig, robust und sensibel. Es ermöglicht die Trennung von Strukturisomeren und stereoisomeren Formen wasserlöslicher Metaboliten voneinander.

Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Die optogenetische Kontrolle des mikrobiellen Stoffwechsels bietet eine flexible dynamische Kontrolle über Fermentationsprozesse. Das Protokoll zeigt hier, wie man blaulichtregulierte Fermentationen für die chemische und Proteinproduktion auf verschiedenen volumetrischen Skalen aufbaut.

Lichtgesteuerte Fermentationen für die mikrobielle Chemikalien- und Proteinproduktion

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Isolierung von Phycobilisomen aus Cyanobakterien durch Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten. Die Fraktionen intakter Phycobilisomen werden durch 77K-Fluoreszenzemissionsspektrum und SDS-PAGE-Analyse bestätigt. Die resultierenden Phycobilisom-Fraktionen eignen sich für die negative Färbung von TEM und die massenspektrometrische Analyse.

Isolierung und Charakterisierung intakter Phycobilisomen in Cyanobakterien

In dieser Studie bestand der Hauptzweck darin, die zelluläre Aufnahme und eventuelle Exozytose von Kohlenstoffnanoröhren (CNTs) zu überwachen. Aus dieser Perspektive haben wir hier eine einzigartige Methode mit Hilfe der multispektralen bildgebenden Durchflusszytometrie vorgeschlagen, die eine Quantifizierung und Lokalisierung von CNTs in einer statistisch relevanten Anzahl von Zellen ermöglicht.

Lokalisierung und Relative Quantifizierung der Kohlenstoff-Nanoröhrchen in Zellen mit multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Eine Methode, um komplexe Nanofasern und Nanostrukturen aus einzelnen oder mehreren extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, wird beschrieben. Diese Methode verwendet Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu frei stehenden Materialien auf Proteinbasis mit abstimmbaren Zusammensetzung und Architektur für den Einsatz in einer Vielzahl von Gewebe-und Biotechnologie-Anwendungen zu erstellen.

ECM-Protein-Nanofasern und Nanostrukturen Engineered Mit Oberflächen initiierte Versammlung

Unterstützten Lipiddoppelschichten und natürlichen Membran Teilchen sind praktisch Systeme, die die Eigenschaften von Zellmembranen annähern kann und in einer Vielzahl von Analysestrategien eingearbeitet werden. Hier zeigen wir ein Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays der unterstützten Lipiddoppelschicht beschichtete SiO 2-Kugeln, Phospholipid-Vesikel oder natürlichen Membranpartikeln.

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Dieses Manuskript stellt ein Spritzgussverfahren microvessels zu entwickeln, die physiologischen Eigenschaften des Endothels rekapitulieren. Die Mikrofluidik-basierten Prozess erstellt Patent 3D Gefäßnetze mit tailor Bedingungen, wie Durchfluss, zelluläre Zusammensetzung, Geometrie und biochemische Steigungen. Das Herstellungsverfahren und Beispiele für mögliche Anwendungen beschrieben.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

Erfahren Sie die Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen aus phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien und heterotrophen Hefen. Diese Methode ermöglicht die Überwachung mikrobieller Netzwerke in synthetischen Konsortien.

Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren (Video) | JoVE Journal

Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren

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