Name: Durchführung eines genomweiten In-vitro-CRISPR-Knockout-Screenings in chimären Antigenrezeptor-T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Erfahren Sie, wie ein genomweites CRISPR-Knockout-Screening in CAR-T-Zellen Resistenzmechanismen aufdeckt. Diese Methode nutzt ein In-vitro-Erschöpfungsmodell, um die Wirksamkeit der Immuntherapie zu verbessern.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Genomweite CRISPR-Screenings in CART-Zellen zur Untersuchung von Therapieresistenzen

<ol><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-year+follow-up+supports+curative+potential+of+axicabtagene+ciloleucel+in+refractory+large+B-cell+lymphoma+%28zuma-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1).</a> Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+ciloleucel+CAR+T-cell+therapy+in+refractory+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Locke, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+activity+of+axicabtagene+ciloleucel+in+refractory+large+B-cell+lymphoma+%28zuma-1%29%3A+A+single-arm%2C+multicentre%2C+phase+1-2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial.</a> Lancet Oncol. 20 (1), 31-42 (2019).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+adult+relapsed+or+refractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 380 (1), 45-56 (2018).</li>
<li>Bai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+antigen-specific+landscape+of+CAR+T+infusion+product+identifies+determinants+of+CD19-positive+relapse+in+patients+with+all%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with all.</a> Sci Adv. 8 (23), eabj2820(2022).</li>
<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nat Med. 24, 563-571 (2018).</li>
<li>Gennert, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+regulatory+landscape+of+human+CAR+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin regulatory landscape of human CAR T cell exhaustion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 118 (30), e2104758118(2021).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+anti-CD19+CAR+T+cell+infusion+products+associated+with+efficacy+and+toxicity+in+patients+with+large+B+cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas.</a> Nat Med. 26 (12), 1878-1887 (2020).</li>
<li>Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+CRISPR%2FCAS9+to+knock+out+GM-CSF+in+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using CRISPR/CAS9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells.</a> J Vis Exp. (149), e59629(2019).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. 133 (7), 697-709 (2019).</li>
<li>Cox, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+disruption+in+CART+cells+modulates+T+cell+activation+and+enhances+CART+cell+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity.</a> Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).</li>
<li>Ottaviano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+trial+of+CRISPR-engineered+CAR19+universal+T+cells+for+treatment+of+children+with+refractory+B+cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical trial of CRISPR-engineered CAR19 universal T cells for treatment of children with refractory B cell leukemia.</a> Sci Transl Med. 14 (668), eabq3010(2022).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-CAS9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12, 828-863 (2017).</li>
<li>Mccutcheon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+epigenetic+regulators+of+human+CD8%2B+T+cell+function+identified+through+orthogonal+CRISPR+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens.</a> Nat Genet. 55, 2211-2223 (2023).</li>
<li>Zhu, W., Kelly, C., Dagur, P., Dunbar, C. E., Cordes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+activation+screen+to+optimize+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+immunophenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CRISPR activation screen to optimize chimeric antigen receptor (CAR) T cell immunophenotype.</a> Blood. 142 (Supplement 1), 4820-4820 (2023).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screening+of+CAR+T+cells+and+cancer+stem+cells+reveals+critical+dependencies+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies.</a> Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).</li>
<li>Shifrut, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+CRISPR+screens+in+primary+human+T+cells+reveal+key+regulators+of+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function.</a> Cell. 175 (7), 1958-1971.e15 (2018).</li>
<li>Belk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+crispr+screens+of+T+cell+exhaustion+identify+chromatin+remodeling+factors+that+limit+T+cell+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide crispr screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence.</a> Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).</li>
<li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ATAC-seq+maps+the+comprehensive+and+dynamic+chromatin+accessibility+landscape+of+CAR-T+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction.</a> Leukemia. 36 (11), 2656-2668 (2022).</li>
<li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li>
<li>Beider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+signatures+associated+with+CAR+T+cell+exhaustion+and+impaired+clinical+response+in+patients+with+B+cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional signatures associated with CAR T cell exhaustion and impaired clinical response in patients with B cell malignancies.</a> Cells. 11 (7), 1140(2022).</li>
<li>Wherry, E. J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">cell exhaustion.</a> Nat Immunol. 12, 492-499 (2011).</li>
<li>Prinzing, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleting+DNMT3A+in+CAR+T+cells+prevents+exhaustion+and+enhances+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity.</a> Sci Transl Med. 13, eabh0272(2021).</li>
<li>Lynn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-jun+overexpression+in+CAR+T+cells+induces+exhaustion+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">C-jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance.</a> Nature. 576, 293-300 (2019).</li>
<li>Tang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+inhibition+via+CRISPR+promotes+the+long-term+efficacy+of+CAR+T+cells+against+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TGF-beta inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors.</a> JCI Insight. 5 (4), e133977(2020).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-CAS9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control%2C+modeling%2C+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biol. 16, 281(2015).</li>
<li>Sakemura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer-associated+fibroblasts+in+the+bone+marrow+prevents+resistance+to+CART-cell+therapy+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer-associated fibroblasts in the bone marrow prevents resistance to CART-cell therapy in multiple myeloma.</a> Blood. 139 (26), 3708-3721 (2022).</li>
<li>Stewart, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+drives+exhaustion+of+CD8%2B+CART+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">IL-4 drives exhaustion of CD8+ CART cells.</a> Nat Commun. 15 (1), 7921(2024).</li>
<li>FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Babraham Bioinformatics. 
 <a target="_blank" href=" https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/"> https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bbmerge. , 
 <a target="_blank" href=" https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh"> https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh</a> (2019).</li>
<li>Pattanayak, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+profiling+of+off-target+DNA+cleavage+reveals+RNA-programmed+CAS9+nuclease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed CAS9 nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-CAS9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-CAS9-mediated gene inactivation.</a> Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Dong, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+immunotherapy+target+discovery+using+genome-scale+in+vivo+CRISPR+screens+in+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells.</a> Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CRISPR+screens+in+vivo+map+T+cell+fate+regulomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer.</a> Nature. 624 (7990), 154-163 (2023).</li>
<li>Sutra Del Galy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+CRISPR+screens+identify+SOCS1+as+intrinsic+checkpoint+of+CD4%2B+TH1+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide CRISPR screens identify SOCS1 as intrinsic checkpoint of CD4+ TH1 cell response.</a> Sci Immunol. 6 (66), eabe8219(2021).</li>
<li>Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-intrinsic+determinants+of+CAR-T+response+revealed+by+iterative+in+vivo+genome-wide+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Leukemia-intrinsic determinants of CAR-T response revealed by iterative in vivo genome-wide CRISPR screening.</a> Nat Commun. 14 (1), 8048(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>293T-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Zellen, die für die Lentivirus-Produktion verwendet werden</td></tr><tr><td>Biotin ProteinL Antikörper</td><td>GenScript</td><td>M00097</td><td>Anti-Kappa-Ketten-Antikörper für den CAR-Nachweis</td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin Dinatriumsalz</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1389-1G</td><td>Carbenicillin Antibiotikum</td></tr><tr><td>CD4 Isolierung Perlen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD8 Isolation Beads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td>NC2279958</td><td></td></tr><tr><td>DNase-Free Water</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Humanes T-Zell-Isolationskit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951RF</td><td>Negatives Isolationskit</td></tr><tr><td>Endura Elektrokompetente Zellen</td><td>Biosearch Technologies</td><td>60242-1</td><td>Elektrokompetente Zellen mit Rückgewinnungsmedium</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>GeCKO v2 CRISPR Knockout Pooled Library A</td><td>AddGene</td><td>1000000048</td><td>CRISPR Bibliothek</td></tr><tr><td>Plasmid Gene Pulser II&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2105</td><td>Elektroporator</td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Millipore Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>JeKo-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>CD19+ Zielzellen&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000075</td><td>Transfektionsreagenzkit mit einem Transfektionsreagenz (Lipofectamine 3000 Reagenz) und einem neutralen Co-Lipid-Reagenz (p3000)</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Aqua</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7851</td><td>Density gradient medium</td></tr><tr><td>Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi Kits</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific 12748412</td><td>Maxi-Prep Kit</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2X PCR MasterMix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541S</td><td>High Fidelity PCR</td></tr><tr><td>Mastermix Opti-MEM I Reduced Serum</td><td>Medium Gibco</td><td>31985-070</td><td>Reduced Serum</td></tr><tr><td>Medium pCMVR8.74</td><td>AddGene</td><td>22036</td><td>Lentivirales Verpackungsplasmid</td></tr><tr><td>Pennicillin-Streptomycin-Glutamin (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>AddGene</td><td>12259</td><td>VSV-G Hüll-exprimierendes</td></tr><tr><td>Plasmid Gepooltes humanes AB-Serum&nbsp;</td><td>Innovative Forschung</td><td>ISERABHI</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Gek-Extraktionskit</td></tr><tr><td>Qucik-DNA Midiprep Plus Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4075</td><td>Kit zur Isolierung von gDNA</td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>Automatisierter Zellseparator</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>21870092</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td>Dichtegradienten-Trennröhrchen</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Fisher Scientific</td><td>71448-16</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Antikörper (PE)</td><td>BioLegend</td><td>405203</td><td>Sekundärantikörper zur CAR-Detektion</td></tr><tr><td>T100 Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge (Optima XPN-80)</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfiltersysteme, 0,22 & Mikro; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>567-0020</td><td></td></tr><tr><td>Vakuum-Filtersysteme, 0,45 & Mikro; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165-0045</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 serumfreies hämatopoetisches Zellmedium</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td>Hämatopoetisches Zellmedium</td></tr></tbody></table>

durchführung eines genomweiten in-vitro-crispr-knockout-screenings in chimären antigenrezeptor-t-zellen

Performing an In Vitro Genome-Wide CRISPR Knockout Screen in Chimeric Antigen Receptor T Cells

Um Gene und Signalwege zu untersuchen, die bearbeitet werden können, um die Aktivität von CART-Zellen unvoreingenommen zu verbessern, haben wir einen in vitro genomweiten CRISPR-Knockout-Screen entwickelt (Abbildung 1). Dieses Sieb besteht aus zwei Phasen: einer Produktionsphase für CART-Zellen und einer selektiven Druckphase. In der Phase der Herstellung von CART-Zellen werden zunächst mindestens 110 × 106 T-Zellen aus gesunden Spender-PBMCs isoliert und mit CD3+</s...

Durchführung eines genomweiten In-vitro-CRISPR-Knockout-Screenings in chimären Antigenrezeptor-T-Zellen

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy is an innovative form of targeted immunotherapy that has revolutionized the treatment of cancer. However, ...

performing-an-vitro-genome-wide-crispr-knockout-screen-chimeric

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Herstellung von chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen ex vivo. Menschliche T-Zellen werden mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet sind, zusammen mit einem mit Interleukin-2 (IL-2) angereicherten Medium, was zu einer Aktivierung und Proliferation von T-Zellen führt. Transgene lentivirale Vektoren werden eingeführt, die es der transgenen RNA ermöglichen, sich in das Wirtsgenom zu integrieren und...

Eine ex vivo-Technik zur Herstellung chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur ex vivo Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA tragen, werden mit Milzzellen in einem mit Interleukin-2 supplementierten Medium gemischt, um das Überleben und die Proliferation von T-Zellen zu fördern. Das Gemisch wird dann auf eine mit rekombinanten menschlichen Fibronektinfragmenten beschichtete Platte überführt und zentrifugiert, um die Fusion des Virus mit der Zelle...

Eine ex vivo-Technik zur Erzeugung tumorspezifischer chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Hier beschreiben wir eine in-vitro-Kokultur Methode rekursiv Herausforderung Tumor gezielt T-Zellen, die phänotypische und funktionelle Analyse der Antitumor-T-Zell-Aktivität ermöglicht.

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Hier beschreiben wir eine schnelle und direkte in vivo CRISPR/Cas9 Screening-Methodik mit Ultraschall-geführten in utero embryonalen lentiviralen Injektionen, um gleichzeitig die Funktionen mehrerer Gene in der Haut und Mundhöhle von immunkompetenten Mäusen zu bewerten.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle

Hier stellen wir ein Protokoll für die Genbearbeitung in primären menschlichen T-Zellen vor, das die CRISPR Cas-Technologie verwendet, um CAR-T-Zellen zu modifizieren.

Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf zur Generierung und zum Testen von humanen chimären Antigenrezeptor-regulatorischen T-Zellen (CAR-Tregs).

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Doppelemulsionströpfchen, die eine T-Zelle und eine Krebszielzelle verkapseln, um die Zellabtötung auf Einzelzellebene zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die duale Quantifizierung sowohl zytotoxischer Moleküle als auch der Apoptose der Zielzellen innerhalb einer großen Population von T-Zellen.

Tröpfchenbasierter Zytotoxizitätsassay zur Beurteilung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf Einzelzellebene

Wir entwickelten ein optimiertes CRISPR-Cas9-Knockout-Screening-Protokoll für primäre CAR-T-Zellen. Durch die Reduzierung der gDNA-Übertragung durch enzymatische Verdauung und sgRNA-Kassettenpulldown minimiert dieser Ansatz PCR-Artefakte und gewährleistet eine genaue SGRNA-Detektion sowie eine robuste Identifikation funktioneller Genziele.

Verbesserung von CRISPR-Cas9-Bildschirmen in CAR-T-Zellen: Eine verfeinerte Methode zur Bibliotheksvorbereitung

Erfahren Sie, wie ein genomweites CRISPR-Knockout-Screening in CAR-T-Zellen Resistenzmechanismen aufdeckt. Diese Methode nutzt ein In-vitro-Erschöpfungsmodell, um die Wirksamkeit der Immuntherapie zu verbessern.

Durchführung eines genomweiten In-vitro-CRISPR-Knockout-Screenings in chimären Antigenrezeptor-T-Zellen

Weitere Videos entdecken