Etablierung von orthotopen patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen für Hirntumoren mit Hilfe eines stereotaktischen Geräts

In meiner Forschung konzentrieren wir uns auf die Entwicklung neuer Therapien für aggressive Hirntumore im Kindesalter wie diffuse Mittelliniengliome, hochgradige Gliome, Ependymome und Ameloblastome. Unser Ziel ist es, neue Angriffspunkte für Medikamente zu finden und Therapien zu entwickeln, die bei Patienten einen Unterschied machen können, während wir gleichzeitig untersuchen, wie sich diese Tumoren auf die umgebende Gehirnumgebung auswirken können. In der pädiatrischen Hirntumorforschung haben wir patienteneigene Xenotransplantatmodelle unter Verwendung von intrakraniellen Injektionen, fortschrittlicher Bildgebung und Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening entwickelt.

Techniken wie Einzelzell- und spezielle Transkriptomik helfen uns zu verstehen, wie sich der Tumor auf die Gehirnumgebung und die Behandlungseffekte auswirkt, und ermöglichen es uns, neue Therapien zu erforschen. Unsere Hirntumorgruppe am Children's Cancer Institute hat im Rahmen des Zero Childhood Cancer Personalized Medicine Program viele pädiatrische Hirntumor-Modelle entwickelt. Wir fanden heraus, dass diffuse Mittelliniengliome aufgrund einer intakten Blut-Hirn-Schranke resistent gegen medikamentöse Behandlungen sind.

Vielversprechende Therapien, die auf den epigenetischen und onkogenen Signalweg abzielen, verbesserten das Überleben von Kindern und befinden sich derzeit in der klinischen Entwicklung. Anhand orthotoper Hirntumormodelle möchten wir verstehen, wie Tumore das Hirngefäßsystem beeinflussen. Durch die Anwendung von Techniken wie der speziellen Transkriptomik möchten wir Signalwege identifizieren, die von Hirntumoren beeinflusst werden.

Dieses Wissen wird uns helfen, Modulatoren der Blut-Hirn-Schranke zu identifizieren, die die Barriere lockern können, so dass medikamentöse Behandlungen effektiver eindringen können. Tauen Sie zunächst kultivierte Neurosphären-bildende Hirntumorzellen auf. In einer Biosicherheitswerkbank werden die kultivierten Zellen und das Kulturmedium vorsichtig aus dem Gewebekulturkolben in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit einer serologischen Pipette pipettiert.

Das konische Röhrchen wird bei 300 g bis zu fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Mit einer 25-Milliliter-Pipette wird das Medium über dem Pellet abgesaugt, wobei etwa 0,5 Milliliter im Röhrchen verbleiben. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig 10 Mal mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf und ab, um das Zellpellet zu dissoziieren.

Geben Sie Trypanblau in die Zellsuspension und zählen Sie mit einem Hämozytometer. Aliquote Zellsuspension, die zwei Millionen Zellen enthält, in ein frisches Röhrchen. Fügen Sie der Zellsuspension 0,5 Milliliter PBS hinzu.

Dann bei 300 g fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn erneut. Nach der letzten Wäsche so viel PBS wie möglich aspirieren.

Legen Sie dann das Zellpellet und 50 Mikroliter extrazelluläres Matrix-Hydrogel auf Eis. Mischen Sie das Zellpellet umgehend mit dem Hydrogel der extrazellulären Matrix, um die intrakranielle Injektion vorzubereiten. Montieren Sie zunächst eine betäubte Maus auf ein stereotaktisches Gerät.

Stellen Sie sicher, dass die Frontzähne im Schneidezahn fixiert sind und der Nasenkonus das Tier an Ort und Stelle hält. Desinfizieren Sie den Kopf der Maus mit einer jodgetränkten Wattestäbchen, gefolgt von einem Isopropanol-Tuch. Tragen Sie dann Hornhaut-Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.

Machen Sie einen Schnitt an der Basis des Kleinhirns und verlängern Sie ihn über den Schädel bis zur Mitte, um einen einen Zentimeter langen Schnitt entlang der oberen Seite des Schädels zu erzeugen. Straffen Sie die Haut zwischen den Ohren, um den Schädel freizulegen, und ziehen Sie dann die Ohrstangen fest, um den Kopf zu sichern. Reinige die Schädeloberfläche und trockne sie gründlich mit einem Wattestäbchen ab.

Befestigen Sie den Bohrer auf dem stereotaktischen Rahmen und lokalisieren Sie die Bregma- oder Lambdoidstruktur mit dem Bohrer. Sobald die Koordinaten festgelegt sind, bohren Sie vorsichtig ein kleines Bohrloch in den Knochen an der dafür vorgesehenen Stelle. Resuspendieren Sie die vorbereitete Zellsuspension zur Hirntumorinjektion mehrmals mit einer Pipette, um sicherzustellen, dass Luftblasen vermieden werden.

Ziehen Sie zwei Mikroliter des Zellgemisches in eine vorgewaschene Mikrospritze aus kaltem Glas und befestigen Sie die Spritze am stereotaktischen Rahmen. Passen Sie die Nadel an die Schädelspitze an, um die Injektion vorzubereiten. Injizieren Sie die Zellen innerhalb von 30 Sekunden in den gebohrten Bereich.

Wischen Sie während der Injektion alle zurückgefluxten Zellsuspensionen mit einem Isopropanol-Tuch ab. Lassen Sie die Spritze eine Minute lang an Ort und Stelle, um einen Rückfluss zu verhindern und das Hydrogel der extrazellulären Matrix absetzen zu lassen. Entfernen Sie dann die Spritze und reinigen Sie die Wunde mit einem Isopropanol-Tuch.

Versiegeln Sie den Schnitt bei Bedarf mit Hautkleber oder Wundklammern. Platzieren Sie die Maus in einer liegenden Position in einem sauberen Erholungskäfig mit einer Wärmelampe oder einem Heizkissen, um die Wärme zu erhalten. Überwachen Sie das Tier kontinuierlich, bis es sich selbstständig und normal zu bewegen beginnt.

Überwachen Sie die Mäuse nach der intrakraniellen Injektion an fünf Tagen pro Woche, um ihr allgemeines Wohlbefinden zu beurteilen. Notieren Sie Parameter wie Gewichtsverlust, Aktivitätsniveau, Körperhaltung, Anzeichen von Dehydrierung und Fellzustand auf einem dafür vorgesehenen Überwachungsblatt. Die Tiere zeigten je nach Tumortyp und Injektionsstelle unterschiedliche Symptome, wie z. B. Kopfneigung bei Hirnstammtumoren und Vorderhirnvergrößerung bei kortikalen Gliomen oder Ependymomen.

Intrakranielle Injektionen von Medulloblastom-D425-Zellen in unterschiedlichen Dichten zeigten eine direkte Korrelation zwischen der Zelldichte und der Transplantationsgeschwindigkeit des Tumors mit 100.000 Zellen, was zu einem kürzesten medianen Überleben von 15 Tagen führte. Hochgradige Gliomzellen, die in den Kortex injiziert wurden, führten zu einem medianen Überleben von etwa 25,5 Tagen, wobei die immunhistochemische Analyse eine große, stark kernhaltige Tumormasse und eine erhöhte Vaskularisation sowie reichlich Ki-67-positive proliferative Zellen ergab. Hirnstamminjektionen von hochgradigen Gliomzellen führten zu einem medianen Überleben von etwa 26 Tagen, wobei immunhistochemische Analysen auf eine Tumormasse im oberen Pons und eine leptomeningeale Infiltration sowie auf proliferative Ki-67-positive Zellen in infiltrierten Bereichen hindeuteten.