Multimodale Studie des kardiovaskulären Umbaus von Mäusen: Vierdimensionale Ultraschall- und Massenspektrometrie-Bildgebung

Unser Labor verwendet präklinische Ultraschallbildgebung, um die kardiovaskuläre Biomechanik bei verschiedenen Krankheiten und physiologischen Zuständen zu untersuchen. Wir verwenden auch massenspektrometrische Bildgebung, um die räumliche Verteilung von Lipiden in Herz-Kreislauf- und Hirngewebe zu untersuchen. Wir versuchen zu sehen, wo im Gewebe wir funktionelle und molekulare Veränderungen haben.

Obwohl gängige molekulare Bildgebungsverfahren wie Histologie und Immunhistochemie molekulare Daten liefern können, sind sie durch die derzeit verfügbaren Färbungen und Antikörper begrenzt. Auf der anderen Seite ist die massenspektrometrische Bildgebung ein ungezielter Ansatz für multiomische Studien, bei dem die räumliche Integrität des Gewebes erhalten bleibt. Mit unserer Technik können wir die Multiomik um Lipide, Glykane und Peptide erweitern und diese mit funktionellen bildgebenden Verfahren wie Ultraschall koppeln.

Mit diesen Techniken können Forscher nun die funktionelle Bildgebung mit molekularen Bildgebungsverfahren koppeln. In unserem Labor haben wir zwei Hauptschwerpunkte für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, und einer davon befasst sich mit dem kardialen Umbau mit Herzinfarkten oder Krebsbehandlungen, also der Kardiotoxizität. Und unser zweites großes kardiovaskuläres Ziel ist es, das Altern zu untersuchen und zu untersuchen, wie sich das Altern auf das Gefäßsystem auswirkt.

Um einen vierdimensionalen Herzultraschall durchzuführen, platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf der Speicherfolie. Setzen Sie dann den Wandler in einer halb verriegelten Position in die Halterung ein. Richten Sie den erhabenen Punkt auf dem Wandler an dem blauen Punkt auf dem Bildschirm aus und positionieren Sie ihn auf der rechten Seite der Maus.

Drehen Sie den Wandler so, dass er entlang der Sagittalebene der Maus ausgerichtet ist, wobei die erhabene Kerbe nach kaudal zeigt. Tragen Sie eine großzügige Menge Ultraschallgel auf die ventrale Oberfläche der Brusthöhle auf, um eine akustische Kopplung mit einem Schallkopf zu ermöglichen. Senken Sie den Schallkopf ab, bis er das Ultraschallgel berührt.

Nehmen Sie mit den XY-Knöpfen an der Unterseite der Platte präzise Einstellungen vor, um eine Feinabstimmung vorzunehmen. Stellen Sie als Nächstes sicher, dass die peristernale Längsachse auf dem Bildschirm die Spitze, den linksventrikulären Ausflusstrakt und die Aorta umfasst, die für eine genaue Bildgebung horizontal ausgerichtet sind. Wählen Sie Bild benennen in der unteren Ecke des Bildschirms, um das Bild in der aktuellen Serie zu speichern.

Drehen Sie den Schallkopf um 90 Grad im Uhrzeigersinn, um eine peristernale Kurzachsenansicht zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass der linke Ventrikel auf dem Bild klar definiert ist und die Papillenmuskulatur sichtbar ist. Wählen Sie das Würfelsymbol in der oberen linken Ecke des Bildschirms aus, um ein vierdimensionales Bild einzurichten.

Stellen Sie nach dem Zurücksetzen des Schallkopfes die Startposition auf knapp unter dem Scheitelpunkt und die Stoppposition auf den Aortenbogen ein. Stellen Sie die Schrittweite auf 0,08 bis 0,13 Millimeter und die Bildrate auf 200 bis 300 Hertz ein. Stellen Sie sicher, dass die Vitalparameter und das EKG-Signal stabil bleiben, bevor Sie den Scan starten.

Aktivieren Sie nach Abschluss des Scans und der Verarbeitung die Option EKV/4D-Daten speichern und Respiration Gating für die Nachbearbeitung. Wählen Sie Bild benennen in der unteren rechten Ecke und fügen Sie die Maus-ID in den Namen ein. Um jede Ansichtsebene durch den Herzzyklus zu visualisieren, wählen Sie Weitere Steuerelemente und dann In vier Dimensionen laden aus.

Überprüfen Sie jede Ebenenansicht des Herzens und bestätigen Sie, dass das Zentrum des Herzens während des gesamten Herzzyklus stabil bleibt. Bereiten Sie zunächst Aluminiumfolienschiffchen für das Schockfrosten von Mausgewebe vor. Mit einer Pinzette die Haut der euthanasierten Maus festhalten und mit einer Schere über dem Hals für den Gefäßzugang oder knapp unterhalb des Brustbeins für den Herzzugang durch die Zelthaut schneiden.

Fahren Sie mit dem Durchschneiden der Haut- und Muskelschichten fort, um das Gefäßsystem freizulegen. Für die Herzentfernung schneiden Sie durch den Knochen, um das Herz freizulegen. Isolieren Sie das Herz oder das Gefäßsystem durch stumpfes Sezieren mit Wattestäbchen vom umgebenden Gewebe, einschließlich Fett.

Trennen Sie vorsichtig das Halsschlagadergefäß vom Nerv. Entfernen Sie dann das Herz oder das Gefäßsystem mit chirurgischen Instrumenten. Lege das Halsschlagadergefäß, das Herz und das Gefäßsystem auf ein vorbeschriftetes Alufolienboot.

Legen Sie dann die Bootchen zum Schockfrosten in flüssigen Stickstoff. Füllen Sie zunächst ein Becherglas mit HPLC-Wasser und stellen Sie es zusammen mit Fünf- und Ein-Milliliter-Spritzen beiseite. Stellen Sie dann die Kryostatentemperatur auf minus 25 Grad Celsius ein und setzen Sie die Klinge ein.

Platzieren Sie eine Pinzette in der Kryostatkammer, um sie abzukühlen, bevor Sie das Gewebe montieren. Ziehen Sie fünf Milliliter HPLC-Wasser in eine Spritze und legen Sie sie in den Kryostaten, um das Wasser teilweise einzufrieren. Bevor das Wasser in der Spritze vollständig gefriert, geben Sie es auf das Metallfutter und lassen Sie es vollständig einfrieren.

Füllen Sie nun eine Ein-Milliliter-Spritze mit HPLC-Wasser und legen Sie sie in den Kryostaten. Nach 30 bis 60 Sekunden geben Sie einen kleinen Klecks mit teilweise erstarrtem Wasser auf die Mitte des Spannfutters. Legen Sie das extrahierte Mausherz mit einer Pinzette schnell in das Wassertröpfchen und halten Sie es dort, bis das umgebende Wasser vollständig gefroren ist.

Nehmen Sie zu Beginn den Objektträger mit dem montierten Mausherz aus dem Gefrierschrank und legen Sie ihn zum Trocknen in einen Exsikkator. Schalten Sie das HTX M3+Sprühgerät ein. Öffnen Sie die HTX-App auf dem Laptop und stellen Sie in der Methode die Düsentemperatur auf 75 Grad Celsius, die Durchflussmenge auf 100 Mikroliter pro Minute und den Druck auf 10 psi ein.

Notieren Sie den Namen der Probe, die Polarität, die Matrix, das Lösungsmittel und die Konzentration im Labornotizbuch. Berechnen Sie dann die Matrixmenge, die für die gewünschte Konzentration erforderlich ist. Als nächstes wiegen Sie die gewünschte Menge an 2,5-Dihydroxybenzoesäure für die Positivmodenmatrix.

Löse die Matrix in 70%Methanol in einem 15-Milliliter-Röhrchen auf. Beschallen Sie die Matrixlösung 10 Minuten lang. Entfernen Sie während der Beschallung den Objektträger aus dem Exsikkator.

Öffnen Sie das Sprühfach. Platzieren Sie dann die Folie in der unteren linken Ecke und kleben Sie die Ränder fest. Wählen Sie den Sprühbereich der Probe aus und schließen Sie das Tablett.

Ziehen Sie die Matrizenlösung mit einer Spritze und einem Filter in die Spritze. Filtrieren Sie die Matrizenlösung durch die Spritze in die Durchstechflasche mit dem schwarzen Deckel auf der linken Seite des Sprühgeräts. Setzen Sie das Fläschchen wieder an die dafür vorgesehene Stelle auf dem Sprühgerät ein und führen Sie den D-Leitungsschlauch sicher in das Fläschchen ein.

Schalten Sie als Nächstes das Inertgas ein und vergewissern Sie sich, dass das Messgerät am Sprühgerät 10 psi anzeigt. Drücken Sie Start und sobald das Sprühgerät die eingestellte Temperatur erreicht hat, wählen Sie die blinkende Start-Taste, um mit dem Sprühen zu beginnen. Nachdem das Sprühen abgeschlossen ist, nehmen Sie die Probe aus dem Sprühgerät und legen Sie sie in den MALDI-Objektträgerhalter.

Scannen Sie den MALDI-Objektträgerhalter und die Folie mit einem Scanner. Speichern Sie das Bild auf einem Flash-Laufwerk, um es für die Massenspektrometrie zu verwenden. Wählen Sie die Option Waschen am Sprühgerät und bewegen Sie die D-Linie vom Matrixfläschchen zum Abfallbecher.

Sprühen Sie abschließend Methanol auf die Sprühschale und wischen Sie sie sauber. Schalten Sie den Stickstoff aus. Die massenspektrometrische Bildgebung von infarziertem Myokardgewebe identifizierte die molekulare Ionenmasse bis zur Ladung 577,52, die wahrscheinlich COHb in C oder D entspricht, was auf eine Beteiligung am Myokardumbau hindeutet.

Das vierdimensionale Ultraschallbild zeigte Myokardregionen mit einer Oberflächenbelastung von weniger als 20 %, die als grün-gelbes Gewebe dargestellt wurden und auf Infarktzonen hindeuteten. In der Langachsenansicht des Myokardinfarktgewebes war eine Lipiddelokalisation sichtbar, was die Korrelation zwischen der Biomechanik des Gewebes und der molekularen Zusammensetzung erschwerte.