Name: Etablierung von orthotopen patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen für Hirntumoren mit Hilfe eines stereotaktischen Geräts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Etablierung orthotoper patientenabgeleiteter Xenotransplantatmodelle für pädiatrische Hirntumoren mittels stereotaktischer Geräte. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Tumorverhalten und Therapieansätzen.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Narkosemittel (z.B. Isofluran)</td><td>Merck</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Merck</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Aus 100 % Ethanol wird 70 % Ethanol hergestellt, indem Sie es mit sterilem Wasser verdünnen</td></tr><tr><td>80% Ethanol</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Aus 100 % Ethanol 80 % Ethanol herstellen und mit sterilem Wasser verdünnen</td></tr><tr><td>Selbstklebende Objektträger für Mikroskope</td><td>Merck</td><td>Z681156</td><td></td></tr><tr><td>Analgetikum (Buprenorphin 0,3 mg/ml)</td><td>Jurox</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Aktivkohlefilter-Kanister</td><td>Tierarzt ausrüsten</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Konische Röhrchen 15 mL (Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Konische Röhrchen 50 mL (Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Ohrbügel</td><td>Kopf</td><td>1921</td><td></td></tr><tr><td>ECM-Hydrogel (Matrigel, Corning)</td><td>Merck</td><td>Nr. E1270</td><td></td></tr><tr><td>Augensalbe (Poly Visc)</td><td>ChemistDirect&nbsp;</td><td>719986</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Merck</td><td>Nr. F0926</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Mikrospritze</td><td>Hamilton</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol-Tücher</td><td>Medisa</td><td>SUL_LWMS-1</td><td></td></tr><tr><td>KI67 Antikörper</td><td>Abcam (Englisch)</td><td>AB209897</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugen-Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>Mikrobohrer&nbsp; 0,028"</td><td>Kopf</td><td>8170</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektionseinheit</td><td>Kopf</td><td>5004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck</td><td>Nr. P4474</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 10mL</td><td>Corning</td><td>CLS4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 1 ml&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 200uL</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 20uL</td><td>Eppendorf</td><td>3123000098</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 25 ml</td><td>Corning</td><td>CLS4489</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitze 1 mL</td><td>Corning</td><td>CLS4868</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitze 200uL</td><td>Corning</td><td>CLS4860</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbat 20 Reinigungsmittel (F10SC)</td><td>Gesundheit und Hygiene</td><td>Nr. G3070</td><td></td></tr><tr><td>Pulsoximeter (MouseSTAT)</td><td>Kent Scientific</td><td>SPO2-</td><td></td></tr><tr><td>Riod (Povidon-Jod)</td><td>Merck</td><td>Y0000466</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell (Einweg)</td><td>Medisa</td><td>SUL_SCALPEL</td><td></td></tr><tr><td>Hautkleber Vetbond</td><td>Medisa</td><td>3M_1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktisches Kleintier-Instrument mit digitaler Anzeigekonsole</td><td>Kopf</td><td>940</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Drill&nbsp;</td><td>Kopf</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturüberwachungssystem&nbsp;</td><td>Harvard-Apparatur</td><td>55-7020</td><td></td></tr><tr><td>Trypan-Blau</td><td>Merck</td><td>93595</td><td></td></tr></tbody></table>

etablierung von orthotopen patientenabgeleiteten xenotransplantatmodellen für hirntumoren mit hilfe eines stereotaktischen geräts

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

Orthotope Injektionen mit einem stereotaktischen Gerät sind für die Entwicklung von Hirntumormodellen unerlässlich geworden. Diese Technik ermöglicht die präzise und reproduzierbare Platzierung von Tumorzellen, was für die Generierung konsistenter und zuverlässiger Daten in der neuroonkologischen Forschung von entscheidender Bedeutung ist. Die erfolgreiche Durchführung orthotoper Injektionen hängt stark von der genauen Einrichtung der stereotaktischen Ausrüstung ab, die in der Regel einen stereotaktischen Rahmen, einen digitalen Mikromanipulator für präzise Bewegungen, eine Injektionsspritze und ein Anästhesiesystem zur Immobilisierung des Tieres umfasst (Abbildung 1A,B). Die Verwendung einer Glasmikrospritze ermöglicht die intrakranielle Injektion kleiner Volumina, typischerweise zwischen 2 und 5 μl. Die richtige Wartung und häufiges Waschen sind unerlässlich, um die Ansammlung von biologischem Material zu verhindern, das die Injektion blockieren kann (Abbildung 1C).
Das Verfahren zur intrakraniellen Injektion von Hirntumorzellen mit stereotaktischen Geräten bei Mäusen umfasst mehrere wichtige Schritte. Zunächst wird die Maus betäubt, um während des gesamten Eingriffs ruhig und komfortabel zu bleiben. Typische Hinweise, die darauf hindeuten, dass das Tier betäubt ist, sind das Fehlen von Bewegungen und Reflexen beim Einklemmen der Zehen sowie das Vorhandensein eines regelmäßigen Atemmusters. Dann wird die Maus in einen stereotaktischen Rahmen gesetzt, wobei ihr Kopf in einer festen Position fixiert wird (Abbildung 2A). Anhand von Landmarken auf dem Schädel, wie Bregma und Lambda, werden genaue Koordinaten für die Injektion bestimmt. Es wird ein kleiner Schnitt in die Kopfhaut gemacht und an den gewählten Koordinaten ein Bohrloch durch den Schädel gebohrt (Abbildung 2B). Eine Mikroinjektionsnadel, die am stereotaktischen Arm befestigt ist, wird durch das Bohrloch eingeführt, um die Tumorzellen in die gewünschte Hirnregion (Rinde, Kleinhirn oder Hirnstamm; Abbildung 2C). Eine sorgfältige Überwachung und Einstellung der Nadelposition sorgt für eine genaue Zielgenauigkeit. Nach der Injektion wird die Nadel langsam zurückgezogen und der Schnitt verschlossen (Abbildung 2D). Es wird erwartet, dass die versiegelte Wunde innerhalb von zwei Wochen nach der intrakraniellen Injektion heilt.
Nach der intrakraniellen Injektion müssen die Tiere sorgfältig auf das allgemeine Wohlbefinden und die Entwicklung neurologischer Symptome überwacht werden, die häufig auf eine Tumorprogression hinweisen (Ergänzende Tabelle 1). In der Regel kann es bei den Tieren in der 1. Woche nach der Injektion zu einem leichten Gewichtsverlust kommen (bis zu 10 % ihres höchsten Gewichts), der sich in der Regel stabilisiert, sobald die Injektionsstellen am Ende der 2. Woche vollständig verschlossen sind. Im Allgemeinen weisen die Tiere eine stetige Gewichtszunahme auf und behalten eine gute allgemeine Gesundheit bei, bis es zum Fortschreiten des Tumors kommt. Die Manifestation neurologischer Symptome variiert in Abhängigkeit von Faktoren wie der Art des Hirntumors, der Injektionsstelle und dem Tierstamm. Zum Beispiel können kortikale Gliome oder Ependymome mit fortschreitendem Gewichtsverlust und einer möglichen Vergrößerung des Vorderhirns einhergehen, während Hirnstammgliome und Medulloblastome Symptome wie Ataxie und Kopfneigung aufweisen können, insbesondere bei immungeschwächten Tieren (Abbildung 3A). Darüber hinaus kann kreisendes Verhalten bei Tieren mit Hirnstammtumoren beobachtet werden, insbesondere bei NSG- oder NOD/SCID-Stämmen. Das Fortschreiten der neurologischen Symptome geht oft mit einem allmählichen Gewichtsverlust einher. Die richtige Nachsorge, wie das Bereitstellen von Wasserflaschen mit langen Düsen oder das Anbieten von weichem Futter (matschige Futterpellets) oder Samen, sind essentiell, um das Wohlbefinden der Tiere zu unterstützen. Nach Erreichen des experimentellen Endpunkts und der anschließenden humanen Euthanasie der Tiere können mögliche Veränderungen im Gehirn sichtbar werden, einschließlich einer Vergrößerung an der Injektionsstelle und/oder des Vorhandenseins hämorrhagischer Bereiche (Abbildung 3B).
Kaplan-Meier-Diagramme werden häufig verwendet, um die Überlebensergebnisse von Hirntumor-Tiermodellen darzustellen. Sie bieten eine visuelle Darstellung der Überlebenswahrscheinlichkeit im Laufe der Zeit nach intrakranieller Injektion oder Krebsbehandlungen. Diese Diagramme dienen als wichtige Werkzeuge für die Analyse und Darstellung von Überlebensdaten in präklinischen Forschungsumgebungen15,27. Wir führten intrakranielle Injektionen von Medulloblastom-Zellkultur D425 bei unterschiedlichen Zelldichten im Kleinhirn durch. Alle Tiere, die intrakraniell injiziert wurden, entwickelten Tumore. Unsere Ergebnisse zeigten, dass höhere Zelldichten, insbesondere 50.000 und 100.000 Zellen pro Maus, schneller transplantierten als 10.000 Zellen pro Maus (Abbildung 4). Darüber hinaus injizierten wir intrakraniell patienteneigene hochgradige Gliomzellen (HGG) in die Hirnrinde und den Hirnstamm, um das Gesamtüberleben und das Muster des Tumorwachstums sowie immunhistochemische Merkmale an diesen verschiedenen Stellen zu vergleichen. Unabhängig von der Lokalisation wurden allen Tieren intrakraniell entwickelte Tumore injiziert. Die Kultivierung der HGG-Zellen erfolgte nach dem in den Schritten 1.1 bis 1.10 beschriebenen Protokoll. Die Vorbereitung der Zellen für die intrakranielle Injektion wurde wie in den Schritten 2.1 bis 2.6 beschrieben durchgeführt, während das intrakranielle Injektionsverfahren der in den Schritten 4.1 bis 4.16 beschriebenen Methode folgte27. Bei der Injektion in den Kortex zeigten HGG-Zellen ein medianes Überleben von etwa 25 Tagen nach der intrakraniellen Injektion (Abbildung 5A). Die Tiere wurden wie in den Schritten 5.1 bis 5.4 beschrieben überwacht. Diese Tiere zeigten keine neurologischen Symptome, zeigten aber einen fortschreitenden Gewichtsverlust. Die Tiere wurden auf humane Weise eingeschläfert, wenn sie den in Schritt 5.5 beschriebenen humanen Endpunkt erreicht hatten. Die Gehirne wurden gemäß dem in den Schritten 6.1 bis 6.5 beschriebenen Protokoll entnommen und zur weiteren Analyse geschickt27. Die immunhistochemische Analyse ergab eine große, stark kernhaltige Tumormasse mit Anzeichen einer erhöhten Vaskularisation (Abbildung 5B) und viele proliferative Ki67-Zellen (Abbildung 5C). Bei der Injektion in den Hirnstamm zeigten HGG-Zellen ein medianes Überleben von etwa 26 Tagen nach der intrakraniellen Injektion (Abbildung 5D). Die immunhistochemische Analyse zeigte eine große Tumormasse in der Region des 4. Ventrikels/oberen Pons sowie eine leptomeningeale Infiltration in den lateralen Ventrikel (Abbildung 5E). Weitere immunhistochemische Analysen zeigten viele proliferative Zellen im Hirnstamm und anderen infiltrierten Bereichen (Abbildung 5F). Dieses Experiment zeigt, dass die Injektion derselben Tumorzellen an verschiedenen anatomischen Stellen die Tumorwachstumsrate nicht beeinflusst, obwohl einige Unterschiede im Wachstumsmuster beobachtet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Repräsentative Bilder des stereotaktischen Aufbaus für die intrakranielle Injektion von Hirntumorzellen. (A) Der Anästhesieapparat wird typischerweise neben der BSC-Haube positioniert, was eine doppelte Verabreichung der Anästhesie sowohl an die Induktionskammer als auch an den stereotaktischen Apparat erfordert. (B) Waschstation für Mikrospritzen aus Glas und stereotaktischer Halter; Die Spritze muss nach jeder intrakraniellen Injektion mit Kochsalzlösung, Ethanol und anschließend Wasser gespült werden. (C) Stereotaktischer Aufbau in der BSC-Haube, der die Anästhesiekammer, die Bohrmaschine, das stereotaktische Gerät, die stereotaktische Koordinatenkonsole, die Wattespitzen, das Skalpell, die Pinzette, die Pipette und die Spitzen darstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Repräsentative Bilder einer intrakraniellen Injektion, die an einer immungeschwächten Maus durchgeführt wird. (A) Anästhesiertes Tier, das in einem Anästhesiekegel positioniert ist. (B) Hautschnitt, gefolgt von der Fixierung der Haut auf jeder Seite mit Ohrstangen. (C) Glasmikrospritze, die zur Injektion auf dem Bohrloch positioniert ist. (D) Die Haut bildet nach dem Kleben einen Irokesenschnitt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Mögliche neurologische Symptome, die nach der Transplantation von Hirntumorzellen beobachtet wurden. (A) Tier mit Kopfneigung nach intrakranieller Injektion von DMG-Zellen in den Hirnstamm. (B) Vergrößerung der rechten kortikalen Hemisphäre mit der Injektionsseite, die die Tumorbildung erkennen lässt. Dem Tier wurden Ependymomzellen injiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Transplantation der Medulloblastom-Kultur D425 bei unterschiedlichen Zelldichten. Medulloblastomzellen wurden intrakraniell mit stereotaktischen Geräten in Dichten von 10.000 Zellen in 2 μl EZM-Hydrogel, 50.000 Zellen und 100.000 Zellen injiziert. Die Tiere wurden auf fortschreitenden Gewichtsverlust überwacht und auf humane Weise eingeschläfert, sobald sie 20 % unter ihrem höchsten aufgezeichneten Gewicht lagen. Das mediane Überleben von Tieren, denen 10.000 Zellen injiziert wurden, betrug 29 Tage, während das mediane Überleben von Tieren, denen eine höhere Zelldichte von 50.000 bzw. 100.000 Zellen injiziert wurde, 17,5 Tage bzw. 15 Tage betrug. Alle Tiere, die in dieser Studie injiziert wurden, entwickelten erfolgreich Tumore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig5v2.jpg"> 
Abbildung 5: Repräsentative Überlebenskurven und histologische Analyse von NSG-Tieren, denen intrakraniell HGG-Zellen in die Hirnrinde und den Hirnstamm injiziert wurden. Etwa 100.000 HGG-Zellen (Passage 3) wurden mit stereotaktischen Geräten in 2 μl EZM-Hydrogel injiziert. Die Tiere wurden auf fortschreitenden Gewichtsverlust überwacht und auf humane Weise eingeschläfert, sobald sie 20 % unter ihrem höchsten aufgezeichneten Gewicht lagen. Bei diesem Hirntumor-Subtyp wurden keine neurologischen Symptome beobachtet. (A) Das mediane Überleben von Tieren, denen HGG-Zellen in die Hirnrinde injiziert wurden, beträgt etwa 25 Tage nach der Injektion (N=2). (B) Die H&amp;E-Färbung der Hirnrinde zeigt eine stark kernhaltige Region mit erhöhter Vaskularisierung, was durch das Vorhandensein roter Blutkörperchen angezeigt wird. (C) Der tumortransplantierte Bereich in der Hirnrinde weist einen hohen Anteil an proliferativen Zellen auf, wie die KI67-Färbung zeigt. (D) Das mediane Überleben von Tieren, denen HGG-Zellen in den Hirnstamm injiziert wurden, beträgt etwa 26 Tage nach der Injektion (N=2). Alle Tiere, die in dieser Studie injiziert wurden, entwickelten erfolgreich Tumore. Die (E) H&amp;E-Färbung des Hirnstamms zeigt eine stark kernhaltige Region mit Tumorinfiltration, die in den Leptomeningen im lateralen Ventrikel beobachtet wurde. (F) Der tumortransplantierte Bereich im Hirnstamm weist einen hohen Anteil an proliferativen Zellen auf, wie die KI67-Färbung zeigt. Der schwarze Maßstabsbalken in den Hauptbildern zeigt 2 mm an, während die vergrößert eingefügten Bilder 20 μm anzeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Überwachungsformular für die Inspektion der postintrakraniellen Injektionen von Tieren und die mögliche Behandlung mit Krebsmitteln. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Etablierung von orthotopen patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen für Hirntumoren mit Hilfe eines stereotaktischen Geräts

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of ...

establishment-orthotopic-patient-derived-xenograft-models-for-brain

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Luciferase-modifizierten menschlichen Gehirns Tumorxenotransplantaten können intrakraniell in athymischen Mäusen festgestellt werden, mit anschließender Überwachung des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung. In Kombination mit dem Überleben Analyse wird Biolumineszenz Überwachung ein wesentliches Recherche-Tool für die präklinische Prüfung von Therapien, zur Behandlung von Gehirntumoren betrachtet.

Gründung Intrakranielle Brain Tumor Xenografts mit anschließender Analyse des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung

Der Zweck dieses Artikels ist es, die Verwendung einer orthotopen Glioblastom-Modell für die Radiochemotherapie Studien beschreiben. Dieser Artikel wird jedoch Zellprozessierung gehen, Implantieren, Strahlentherapie und der Maus mit Hilfe eines intrakraniellen Modell.

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Wir beschreiben eine integrierte Methode für die präzise, ​​stereotaktische Implantation von humanen Glioblastom multiforme Zellen in den Gehirnen von Nacktmäusen und anschließende...

Stereotaktische Intrakranielle Implantation und<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging der Tumorxenotransplantaten in einem Maus-Modell-System des Glioblastoma multiforme

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Etablierung von orthotopen patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen für Hirntumoren mit Hilfe eines stereotaktischen Geräts (Video) | JoVE Journal

Etablierung von orthotopen patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen für Hirntumoren mit Hilfe eines stereotaktischen Geräts

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