Name: In vitro Modellierung der Down-Syndrom-Neurogenese mit human-induzierten pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Modellierung gestörter Neurogenese bei Down-Syndrom mit humanen iPS-Zellen. Diese Methode identifiziert biphasische Zellzyklusdefekte als Ursache und liefert Einblicke in therapeutische Ansätze.

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<ol><li>Chapman, R. S., Hesketh, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotype+of+individuals+with+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ment+Retard+Dev+Disabil+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotype of individuals with Down syndrome.</a> Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 6 (2), 84-95 (2000).</li>
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<li>Weick, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficits+in+human+trisomy+21+iPSCs+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deficits in human trisomy 21 iPSCs and neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9962-9967 (2013).</li>
<li>Meharena, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+syndrome-induced+senescence+disrupts+the+nuclear+architecture+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Down syndrome-induced senescence disrupts the nuclear architecture of neural progenitors.</a> Cell Stem Cell. 29 (1), 116-130.e7 (2022).</li>
<li>Sharma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+cell+cycle+defect+causes+impaired+neurogenesis+in+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Biphasic cell cycle defect causes impaired neurogenesis in Down syndrome.</a> Front Genet. 13, 1007519(2022).</li>
<li>Maclean, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+hematopoiesis+in+trisomy+21+as+revealed+through+in+vitro+differentiation+of+isogenic+human+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Altered hematopoiesis in trisomy 21 as revealed through in vitro differentiation of isogenic human pluripotent cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (43), 17567-17572 (2012).</li>
<li>Nehra, S., Sharma, V., Umrani, M., Singhal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+Down+syndrome+and+isogenic+euploid+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free Down syndrome and isogenic euploid human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 67, 103041(2023).</li>
<li>Yu, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4 (1), 33-41 (2008).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).</li>
<li>Gaspard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cortical+neurons+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of cortical neurons from mouse embryonic stem cells.</a> Nat Protoc. 4 (10), 1454-1463 (2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>MEF medium: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>10% Endkonzentration</td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>1X Endkonzentration</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>1X Endkonzentration</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>1X Endkonzentration</td></tr><tr><td><stark>hiPSC Medium:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Knockout-Serumersatz (KOSR)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>20% Endkonzentration</td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Hyclone</td><td>SH30238,01</td><td>1x Endkonzentration</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050061</td><td>1X Endkonzentration</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>1X Endkonzentration</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol (1000X)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>1X Endkonzentration</td></tr><tr><td><stark>DDM medium:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>1X Endkonzentration</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050061</td><td>1-fache Endkonzentration</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin-Hyklon</td><td></td><td>SV30010</td><td>1-fache Endkonzentration</td></tr><tr><td>Albumax (10%)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>11020-021</td><td>0,5 x von 10 % Albumax ist die Endkonzentration</td></tr><tr><td>NPC Medium:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDM Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17502048</td><td>1X Endkonzentration</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), abzüglich Vitamin A</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12587010</td><td>1X Endkonzentration</td></tr><tr><td><stark>Neuronales Differenzierungsmedium (ND):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDM Medium 1</td><td></td><td></td><td>/2 des Volumens</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td>1/2 des Bandes</td></tr><tr><td>N2 Beilage</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17502048</td><td>0,5-fache Endkonzentration</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504044</td><td>0,5-fache Endkonzentration</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050061</td><td>1x neurobasales Medium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>1x neurobasales Medium</td></tr><tr><td><stark>Antikörper und Reagenzien für die Immunfärbung: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td>4%</td></tr><tr><td>DPBS, kein Calcium, kein Magnesium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100 Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>0,20%</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Hyclone</td><td>A7979-50ML</td><td>1,00</td></tr>%<tr><td>Gereinigtes Anti-Tubulin &beta;-3 (TUBB3) (TUJ1)</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594 Konjugat</td><td>Life Tech Invitrogen&nbsp;</td><td>A21203</td><td>1:250 Verdünnung</td></tr><tr><td>Gereinigte Maus-Anti-Human Ki67</td><td>BD Pharmingen</td><td>550609</td><td>1:100 Verdünnung</td></tr><tr><td>Gereinigtes Anti-PAX6</td><td>BioLegends</td><td>901302</td><td>1:100 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel (Anti-Kaninchen)</td><td>Life Tech Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:250 Verdünnungslösung</td></tr><tr><td>DAPI (5 mg/ml)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td><stark>Andere</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellablösungslösung (Accutase)&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>A11105-01</td><td>Gebrauchsfertige Arbeitslösung</td></tr><tr><td>Gesteinsinhibitor (RI)</td><td>Sellechckem&nbsp;</td><td>Y27632</td><td>10 mM/ml Endkonzentration</td></tr><tr><td>Dorsomorphin&nbsp;</td><td>Sellechckem&nbsp;</td><td>S7306</td><td>0,125 nM/ml</td></tr><tr><td>Endkonzentration DPBS mit Calcium und Magnisium (DPBS+ Ca, Mg)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14040133</td><td>Gebrauchsfertige Arbeitslösung</td></tr><tr><td>DPBS ohne Calcium und Magnisium</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14190136</td><td>Gebrauchsfertige Arbeitslösung</td></tr><tr><td>Gelatine Typ A</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G2500-100G</td><td>0,10%</td></tr><tr><td>hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix (Matrigel GFR)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>356230</td><td>1 mg Vorratsfläschchen verdünnt 1:240</td></tr><tr><td>Trypsin 0,05</td>%<td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>0,40%</td></tr><tr><td>Basischer Fibrablasten-Wachstumsfaktor (bFGF)</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-18B</td><td>25 ng/ml Endkonzentration</td></tr><tr><td>Kollagenase &nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17104-019</td><td>1mg/ml Endkonzentration</td></tr></tbody></table>

in vitro modellierung der down-syndrom-neurogenese mit human-induzierten pluripotenten stammzellen

In Vitro Modeling of Down Syndrome Neurogenesis Using Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Singularisierte humane iPSCs wurden als Einzelzellsuspensionen auf qualifizierte matrixbeschichtete Schalen ausgeimpft, und die Differenzierung wurde durch die Entfernung von bFGF eingeleitet. Um die nicht-ektodermale Differenzierung zu hemmen, wurde Dorsomorphin, ein BMP-Signalinhibitor, aus DIV 2-1821 zugesetzt. Zur weiteren Differenzierung von Vorläuferzellen aus dem neurogenen Stadium wurden Einzelzellsuspensionen mit geringer Dichte auf der qualifizierten Matrix (Abbildun...

In vitro Modellierung der Down-Syndrom-Neurogenese mit human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Down syndrome (DS), caused by an extra copy of chromosome 21, is a leading cause of intellectual disability. One of the key factors contributing to this ...

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Forschung

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Eine einfache und zuverlässige Methode zur Isolierung und Kultivierung von neuralen Stammzellen aus gebrauchten menschlichen fetalen kortikalen Gewebe wird beschrieben. Kulturen von bekannten menschlichen neurologischen Erkrankungen abgeleitet werden können für die Charakterisierung von pathologischen zellulären und molekularen Prozesse eingesetzt werden, sowie eine Plattform bieten, um pharmakologische Wirksamkeit zu beurteilen.

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Dieses Verfahren ergibt telencephalen Neuronen durch Durchlaufen Kontrollpunkten, die ähnlich wie beim menschlichen Entwicklung beobachtet werden, sind. Die Zellen werden dürfen spontan zu differenzieren, sind Faktoren, die beide gegenüber der neuronalen Abstammungslinie schieben ausgesetzt, werden isoliert, und werden auf Deckgläschen ausplattiert, um die terminale Differenzierung und Reifung zu ermöglichen.

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Wir, basierend auf Erkenntnissen aus der Entwicklungsbiologie und veröffentlichten Forschungsergebnissen, haben ein optimiertes Protokoll entwickelt, um effizient A9-Mittelhirn-dopaminerge Neuronen sowohl aus menschlichen embryonalen Stammzellen als auch aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen zu erzeugen, was für die Krankheitsmodellierung und Zellersatztherapie bei der Parkinson-Krankheit nützlich wäre.

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Eine Anleitung zum Erstellen und Verwenden von hiPSC Abgeleitet NPCs für das Studium der Neurologische Erkrankungen

Die Modellierung der menschlichen Gehirnentwicklung wurde aufgrund der beispiellosen Komplexität des neuronalen Epithelgewebes behindert. In dieser Arbeit wird eine Methode zur robusten Generierung von Hirnorganoiden beschrieben, um frühe Ereignisse der menschlichen Gehirnentwicklung abzugrenzen und Mikrozephalie in vitro zu modellieren.

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Hier berichten wir über ein Protokoll zur Entwicklung eines dreidimensionalen (3-D) -Systems aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), dem so genannten serumfreien Embryoidkörper (SFEB). Dieses 3-D-Modell kann wie eine organotypische Scheibenkultur verwendet werden, um die menschliche kortikale Entwicklung zu modellieren und für die physiologische Abfrage der Entwicklung von neuronalen Schaltungen.

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Wir beschreiben ein Protokoll zur Neuprogrammierung menschlicher hautabgeleiteter Fibroblasten in induzierte neuronale Vorläuferzellen (iNPCs) und deren anschließende Differenzierung in induzierte Astrozyten (iAs). Diese Methode führt zu einer schnellen und reproduzierbaren Generierung von iNPCs und iAs in großen Mengen.

In-vitro-Modellierung für neurologische Erkrankungen mit direkter Konvertierung von Fibroblasten in neuronale Progenitorzellen und Differenzierung in Astrozyten

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von integrationsfreien iPS-Zellen aus fetalen Gewebefibroblasten durch Abgabe episomaler Plasmide durch Nukleofektion, gefolgt von der Beschreibung von Methoden zur iPSC-Charakterisierung und neuronalen Differenzierung.

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Das vorliegende Protokoll erklärt die Erzeugung einer 2D-Monoschicht von Kleinhirnzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Untersuchung der frühen Stadien der Kleinhirnentwicklung.

Modellierung der menschlichen Kleinhirnentwicklung in vitro in 2D-Struktur

Erfahren Sie die Modellierung gestörter Neurogenese bei Down-Syndrom mit humanen iPS-Zellen. Diese Methode identifiziert biphasische Zellzyklusdefekte als Ursache und liefert Einblicke in therapeutische Ansätze.

In vitro Modellierung der Down-Syndrom-Neurogenese mit human-induzierten pluripotenten Stammzellen

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