Durchführung eines genomweiten In-vitro-CRISPR-Knockout-Screenings in chimären Antigenrezeptor-T-Zellen

Die Car-T-Zelltherapie ist eine innovative Art der Krebsimmuntherapie, die zu Remissionen geführt hat, die über ein Jahrzehnt andauern. Die Raten dauerhafter Antworten sind jedoch nach wie vor begrenzt. Mit diesem Protokoll wollen wir unser Verständnis der Mechanismen hinter der Resistenz verbessern und Werkzeuge entwickeln, um das Ansprechen auf die CAR-T-Zelltherapie zu verbessern.

Zur Verbesserung der CAR-T-Zelltherapie werden derzeit viele Ansätze eingesetzt, darunter Kombinationstherapien und die Optimierung des CAR-Designs. Aufgrund zunehmender Beweise dafür, dass das epigenetische Profil von CAR-T-Zellprodukten vor der Infusion eine wichtige bestimmende Reaktion darstellt, sind genetische Editing-Technologien jedoch zu beliebten Werkzeugen geworden.

Die genomische Editierung von CAR-T-Zellen hat in präklinischen und klinischen Studien Erfolge bei der Vorbeugung von Toxizitäten und der Erhöhung der Expansion und Persistenz von CAR-T-Zellen gezeigt. Unser Protokoll für ein genomweites CRISPR-Knockout-Screening bietet einen effizienten und unvoreingenommenen Ansatz, um die besten genetischen Bearbeitungen zur Verbesserung der CAR-T-Zellfunktion zu bestimmen.

Genomweite Genstörungen erfordern großflächige und adäquate Selektionsbedingungen, um wirksam zu sein. Um die Entwicklung der CAR-T-Zell-Erschöpfung zu untersuchen, haben wir gelernt, dass wir über 80 Millionen CAR-T-Zellen zwei Wochen lang stimulieren müssen, um optimale Gen-Editierungen auszuwählen.

Während unser Protokoll entwickelt wurde, um die Entwicklung der Erschöpfung zu bewerten, kann dieses Protokoll angepasst werden, um die Entwicklung anderer Resistenzmechanismen zu bewerten. Durch das Ausfüllen genomweiter Screenings in verschiedenen Umgebungen können wir schließlich die besten Bearbeitungen bestimmen, um das Gesamtansprechen auf die CAR-T-Zelltherapie zu verbessern.

[Erzähler] Nachdem Sie die CAR-T-Zellen mit der CRISPR-Bibliothek transduziert haben, zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 300 g bei 4 Grad Celsius, um sie zu waschen. Der Überstand wird aspiriert und die Proben werden in 20 Millilitern T-Zellmedium resuspendiert. Um Proben für die Sequenzierung der nächsten Generation zu konservieren, aliquotieren Sie genügend CAR-T-Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, um eine Guide-RNA-Darstellung von 500 Zellen pro Guide-RNA zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 g fünf Minuten lang bei 4 Grad Celsius. Dann resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter PBS und überführen es in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie das konische 50-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter PBS und übertragen Sie die Wäsche in dasselbe Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie dann die Proben bei 500 g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und lagern Sie die Zellpellets bei -20 Grad Celsius. Um die Co-Kultur zu starten, fügen Sie CAR-T-Zellen zu CD19-positiven JeKo-1-Zellen im Verhältnis eins zu eins hinzu. Bringen Sie das Gesamtvolumen der Co-Kultur auf 160 Milliliter mit T-Zell-Medium und lagern Sie die Proben in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Um die CAR-T-Zellen wieder zu stimulieren, sammeln Sie die Co-Kulturen in konischen 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Proben bei 300 g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius. Jede Probe wird in 80 Millilitern T-Zell-Medium resuspendiert und 80 mal 10 zur Leistung von sechs JeKo-1-Zellen in 80 Millilitern T-Zell-Medium addiert. Lagern Sie die Proben in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Um die CAR-T-Zellen aus der Co-Kultur zu isolieren, werden am 15. Tag zunächst die Zellen gezählt. Kombinieren Sie ein Positiv-Selektionskit für CD4-positive T-Zellen mit einem Positiv-Selektionskit für CD8-positive T-Zellen, um T-Zellen aus den CAR T JeKo-1-Cokulturen zu isolieren. Zählen Sie dann die isolierten T-Zellen. Um die Proben für die Sequenzierung der nächsten Generation zu konservieren, aliquotieren Sie 33 mal 10 hoch sechs CAR-T-Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Probe bei 300 g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter PBS und geben Sie es in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie dann das konische 50-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter PBS und übertragen Sie die Wäsche auf dasselbe Mikrozentrifugenröhrchen. Nach dem Zentrifugieren der Proben und dem Entfernen des Überstands lagern Sie die Zellpellets bei -20 Grad Celsius. Isolieren Sie zunächst genomische DNA aus gefrorenen CAR-T-Zellpellets mit einem genomischen DNA-Isolierkit. Reinigung der isolierten genomischen DNA durch Ethanolfällung, indem 100 % Ethanol zunächst auf -20 Grad Celsius vorgekühlt werden. Aliquotieren Sie die eluierte DNA gleichmäßig in mehrere Mikrozentrifugenröhrchen, wobei sichergestellt wird, dass jedes Aliquot 200 bis 250 Mikroliter beträgt. Fügen Sie zwei Volumen vorgekühltes 100%iges Ethanol, 0,1 Volumen drei molare Natriumacetate und einen Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Glykogen hinzu. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei -20 Grad Celsius. Am zweiten Tag werden die Proben mit 13.000 g 20 Minuten lang geschleudert, um die ausgefällte DNA zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Pellets mit einem Milliliter 70%igem Ethanol, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 7.500 g schleudern. Nachdem Sie die Pellets vollständig getrocknet haben, resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikrolitern sterilem Wasser. Um die genomische DNA für die Next-Generation-Sequenzierung vorzubereiten, richten Sie eine PCR mit dem hier gezeigten spezifizierten Reaktionsgemisch ein. Führen Sie dann die PCR unter den folgenden Zyklusbedingungen durch. Ziehen Sie die PCR-Reaktionen für jede Probe und reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem PCR-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Geben Sie drei Mikrogramm des PCR-Produkts für jede Probe auf ein 2%iges Agarosegel. Entfernen Sie das PCR-Produkt aus dem Gel, indem Sie die DNA mit einem Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahieren. Lagern Sie die extrahierten Proben bei -20 Grad Celsius.