Name: Konfokalmikroskopische Analyse der Proteinsortierung zu Plasmodesmata bei Nicotiana benthamiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Lernen Sie die konfokalmikroskopische Analyse der Proteinsortierung zu Plasmodesmata bei Nicotiana benthamiana. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Proteinen wie PDLP5 und TVCV MP.

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<meta charset="utf8"></head><body>Erforschung der Funktion von Plasmodesmen: Konfokale Mikroskopie von Zielproteinen

<ol><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-localized+protein+mediates+crosstalk+between+cell-to-cell+communication+and+innate+immunity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).</li>
<li>Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+gateways+to+local+and+systemic+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).</li>
<li>Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Channels+under+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Channels under pressure.</a> Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).</li>
<li>Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Structure%2C+function+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).</li>
<li>Fernandez-Calvino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasmodesmal+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasmodesmal proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18880(2011).</li>
<li>Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+meta-proteomic+pipeline+for+the+identification+of+plasmodesmata+proteins+and+regulatory+conditions+in+diverse+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species.</a> BMC Biol. 20, 128(2022).</li>
<li>Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-associated+%CE%B2-1%2C3-glucanase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis.</a> The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).</li>
<li>Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+rice+membrane+dynamics+and+plasmodesmata+during+biotrophic+invasion+by+the+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus.</a> The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).</li>
<li>Aung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+target+plant+plasmodesmata+to+colonize+and+invade+surrounding+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues.</a> The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).</li>
<li>Cui, W., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+callose+synthases+CalS1%2F8+regulate+plasmodesmal+permeability+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress.</a> Nat Plants. 2 (5), 160(2016).</li>
<li>Liu, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytosphinganine+affects+plasmodesmata+permeability+via+facilitating+PDLP5-stimulated+callose+accumulation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis.</a> Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).</li>
<li>Caillaud, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+protein+PDLP1+localizes+to+haustoria-associated+membranes+during+downy+mildew+infection+and+regulates+callose+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition.</a> PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).</li>
<li>Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Z+%22The+Plant+Cell%22">The Plant Cell</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+X+%22Sci+Bull%22">Sci Bull</a>. , (2024).</li>
<li>Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+GPI-anchor+plasmodesmal+neck+protein+with+callose+binding+activity+and+potential+to+regulate+cell-to-cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking.</a> The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).</li>
<li>Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+targeting+of+a+plasmodesmal+protein+affecting+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication.</a> PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).</li>
<li>Lim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+localizing+proteins+regulate+transport+and+signaling+during+systemic+acquired+immunity+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).</li>
<li>Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+several+Nicotiana+species+as+hosts+for+high-scale+Agrobacterium-mediated+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression.</a> Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).</li>
<li>Walhout, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+recombinational+cloning%3A+Application+to+the+cloning+of+large+numbers+of+open+reading+frames+or+ORFeomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes.</a> Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsRNA-induced+immunity+targets+plasmodesmata+and+is+suppressed+by+viral+movement+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins.</a> The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).</li>
<li>Roberts, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+frequency+and+architecture+of+plasmodesmata+during+the+sink-source+transition+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves.</a> Protoplasma. 218, 31-44 (2001).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+localization+signal+of+TMV+MP+is+recognized+by+plant+synaptotagmin+SYTA%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA.</a> mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).</li>
<li>Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+prevents+the+development+of+cold+and+mechanical+allodynia+in+paclitaxel-treated+female+C57Bl6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice.</a> Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).</li>
<li>Erkkilä, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widefield+fluorescence+lifetime+imaging+of+protoporphyrin+IX+for+fluorescence-guided+neurosurgery%3A+An+ex+vivo+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study.</a> J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).</li>
<li>Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobamovirus+Turnip+vein+clearing+virus+30-kilodalton+movement+protein+localizes+to+novel+nuclear+filaments+to+enhance+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection.</a> J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+plasmodesmal+localization+signal+in+a+plant+viral+cell-to-cell-movement+protein%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein.</a> mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).</li>
<li>Kumar, G., Dasgupta, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability%2C+functions+and+interactions+of+plant+virus+movement+proteins%3A+what+do+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far.</a> Microorganisms. 9 (4), 695(2021).</li>
<li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+nondestructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses.</a> Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ABT AC 1-Phasen-Motor</td><td>BRANDTECH</td><td>&nbsp; ABF63/4C-7RQ</td><td></td></tr><<tr><td>em>Agrobacterium tumefaciens EHA105</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontaminationskontrolle&nbsp;</td><td>CCI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Enzymmischung</td><td>Invitrogen</td><td>#11789020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzymmischung</td><td>Invitrogen</td><td>#11791020</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.1.</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bild J</td><td>National Institutes of Health und das Labor für optische und computergestützte Instrumentierung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laserscanning-Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 900</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Pflanzenart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Invitrogen</td><td>#12213013</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>NEB</td><td>#M0491S</td><td></td></tr></tbody></table>

konfokalmikroskopische analyse der proteinsortierung zu plasmodesmata bei nicotiana benthamiana

Confocal Microscopy Analysis of Protein Sorting to Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Um die Untersuchung der Funktion von Parkinson in der Pflanzenphysiologie und der Wechselwirkungen mit Krankheitserregern zu erleichtern, wurden drei einfache und zuverlässige Referenzproteine für die Parkinson-Lokalisierung entwickelt. Es wurden zwei zelluläre PD-Proteine und ein von Krankheitserregern abgeleitetes MP-Protein ausgewählt, das vom pflanzlichen Tobamovirus TVCV kodiert wird. Die subzelluläre Lokalisation dieser Proteine wurde mit Hilfe eines autofluoreszierenden Reporters EGFP visualisiert, der mit dem C-Terminus jedes Proteins fusioniert war. In einem alternativen Ansatz wurden die PD durch Anilinblau-Färbung der PD-assoziierten Callose-Ablagerungen sichtbar gemacht. Die Experimente zeigten, dass sowohl PDLP5 als auch MP eine punktuelle PD-Lokalisation aufwiesen, wobei MP auch im Zellkern lokalisiert war (Abbildung 1A), wie bereits erwähnt25. Im Gegensatz dazu schien sich PDCB1 zwischen PD und ER aufzuteilen (Abbildung 1A). Für Forscher, die weniger Erfahrung in der Interpretation der subzellulären Lokalisation von GFP-markierten Proteinen haben, veranschaulicht Abbildung 1A auch das charakteristische nukleozytoplasmatische Muster von EGFP, das in Pflanzenzellen exprimiert wird. Um das ER-Signal von PDCB1 zu bestätigen, exprimierten wir PDCB1 mit einem ER-Marker und fanden heraus, dass das PDCB1-Signal das Signal des ER-Markers überlappte (Abbildung 1B). Um die Effizienz der Parkinson-Lokalisation der getesteten Proteine zu bewerten, wurde der Prozentsatz der Zellen, die das Fluoreszenzsignal exprimieren und eine Parkinson-Lokalisation dieses Signals aufwiesen, berechnet (Tabelle 1).
Für die Identifizierung der subzellulären Lokalisation durch die Verwendung von Referenzproteinen ist es nützlich, die Zeitskala der Expression des Referenzproteins und mögliche Änderungen seiner Lokalisation zu verstehen. Abbildung 2 zeigt solche Kinetiken für MP, PDLP5 und PDCB1, wenn die PD selbst durch Anilinblau-Färbung sichtbar gemacht wurde. Sowohl MP als auch PDLP5 begannen sich bereits einen Tag nach der Infiltration (dpi) bei PD zu akkumulieren, und diese Akkumulation erreichte ein scheinbares Maximum bei 2 dpi und blieb für weitere 5 Tage stabil, danach nahm die Signalintensität ab, höchstwahrscheinlich aufgrund des Proteinabbaus. Der zeitliche Verlauf der subzellulären Sortierung von PDCB1 war komplexer: Für die ersten 3 dpi zeigte PDCB1 ein vergleichbar starkes ER-Signal, das die PD-spezifische Signallokalisation fast vollständig verdeckte, während bei 5 dpi dieses letztere Signal stärker ausgeprägt war (Abbildung 2), wenn auch in weniger Zellen. Interessanterweise fiel das Auftreten des klaren PD-Lokalisationsmusters von PDCB1 nach 5 dpi mit wesentlich weniger Zellen zusammen, die das EGFP-Signal zeigten (Ergänzende Abbildung 1). Somit können PDLP5 und MP als PD-Referenzproteine mit wenig Hintergrund in den meisten anderen zellulären Kompartimenten fungieren, mit einem optimalen Visualisierungszeitfenster von 2-5 dpi. PDCB1 hingegen ist nicht so gut geeignet wie ein PD-Marker.
Anschließend konnte nachgewiesen werden, dass die PD-Marker ihre subzelluläre Lokalisierungsspezifität in Gegenwart anderer PD-Proteine beibehalten. Zu diesem Zweck wurde MP-EGFP oder PDLP5-EGFP mit einem PD-lokalisierenden26 MP eines anderen Pflanzenvirus, dem Tabakmosaikvirus (TMV), koexprimiert, das mit CFP markiert ist. Abbildung 3 zeigt, dass die co-exprimierten Proteine in beiden Fällen ein klares PD-Lokalisationsmuster aufwiesen. In ähnlicher Weise zeigte die PD-spezifische histologische Anilinblau-Färbung des MP-EGFP- oder PDLP5-EGFP-exprimierenden Gewebes keine Interferenz mit der PD-Lokalisation der EGFP- und Anilinblau-Signale (Abbildung 3).
Parkinson-Lokalisationsstudien profitieren oft von einer quantitativeren Abschätzung der Gesamtexpression und des Parkinson-Signals des Referenzproteins. Dieser Quantifizierungsansatz ist in Abbildung 4 und Abbildung 5 dargestellt. Zur Quantifizierung der allgemeinen Expression wurde die Signalintensität von PDLP5 und MP gemessen. Beide Proteine zeigten während des 10-dpi-Zeitraums zu allen Visualisierungszeitpunkten starke Signale, mit maximaler Signalintensität bei 3 dpi für PDLP5 und bei 2 dpi für MP (Abbildung 4). Es gab zu keinem der Visualisierungszeitpunkte statistisch signifikante Unterschiede in der Signalintensität zwischen PDLP5 und MP. Die Intensität des PDCB1-Signals wies eine größere Fluktuation zwischen den Zeitpunkten auf, wobei das stärkste Signal bei 7 dpi beobachtet wurde (Abbildung 4), obwohl es zu diesem Zeitpunkt aufgrund des Mangels an exprimierenden Zellen schwierig war, statistisch signifikante Daten zu sammeln. Somit stellen die ersten 3 dpi das optimale Timing für den Nachweis der PDCB1-Expression dar. Wie erwartet zeigten Anilinblau-Färbeproben ein stabileres Signal als die transient exprimierten Proteine (Abbildung 4).
Die aus PDLP5 und MP gebildeten PD-Punkte wurden dann quantifiziert. PDLP5 zeigte eine stabile Anzahl von PD-Puncta während des gesamten Beobachtungszeitraums, ohne statistisch signifikante Unterschiede zwischen zwei der getesteten Zeitpunkte (Abbildung 5). Die höchste Anzahl von PD-Punkten, die von MP gebildet wurden, wurde bei 2 dpi nachgewiesen und blieb bis zum Ende des Beobachtungszeitraums relativ stabil. Der Vergleich der Anzahl der PD puncta zwischen PDLP5 und MP ergab bei den meisten Probenahmezeitpunkten keine statistisch signifikanten Unterschiede (Abbildung 5). Die Anzahl der mit Anilinblau gefärbten PD-Puncta blieb ebenfalls stabil, wenn auch leicht abnehmend bei 10 dpi. Die Anzahl der mit Anilinblau, PDLP5 oder MP dekorierten PD-Puncta war mit statistischer Signifikanz ähnlich (Abbildung 5), was mit der PD-Spezifität dieser Marker übereinstimmt. Die Anzahl der PD-Punkte für PDCB1 wurde nicht analysiert, da das PD-Signal zu früheren Zeitpunkten durch das ER-Signal verdeckt wurde und zu späteren Zeitpunkten nur in relativ wenigen Zellen beobachtet wurde (siehe Abbildung 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig01.jpg"> Abbildung 1: Plasmodesmata (PD)-Lokalisation von TVCV MP, PDLP5 und PDCB1 transient exprimiert in Nicotiana benthamiana und Anilinblau-Färbung von PD. (A) PD-Lokalisation von MP-EGFP, PDLP5-EGFP und PDCB1-EGFP sowie Anilin-Färbung. Das EGFP-Signal ist grün, das Anilinblau-Signal ist blau und die Plastiden-Autofluoreszenz ist rot. (B) Koexpression von MP-EGFP, PDLP5-EGFP und PDCB1-EGFP mit dem Marker für das endoplasmatische Retikulum (ER), der mit mRFP markiert ist. Die Bilder wurden 2 Tage nach der Infiltration (dpi) aufgenommen und sind einzelne konfokale Schnitte, die repräsentativ für zwei unabhängige Experimente sind (N = 20 Bilder von 2 Pflanzen). Das EGFP-Signal ist grün, das mRFP-Signal ist violett und die Plastiden-Autofluoreszenz ist rot. Gelbe Pfeile zeigen PDCB1 an, das an der Notaufnahme lokalisiert ist. Maßstabsbalken = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig02.jpg"> Abbildung 2: Zeitverlauf der PD-Lokalisation von TVCV MP, PDLP5 und PDCB1 transient exprimiert in Nicotiana benthamiana und der Anilinblau-Färbung von PD. Die Bilder wurden bei 2 dpi aufgenommen und sind einzelne konfokale Schnitte, die repräsentativ für zwei unabhängige Experimente sind (N = 20 Bilder von 2 Pflanzen für alle Systeme, außer 7 dpi und 10 dpi für PDCB1-EGFP, in denen weniger Zellen das Signal zeigten). Das EGFP-Signal ist grün und das Anilinblau-Signal blau. Maßstabsbalken = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig03.jpg"> Abbildung 3: TVCV MP und PDLP5 behalten ihre PD-Lokalisation nach der Co-Expression mit einem PD-lokalisierenden TMV MP und der Cofärbung mit Anilinblau bei. Die Bilder wurden bei 2 dpi aufgenommen und sind einzelne konfokale Schnitte, die für N ≥ 10 Bilder von 4-6 Pflanzen repräsentativ sind. Das EGFP-Signal ist grün, das CFP-Signal und das Anilinblau-Signal sind blau und die Plastiden-Autofluoreszenz ist rot. Maßstabsbalken = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig04.jpg"> Abbildung 4: Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität von TVCV MP, PDLP5 und PDCB1 transient exprimiert in der PD-Färbung von Nicotiana benthamiana und Anilinblau. Quantitative Daten wurden aus den in Abbildung 2 beschriebenen Experimenten gesammelt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts aus mehreren Experimenten dar. Die einzelnen Datenpunkte werden als Mittelwert für jede Messung angegeben. Die Unterschiede zwischen den Mittelwerten, die durch die bidirektionale ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest nach Tukey ermittelt werden, sind für die P-Werte statistisch signifikant. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01 und ***P &lt; 0,001, ****P &lt; 0,0001; ns, nicht statistisch signifikant. Blaue Balken, Anilinfärbung; hellgrüne Balken, MP-EGFP, dunkelgrüne Balken, PDLP5-EGFP; gelbe Balken, PDCB1-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig05.jpg"> Abbildung 5: Zeitverlauf der Bildung von PD-Puncta durch TVCV MP und PDLP5 transient exprimiert in Nicotiana benthamiana und durch Anilinblau-Färbung von PD. Quantitative Daten wurden aus den in Abbildung 2 beschriebenen Experimenten gesammelt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts aus mehreren Experimenten dar. Die einzelnen Datenpunkte werden als Mittelwert für jede Messung angegeben. Die Unterschiede zwischen den Mittelwerten, die durch die bidirektionale ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest nach Tukey ermittelt werden, sind für die P-Werte statistisch signifikant. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01, ***P &lt; 0,001, ****P &lt; 0,0001. Blaue Balken, Anilinfärbung; hellgrüne Balken, MP-EGFP, dunkelgrüne Balken, PDLP5-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="4">Versuch I</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Zellen gesamt</td>
			<td>Zellen mit Parkinson-Lokalisation</td>
			<td>Zellen mit gemischtem Signal</td>
			<td>Zellen mit Parkinson-Lokalisation (%)</td>
		</tr><tr><td>Anilinblau</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>Abgeordneter-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>3</td>
			<td>38</td>
			<td>7.5</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="4">Versuch II</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Zellen gesamt</td>
			<td>Zellen mit Parkinson-Lokalisation</td>
			<td>Zellen mit gemischtem Signal</td>
			<td>Zellen mit Parkinson-Lokalisation (%)</td>
		</tr><tr><td>Anilinblau</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>8</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>Abgeordneter-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>8</td>
			<td>97.5</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>31</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>2</td>
			<td>97.5</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Effizienz der PD-Lokalisierung.
Ergänzende Abbildung 1: PD-Lokalisation von TVCV MP, PDLP5 und PDCB1 transient exprimiert in Nicotiana benthamiana. Die Bilder wurden mit 5 dpi (A), 7 dpi (B) und 10 dpi (C) aufgenommen. Das EGFP-Signal ist grün und die Autofluoreszenz der Plastiden rot. Maßstabsstäbe = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/Figure%20S1.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Konfokalmikroskopische Analyse der Proteinsortierung zu Plasmodesmata bei Nicotiana benthamiana

Plasmodesmata are membranous nanopores that connect the cytoplasm of adjacent plant cells and enable the cell-to-cell trafficking of nutrients, ...

confocal-microscopy-analysis-protein-sorting-to-plasmodesmata

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Makromolekulare Handel zwischen Pflanzenzellen können durch transiente Expression eines Fluoreszenz-markierten Proteins von Interesse und die Analyse ihrer intra-und interzelluläre Verteilung durch konfokale Mikroskopie beurteilt werden.

Ein Cell-to-cell Makromolekulare Transport Assay In Planta Verwendung Biolistic Bombardment

Wir haben eine Technik, um Protein-Protein-Interaktionen in Anlage-Test entwickelt. Ein gelb fluoreszierendes Protein (YFP) ist in zwei nicht überlappende Fragmente aufgeteilt. Jedes Fragment wird in-frame, ein Gen von Interesse via Gateway-System geklont, wodurch Expression von Fusionsproteinen. Rekonstitution der YFP-Signal erfolgt nur, wenn der gerichtlichen Untersuchung Proteinen interagieren.

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

Zellspezifische Analyse<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

Bildung von Protein-Komplexen in vivo kann durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation visualisiert werden. Interaktionspartnern sind, um komplementäre Teile Fluoreszenz-Markierungen geschmolzen und transient in Tabakblättern exprimiert, was zu einem wiederFluoreszenzSignal auf enger Nähe der beiden Proteine.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Auf subzellulärer Ebene werden Signalereignisse dynamisch durch Entwicklungs- und Umwelteinflüsse moduliert. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das das transiente Expressionssystem Tabak verwendet, um die dynamische Protein-Protein-Interaktion zu überwachen und die räumliche Organisation der Signaltransduktion in Pflanzenzellen aufzudecken.

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Pflanze interzelluläre Verbindungen, die Plasmodesmata (Pd), spielen zentrale Rollen im Werk Physiologie und Pflanzenvirus Interaktionen. Entscheidend für den Pd-Transport sind Signale, die Proteine zu Pd direkte sortieren. Unser Wissen über diese Sequenzen ist jedoch noch in den Kinderschuhen. Wir beschreiben eine Strategie zur te-Lokalisierung-Signalen in Pd gezielt Proteine zu identifizieren.

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Dieses Manuskript beschreibt ein einfache und schnelles experimentelles Verfahren für die Bestimmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die basierend auf der Messung der Luciferase-Aktivität.

Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

Wir entwickelten eine neuartige Methode zur Co mehrere Chimären fluoreszierende Fusionsproteine in Anlagen zur Überwindung der Schwierigkeiten von konventionellen Methoden zum Ausdruck zu bringen. Es nutzt die Vorteile der Verwendung einer einzigen Ausdruck Plasmid, das enthält mehrere funktionell unabhängig Protein mit dem Ausdruck Kassetten um Co Proteinexpression zu erreichen.

Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in effizienter Weise in Pflanzen

Dieses Protokoll stellt Informationen zum live-Bild und analysieren schießen Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten mit Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie.

Konfokale Live Imaging von Shoot Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten

Beschrieben wird hier eine Näherungskennzeichnungsmethode zur Identifizierung von Interaktionspartnern der TIR-Domäne des NLR-Immunrezeptors in Nicotiana benthamiana Blattgewebe. Ebenfalls zur Verfügung gestellt ist ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen anderen Proteinen von Interesse mit dieser Technik bei Nicotiana und anderen Pflanzenarten.

TurboID-basierte Näherungskennzeichnung für in Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Maisblatt-Primordien sind tief umhüllt und gerollt, was es schwierig macht, sie zu untersuchen. Hier stellen wir Methoden zur Herstellung von Querschnitten und abgerollten ganzen Mounts von Maisblattprimordien für die Fluoreszenz- und konfokale Bildgebung vor.

Verbesserte Methoden zur Präparation von Querschnitten und abgerollten ganzen Mounts von Maisblattprimordien für die Fluoreszenz- und konfokale Bildgebung

Lernen Sie die konfokalmikroskopische Analyse der Proteinsortierung zu Plasmodesmata bei Nicotiana benthamiana. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Proteinen wie PDLP5 und TVCV MP.

Konfokalmikroskopische Analyse der Proteinsortierung zu Plasmodesmata bei Nicotiana benthamiana

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