Name: Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Analyse der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in HeLa-Zellen. Diese Methode erklärt die Autophagie-Regulation bei TDP-43-vermittelten neurodegenerativen Erkrankungen wie ALS.

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<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung der LC3-II-positiven EV-Freisetzung in der Autophagie mit gestörter Lysosomenfusion

<ol><li>Tanaka, Y., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+1+mutants+form+aggregates+that+induce+accumulation+of+prion-like+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43.</a> Prion. 10 (4), 283-289 (2016).</li>
<li>Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+era+of+cryptic+exons%3A+Implications+for+als-ftd%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">The era of cryptic exons: Implications for als-ftd.</a> Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).</li>
<li>Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+of+clinicopathological+heterogeneity+in+tdp-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy.</a> Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).</li>
<li>Chatterjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+extracellular+vesicle+tau+and+tdp-43+as+diagnostic+biomarkers+in+ftd+and+als%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als.</a> Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).</li>
<li>Kasai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+csf+nfl+and+csf+tdp-43+improves+diagnostic+performance+in+als%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als.</a> Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion+is+a+key+pathway+for+clearance+of+pathological+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43.</a> Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+als-ftd-csf+generates+tdp-43+aggregates+in+glioblastoma+cells+through+exosomes+and+tnts-like+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure.</a> Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Sasaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+spinal+cord+motor+neurons+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).</li>
<li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+mechanisms+in+als+and+ftd%3A+Disrupted+rna+and+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li>
<li>Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+common+pathway+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+involvement+of+lysosomal+dysfunction+in+pathological+changes+of+the+brain+in+aged+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+progranulin-driven+autophagy-lysosomal+pathway+mediates+secretion+of+the+nuclear+protein+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).</li>
<li>Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+secretion+via+extracellular+vesicles+is+regulated+by+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy+Rep%22%5BJournal%5D)">TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy.</a> Autophagy Rep. 3 (1), (2024).</li>
<li>Ratajczak, M., Ratajczak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microvesicles%2Fexosomes%3A+discovery%2C+disbelief%2C+acceptance%2C+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future.</a> Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).</li>
<li>Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abemaciclib+and+vacuolin-1+decrease+aggregate-prone+tdp-43+accumulation+by+accelerating+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux.</a> Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).</li>
<li>Dingjan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+and+phagosomal+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endosomal and phagosomal snares.</a> Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+regulates+lysosomal+function+and+biogenesis+through+acidification+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes.</a> Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).</li>
<li>Kanda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+freely+available+easy-to-use+software+%27EZR%27+for+medical+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics.</a> Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).</li>
<li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li>
<li>Plate, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+proteostasis+regulators+that+reprogram+the+ER+to+reduce+extracellular+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation.</a> eLife. 5, e15550(2016).</li>
<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mammalian+autophagy+in+protein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of mammalian autophagy in protein metabolism.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).</li>
<li>Nanayakkara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+lysosome+reformation+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic lysosome reformation in health and disease.</a> Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).</li>
<li>Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STX6-VTI1B-VAMP3+complex+facilitates+xenophagy+by+regulating+the+fusion+between+recycling+endosomes+and+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes.</a> Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin EDTA</td><td>Fujifilm Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Schale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tube</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipettenspitze</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-301</td><td>Pipettieren</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21417-52</td><td>ein Material für Probenpufferlösung</td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid</td><td>Nacalai Tesque</td><td>11009-41</td><td>ein Material für DAB-Lösung</td></tr><tr><td>3,5 cm Schale&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Schale&nbsp;</td><td>TrueLine</td><td>TR4001</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium-Block-Thermostatbäder (trockene Thermobäder)</td><td>EYELA</td><td>273860</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator</td><td>SANSYO</td><td>SAP-102</td><td>Inhalationslösung</td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Adipogen</td><td>BVT-0252</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpervektor</td><td> Laboratorien&nbsp;</td><td>BA-1000</td><td>2. Antikörper für Immunblotting</td></tr><tr><td>Biotin-konjugiertes Pferd Antimouse IgG Antikörper</td><td>Vektor Laboratorien</td><td>BA-2000</td><td>2. Antikörper für das Immunblotting</td></tr><tr><td>Blocking One</td><td>Nacalai Tesque</td><td>03953-95</td><td>ein Material für das Immunblotting</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Nacalai Tesque</td><td>05808-61</td><td>ein Material für Probenpufferlösung</td></tr><tr><td>Kälberserum</td><td>cytiva</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>CanoScan LiDE 220</td><td>Canon</td><td>CSLIDE220</td><td>Scanner</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5702 R</td><td>eppendolf</td><td>5703000039</td><td></td></tr><tr><td>Counting Slides Dual Chamber</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015J</td><td>Zellzählung</td></tr><tr><td>Digital Sonifier 450</td><td>BRANSON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>nacalai tasque</td><td>09659-14</td><td>Fahrzeug</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-45</td><td>Kulturmedium</td></tr><tr><td>DMEM ohne Phenolrot</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08489-45</td><td>Nährmedium</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Dojindo&nbsp;</td><td>348-01311</td><td>ein Material für A68 Lösung</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Version 16.16.27</td><td>satistische Analyse</td></tr><tr><td>EZR</td><td>Referenz Nr. 24</td><td>Version 1.68</td><td>satistische Analyse</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>173012</td><td>Kulturmedium</td></tr><tr><td>Fidschi</td><td>NIH</td><td></td><td>Bildanalysewerkzeug</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09886-05</td><td>ein Material für Probenpufferlösung</td></tr><tr><td>Hoehst33342</td><td>Dojindo&nbsp;</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Fujifilm Wako</td><td>080-0186</td><td>ein Material für DAB-Lösung</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA</td><td>62011</td><td>Reinigungstuch</td></tr> Low <tr><td>Retention Tube</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-MCT015CLB</td><td>siRNA und DNA-Transfektion</td></tr><tr><td>LSM780 Konfokales Lasermikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoklonale Maus Anti-LC3 Antikörper</td><td>MBL</td><td>M186-3</td><td>1. Antikörper für Immunblotting</td></tr><tr><td>Nickel(II)-chlorid-Hexahydrat</td><td>Fujifilm Wako</td><td>149-01041</td><td>ein Material für DAB-Lösung</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosin Natriumsalz</td><td>Nacalai Tesque</td><td>20117-12</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I reduziertes Serum Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>siRNA- und DNA-Transfektion</td></tr><tr><td>pEGFP-C1-hAtg13</td><td>Addgene</td><td>22875</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td>Kulturmedium</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonaler Kaninchen-Anti-PCNA-Antikörper</td><td>BioAcademia</td><td>70-080</td><td>1. Antikörper für Immunblotting</td></tr><tr><td>Polyklonales Kaninchen Anti-Syntaxin 6 Antikörper</td><td>ProteinTech</td><td>10841-1-AP</td><td>1. Antikörper für Immunblotting</td></tr><tr><td>Polyklonales Kaninchen Anti-TSG101 Antikörper</td><td>ProteinTech</td><td>28283-1-AP</td><td>1. Antikörper für Immunblotting</td></tr><tr><td>Polyklonales Kaninchen Anti-ULK1 Antikörper</td><td>ProteinTech</td><td>20986-1-AP</td><td>1. Antikörper für Immunblotting</td></tr><tr><td>Polyvinylidendifluorid Membran</td><td>Milliore</td><td>IPVH00010</td><td>ein Material für das Immunblotting</td></tr><tr><td>R</td><td>R Entwicklung Kernteam</td><td>Version 4.4.1</td><td>satistische Analyse</td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778</td><td>siRNA Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>siRNA STX6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HSS115604</td><td>siRNA für die Transfektion</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-05</td><td>ein Material für Tris Puffer und A68-Lösung</td></tr>, <tr><td>Natriumdodecylsulfat,</td><td>Fujifilm Wako</td><td>192-13981</td>, <td>ein Material für Probenpufferlösung</td></tr><tr><td>, Spark Microplate Reader</td>, <td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stealth RNAi, Negative Control Duplexes, Med GC</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td> 12935300 <td>siRNA-Transfektion</td><td></td></tr>, <tr><td>Saccharose</td>, <td>Fujifilm Wako</td><td>193-00025</td><td>ein Material für die A68-Lösung</td></tr><tr><td>TC20 Automatisierter Zellzähler mit Thermodrucker</td><td>Bio-Rad</td><td>1450109J1</td><td></td></tr><tr><td>Zellzählung Thermobath</td><td>TOKYO RIKAKIKAI</td><td>MG-3100</td><td>Inkubation</td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>DNA-Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio</td> MIR2300 <td>DNA-Transfektionsreagenz</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-75</td><td>ein Material für Tris-Puffer, Probenpuffer und A68-Lösung</td></tr><tr><td>Trypan Blue Dye 0,40%</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>Zellzählung</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>361706</td><td>Sammeln für die P1 EV Fraktion</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>Sammeln für die P2 EV</td></tr><tr><td>Fraktion Vectastain ABC Standard Kit</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>PK-4000</td><td>Immunoblotting</td></tr><tr><td>Waschflasche</td><td>As One</td><td>1-4640-02</td><td>Waschmembran</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 Well High</td><td>ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der lc3-ii-freisetzung über extrazelluläre vesikel in bezug auf die akkumulation intrazellulärer lc3-positiver vesikel

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

Wie in früheren Studien gezeigt, erhöhte die Baf-Behandlung die Spiegel von TSG101 (P1: P &lt; 0,01, P2: P = 0,012, bestimmt durch die bidirektionale ANOVA in EZR19) und LC3-II (P1: P &lt; 0,01, P2: P &lt; 0,01, bestimmt durch die bidirektionale ANOVA in EZR19) in der EV-reichen Fraktion. Bemerkenswert ist, dass die Baf-Behandlung auch die STX6-Spiegel (P1: P &lt; 0,01, P2: P &lt; 0,01, bestimmt durch die Zwei-Wege-ANOVA in EZR19) in der EV-Fraktion erhöhte (Abbildung 1A), was darauf hindeutet, dass STX6 ein Bestandteil von EVs sein könnte. Proliferierendes zelluläres Kernantigen (PCNA) wurde in der EV-Fraktion nicht beobachtet. Das Immunoblotting von STX6 in der Zellfraktion zeigte, dass die STX6-Spiegel durch den siRNA-Knockdown um die Hälfte abnahmen (Abbildung 1B). Der STX6-Knockdown hatte keinen Einfluss auf die TSG101-Spiegel in der Zell- und EV-Fraktion sowohl unter Vehikel- als auch unter Baf-behandelten Bedingungen (Abbildung 1C). Der STX6-Knockdown erhöhte jedoch die LC3-II-Spiegel in der Zellfraktion unter der Vehikel-behandelten Bedingung, nicht jedoch unter der Baf-behandelten Bedingung. Der STX6-Knockdown erhöhte auch die LC3-II-Spiegel in der EV-Fraktion unter der Baf-behandelten Bedingung (Abbildung 1D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Methoden zum Nachweis von LC3-II in EVs durch Immunblotting ausreichend sensitiv sind, auch wenn die Knockdown-Effizienz nicht signifikant ist. Darüber hinaus deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der STX6-Knockdown die Anzahl der intrazellulären Autophagosomen erhöht und die extrazelluläre Freisetzung von Autophagosom-assoziierten Vesikeln unter Baf-Behandlung verbessert.
Um weiter zu untersuchen, ob der STX6-Knockdown die intrazelluläre Autophagosomen- und Autolysosomenzahl beeinflusst, wurden Autophagosomen und Lysosomen mit dem Autophagosomenmarker mCherry-LC3 und dem Lysosomenmarker LAMP1-GFP sichtbar gemacht. Konfokale Lebendzell-Bildgebung zeigte GFP- und mCherry-positive Vesikel in HeLa-Zellen, die LAMP1-GFP und mCherry-LC3 exprimieren (Abbildung 2A). Autolysosomen wurden als GFP- und mCherry-positive Vesikel identifiziert, während Autophagosomen als GFP-negative und mCherry-positive Vesikel identifiziert wurden. Der STX6-Knockdown erhöhte die Anzahl der Autophagosomen und Autolysosomen unter dem vehikelbehandelten Zustand (Abbildung 2B,C). Der STX6-Knockdown hatte jedoch keinen Einfluss auf die Anzahl der Autophagosomen und Autolysosomen unter der Baf-behandelten Bedingung (Abbildung 2B,C).
Um festzustellen, ob der Anstieg der intrazellulären Autophagosomenzahl aufgrund des STX6-Knockdowns auf eine verstärkte Autophagosomenbildung zurückzuführen ist, wurde die Omegasomenbildung, ein Prozess, der für die Autophagosomenbildung erforderlich ist, mit dem Omegasomenmarker GFP-ATG13 untersucht. Die konfokale Bildgebung von lebenden Zellen lieferte ein assembliertes Bild von GFP-ATG13, das auf die Bildung von Omegasomen hinweist (Abbildung 3A). Der STX6-Knockdown verringerte die Signalintensität von GFP-ATG13 (P = 0,023, bestimmt durch die Zwei-Wege-ANOVA in EZR19). Während der STX6-Knockdown die Signalintensität von GFP-ATG13 unter den mit Fahrzeugen behandelten Bedingungen nicht signifikant beeinflusste, verringerte er das Signal unter Baf-behandelten Bedingungen signifikant (Abbildung 3B). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der STX6-Knockdown die Freisetzung von LC3-II-positiven Vesikeln erhöht, die mit der Akkumulation von Autophagosomen-assoziierten Vesikeln verbunden sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Immunoblotting-Ergebnisse der Zell-, P1- und P2-Fraktionen aus HeLa-Zellen, die entweder mit Kontroll- oder STX6-siRNA im Rahmen einer Vehikel- oder Baf-Behandlung transfiziert wurden. HeLa-Zellen wurden nach der Transfektion mit Kontroll- oder STX6-siRNA für 24 h mit Vehikel (DMSO) oder 100 nM Baf behandelt. Die Zellfraktionen, P1 (20.000 × g Pellet) und P2 (110.000 × g Pellet) wurden isoliert. (A) Repräsentative Immunblotting-Bilder jeder Fraktion mit STX6, TSG101, LC3 und PCNA. (B-D) Die densitometrische Analyse für (B) STX6, (C) TSG101 und (D) LC3-II wurde anhand der Immunoblot-Bilder durchgeführt. Die Signalintensitäten wurden auf die Kontroll- oder STX6-siRNA-transfizierten Zellen normalisiert, die mit Vehikel oder Baf behandelt wurden. Die Balkendiagramme stellen Mittelwerte ± S.E.M. (N = 3) dar. * zeigt P &lt; 0,05 durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test in Excel an. Abkürzungen: STX6 = Syntaxin 6; Baf = bafilomycin A1; DMSO = Dimethylsulfoxid; TSG101 = Tumor-Suszeptibilitäts-Gen 101; LC3 = Mikrotubuli-assoziierte Proteine 1A/1B, leichte Kette 3B; PCNA = proliferierendes zelluläres Kernantigen; S.E.M. = Standardfehler des Mittelwerts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Konfokale Bildanalyse von HeLa-Zellen, die Lamp1-GFP und mCherry-LC3 co-exprimieren, transfiziert mit Kontroll- oder STX6-siRNA unter der Vehikel- und Baf-behandelten Bedingung. (A) Konfokale Bilder von HeLa-Zellen, die LAMP1-GFP und mCherry-LC3 stabil exprimieren, wurden 48 h lang mit Kontroll- oder STX6-siRNA transfiziert, gefolgt von einer Exposition mit DMSO oder 400 nM Baf für 4 h. Maßstabsbalken = 20 μm. (B,C) Die Qunatifizierung von (B) Autophagosomen (LAMP1-GFP negativ und mCherry-LC3 positive Punkte) und (C) Autolysosomen (LAMP1-GFP und mCherry-LC3 doppelt-positive Punkte) wurde mit Hilfe von Fiji-Software durchgeführt. Die Daten in den Balkendiagrammen werden als Mittelwerte ± S.E.M. (N = 3) dargestellt. * gibt P &lt; 0,05 an, basierend auf einem zweiseitigen ungepaarten t-Test in Excel. Abkürzungen: Lamp1 = lysosomal-assoziiertes Membranprotein 1; LC3 = Mikrotubuli-assoziierte Proteine 1A/1B, leichte Kette 3B; STX6 = Syntaxin 6; Baf = bafilomycin A1; GFP = grün fluoreszierendes Protein; S.E.M. = Standardfehler des Mittelwerts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Konfokale Bildgebung von HeLa-Zellen, die GFP-ATG13 exprimieren, entweder mit Kontroll- oder STX6-siRNA transfiziert und einer Vehikel- oder Baf-Behandlung unterzogen. (A) HeLa-Zellen wurden mit Kontroll- oder STX6-siRNA transfiziert, gefolgt von einer pEGFP-C1-hAtg13-Transfektion und 4 h lang mit DMSO oder 400 nM Baf behandelt. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Die relativen Signalintensitäten wurden bestimmt, indem das Signal in jeder Bedingung auf das von Kontroll-siRNA-transfizierten Zellen normalisiert wurde, die mit Baf behandelt wurden. Das Balkendiagramm zeigt die Daten als Mittelwert ± S.E.M. (N = 3). * zeigt P &lt; 0,05 durch den zweiseitigen ungepaarten t-Test in Excel an. Abkürzungen: hAtg13 = humanes Autophagie-verwandtes Gen 13; STX6 = Syntaxin 6; Baf = bafilomycin A1; DMSO = Dimethylsulfoxid; S.E.M. = Standardfehler des Mittelwerts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung S1: Immunoplot-Analyse der Zell-, P1- und P2-Fraktionen aus HeLa-Zellen, die mit Kontroll-siRNA transfiziert und mit Baf behandelt wurden. HeLa-Zellen wurden mit Kontroll-siRNA transfiziert und 24 h lang 100 nM Baf ausgesetzt. Anschließend wurden die Fraktionen hergestellt: Zelle, P1 (20.000 × g Pellet) und P2 (110.000 × g Pellet). Repräsentative Immunoblot-Bilder von ULK1 und PCNA, die ihre Spiegel in jeder Fraktion zum Vergleich zeigen. Abkürzungen: Baf = Bafilomycin A1; ULK1 = unc-51 wie Autophagie-aktivierende Kinase 1; PCNA = proliferierendes zelluläres nukleares Antigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385_Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

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Research

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Biochemistry

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Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen.

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

Mitophagy, den Prozess der Clearing beschädigt Mitochondrien ist für mitochondriale Homöostase und Gesundheit Wartung notwendig. Dieser Artikel stellt einige der neuesten Mitophagy Nachweismethoden in menschlichen Zellen, Caenorhabditis Elegansund Mäuse.

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Osmotischen Stress wirkt sich Exozytose und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt während dieses Prozesses. Wir zeigen, wie Kombination elektrochemische Methoden zusammen mit Transmissions-Elektronenmikroskopie kann verwendet werden, um die Wirkung von extrazellulärer osmotischer Druck auf Exozytose Aktivität, Vesikel Quanten Größe und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt untersuchen während der Exozytose.

Überwachung der Wirkung des osmotischen Druckes auf sekretorischen Vesikel und Exozytose

Hier ist eine einfache und gut validierte Protokoll zur Messung der Masse selbstverdauende Sequestrierung Aktivität in Säugetierzellen beschrieben. Die Methode basiert auf der Quantifizierung des Anteils der Laktat-Dehydrogenase (LDH) im Sedimentable Zelle Fraktionen gegenüber dem gesamten zellulären LDH Niveau.

Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen

Der vorliegende Bericht hebt die chronologischen Anforderungen an die extrazelluläre Vesikel-Isolierung (EV) von Mikroglia oder Blutmakrophagen hervor. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden als Regulatoren des Neuritenwachstums evaluiert, während von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge bei der Kontrolle der C6-Gliomzellinvasion in In-vitro-Assays untersucht wurden. Ziel ist es, diese EV-Funktionen als Immunvermittler in bestimmten Mikroumgebungen besser zu verstehen.

Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Kennzeichnung von extrazellulären Vesikeln aus Thrombozytenlysat vor, um ihre Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten zu überwachen, die als Modell für Osteoarthritis verwendet werden.

Markierung extrazellulärer Vesikel zur Überwachung der Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten

Extrazelluläre Vesikel (EVs) tragen zur Zellbiologie und interzellulären Kommunikation bei. Es besteht ein Bedarf an praktischen Assays, um die Aufnahme von Elektrofahrzeugen durch die Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren. Das aktuelle Protokoll schlägt den EV-Aufnahmeassay vor, indem eine dreidimensionale Fluoreszenzbildgebung mittels konfokaler Mikroskopie verwendet wird, nachdem die EV-Isolierung durch ein mikrofluidisches Gerät auf Nanofiltrationsbasis erfolgt.

Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay mittels konfokaler Mikroskop-Bildgebungsanalyse

Die AlPcS2a-vermittelte Chromophor-assistierte Laserinaktivierung (CALI) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der raumzeitlichen Schädigung intrazellulärer Vesikel (IVs) in lebenden Zellen.

Ein photodynamischer Ansatz zur Untersuchung der Funktion der intrazellulären Vesikelruptur

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die autophagischen Konzentrationen bei Bauchspeicheldrüsenkrebs und Pankreasazinuszellen durch LC3-Immunfluoreszenz und LC3-Punktquantifizierung zu bestimmen.

Evaluierung der Autophagie in zwei verschiedenen Pankreaszellmodellen mittels LC3-Immunfluoreszenz

Das vorgeschlagene Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxin während der Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Zellkulturüberständen vermieden und richtig bewertet werden kann.

Isolierung von extrazellulären Vesikeln mit niedrigem Endotoxingehalt, die aus Krebszelllinien stammen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für eine optimierte korrelative Lichtelektronenmikroskopie vor, die auf endogener, fluoreszierender Markierung basiert, um die Lokalisierung seltener Proteine in Bezug auf die zelluläre Ultrastruktur zu untersuchen. Die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes wird durch die ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 in ausgehungerten Zellen ohne Bafilomycin-Behandlung demonstriert.

Ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie

Erfahren Sie die Analyse der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in HeLa-Zellen. Diese Methode erklärt die Autophagie-Regulation bei TDP-43-vermittelten neurodegenerativen Erkrankungen wie ALS.

Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel (Video) | JoVE Journal

Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel

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