In vitro Modellierung der Down-Syndrom-Neurogenese mit human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Langfristiger Forschungsschwerpunkt ist die Suche nach potenziellen Therapeutika für neurologische Erkrankungen des Down-Syndroms. Und unser aktueller Schwerpunkt liegt auf der gestörten Neurogenese des Down-Syndroms, einer der Hauptursachen für geistige Behinderungen. Wir fanden heraus, dass die beeinträchtigte Neurogenese des Down-Syndroms durch einen biphasischen Zellzyklusdefekt verursacht wird, entgegen der landläufigen Meinung, dass dies nur auf die Seneszenz der neuralen Vorläuferzellen des Down-Syndroms zurückzuführen ist.

Die Identifizierung von biphasischen Zellzyklusdefekten mit Hilfe eines humanen IPSC-basierten Protokolls, das in diesem Manuskript beschrieben wird, wird die Entwicklung potenzieller therapeutischer Strategien vorantreiben, die sowohl den Zellzykluszustand, der in der Frühphase eine reduzierte Proliferation ist, als auch das Versagen des Verlassens des Zellzyklus in der späten Phase berücksichtigen. Zu Beginn fügen Sie 10 Mikromolar Gesteinsinhibitor in das vollständige humane iPCS-Medium, DPBS, Zellablösungslösung und Feeder-konditioniertes Medium hinzu, ergänzt mit 25 Nanogramm pro Milliliter basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor. Erwärmen Sie alle Reagenzien auf 37 Grad Celsius.

Nehmen Sie eine Sechs-Well-Platte mit iPS-Zellen auf Feeder. Pipettieren Sie die differenzierten Kolonien aus und fügen Sie frisches, vollständiges humanes iPSC-Medium hinzu. Stellen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden in den Kohlendioxid-Inkubator.

Waschen Sie die Vertiefungen nach der Inkubation einmal mit kalzium- und magnesiumfreiem DPBS. Geben Sie dann einen Milliliter Zellablösungslösung in jede Vertiefung. Stellen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 12 bis 14 Minuten in einen Kohlendioxid-Inkubator.

Beobachten Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop. Wenn sich die meisten Zellen lösen, aber einige anhaften bleiben, klopfen Sie vorsichtig von den Seiten auf die Platte. Geben Sie drei Milliliter DPBS, ergänzt mit Kalzium und Magnesium, in jede Vertiefung, um die Zellablösungslösung zu verdünnen.

Führen Sie mit einer Fünf-Milliliter-Pipette zwei- bis dreimal vorsichtiges Pipettieren durch, um Klumpen zu brechen und Blasen zu vermeiden. Die Zellen werden durch ein 40-Mikrometer-Sieb in eine 50-Milliliter-Zentrifuge 2 geleitet. Die Suspension wird fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 G zentrifugiert. Das Medium wird mit einem Vakuum-Absaugsystem sanft abgesaugt.

Suspendieren Sie nun die Zellen in 10 Millilitern humanem iPSC-Medium. Übertragen Sie alle Zellen in Suspension auf eine 15 Zentimeter große, mit 0,1 % Gelatine beschichtete Schale und inkubieren Sie sie in einem Kohlendioxid-Inkubator. Das Medium mit den Zellen wird in einer Zentrifuge 2 gesammelt.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 G und saugen Sie das Medium dann mit dem Vakuumabsaugsystem sanft an. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Feeder-konditioniertem Medium, ergänzt mit 25 Nanogramm pro Milliliter BFGF und 10 Mikromolar Gesteinsinhibitor. Bereiten Sie nach der Zellzählung eine Suspension von 30.000 bis 50.000 Zellen pro Milliliter vor.

Säen Sie die Suspension in eine Vertiefungsplatte. Ersetzen Sie nach zwei Tagen das Feeder-konditionierte Medium durch eine neurale Vorläuferzelle oder ein NPC-Medium. Wechseln Sie die Medien an den Tagen zwei und 18, wie gegeben.

Ersetzen Sie an Tag 28 das Medium in der Platte durch NPC-Medium, das mit 10 Mikromolar Gesteinsinhibitor ergänzt wird. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator für zwei Stunden. Nach der Inkubation aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Vertiefungen einmal mit kalzium- und magnesiumfreiem DPBS.

Geben Sie einen Milliliter Zellablösungslösung in jede Vertiefung. Beobachten Sie dann die Zellen unter einem inversen Mikroskop bei 4-facher Vergrößerung. Pipettieren Sie anschließend drei Milliliter mit Kalzium und Magnesium angereichertes DPBS in jede Vertiefung der Platte.

Pipettieren Sie die Suspension vorsichtig mit einer Fünf-Milliliter-Pipette und brechen Sie alle Klumpen. Die Zellsuspension wird durch ein 40-Mikrometer-Sieb abgeseiht, das über einer 50-Milliliter-Zentrifuge 2 platziert ist. Zentrifugieren und aspirieren, wie zuvor gezeigt, dann resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter eines definierten Differenzierungsmediums, das mit B 27 mit Vitamin A ergänzt ist. Zählen Sie lebende Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer.

Säen Sie dann 50.000 Zellen in jede Vertiefung einer qualifizierten, matrixbeschichteten 48-Well-Platte. Ersetzen Sie an Tag 33 das Medium in den Kulturvertiefungen durch ein neuronales Differenzierungsmedium. Eine signifikante Verringerung der TUBB3-positiven Neuronen wurde in Down-Syndrom-Kulturen im Vergleich zu isogenen euploiden Zellen beobachtet, wobei an Tag 85 eine etwa zweifache Abnahme zu beobachten war.

Ein signifikant geringerer Anteil an KI67-positiven Zellen wurde in Down-Syndrom-Kulturen während des frühen neurogenen Stadiums im Vergleich zu isogenen euploiden Zellen beobachtet, was eine etwa vierfache Reduktion zeigte. Im späten neurogenen Stadium verließen die meisten isogenen euploiden Zellen den Zellzyklus mit minimaler KI67-Färbung, während die Mehrheit der Down-Syndrom-Zellen KI67-positiv blieb und einen fünffachen Anstieg zeigte. Ein zweites Paar aus dem Sown-Syndrom und isogenen euploiden menschlichen iPS-Zellen bestätigte am Ende der neuronalen Differenzierung reduzierte TUBB3-positive Neuronenspiegel und erhöhte PAX6-positive neurale Vorläuferzellen in Down-Syndrom-Kulturen, mit einer zweifachen Reduktion der TUBB3-positiven Neuronen und einer mehr als zweifachen Zunahme der PAX6-positiven Zellen.