Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel
18. Oktober 2024
Hier stellen wir die Methodik zur prägnanten Bestimmung des Autophagosomenmarkers LC3-II-Spiegel in extrazellulären Vesikeln (EVs) durch Immunblotting vor. Die Analyse der LC3-II-Spiegel in EVs, der Autolysosomenbildung und der Omegasomenbildung deutet auf die neue Rolle von STX6 bei der Freisetzung von LC3-II-positiven EVs hin, wenn die Autophagosomen-Lysosomenfusion gehemmt wird.
Unsere Forschung konzentriert sich auf progressive neurodegenerative Erkrankungen, die durch die Akkumulation des Kernproteins TDP-43 im Zytoplasma gekennzeichnet sind, wie z.B. ALS oder FTLD-TDP. Unser Ziel ist es zu verstehen, wie sich TDP-43-Pathologien auf Prionen-ähnliche Weise im Gehirn ausbreiten. Wir haben bereits gezeigt, dass die Freisetzung von TDP-43 über extrazelluläre Vesikel durch die Dysregulation der Autophagie vermittelt wird.
Progranulin des von FTLD-TDP erleichtert diesen Prozess. Die nächste Herausforderung besteht darin, zu klären, wie die Autophagie die Produktion und Freisetzung von extrazellulären Vesikel, die TDP-43 enthalten, reguliert, was zur Entdeckung therapeutischer Ziele für ALS oder FTLD-TDP führen könnte. Nehmen Sie zunächst die kultivierten HeLa-Zellen, zählen Sie sie mit einem Zellzähler und säen Sie eine mal zehn hoch sechs Zellen auf einer sechs Zentimeter großen Platte, die ein Kulturmedium enthält.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden. Bereiten Sie als Nächstes eine 20-mikromolare siRNA-Lösung vor. Mischen Sie 100 Mikroliter reduziertes Serummedium und drei Mikroliter siRNA in einem Röhrchen mit niedriger Retention, um Lösung A herzustellen. Mischen Sie dann 100 Mikroliter reduziertes Serummedium und fünf Mikroliter Transfektionsreagenz in einem Röhrchen mit niedriger Retention, um Lösung B herzustellen. Mischen Sie danach Lösung A und Lösung B und inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.
Geben Sie nun die Mischung aus Lösungen A und B in das Medium, das für die Kultivierung der HeLa-Zellen verwendet wird, und inkubieren Sie es 24 Stunden lang. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag mit PBS und setzen Sie die Zellen fünf Minuten lang 500 Mikrolitern 0,25 % Trypsin und einer millimolaren EDTA-Lösung bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und kontrollierter Luftfeuchtigkeit aus. Geben Sie anschließend 2,5 Milliliter des Kulturmediums zu den Zellen und bereiten Sie mit einer Pasteur-Transferpipette mit einer 20-Mikroliter-Pipettenspitze eine Einzelzellsuspension vor.
Nach dem Zählen der Zellen eine mal zehn hoch sechs Zellen auf einer zehn Zentimeter großen Platte aussäen und inkubieren, wie bereits gezeigt. Am Ende der Inkubation ist das Nährmedium vorzubereiten, das entweder Vehikel oder 100 nanomolare Bafilomycin A1 enthält. Dann werden die Zellen dem Medium ausgesetzt, das entweder Vehikel oder 100 nanomolare Bafilomycin A1 enthält, und 24 Stunden lang inkubieren. Sammeln Sie am nächsten Tag das gesamte Nährmedium von der 10-Zentimeter-Platte.
Füllen Sie das gesammelte Medium in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 3.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um Zelltrümmer zu entfernen. Um die extrazelluläre Vesikelfraktion P1 zu isolieren, wird der Überstand nach der Zentrifugation bei 3.000 G in ein Zentrifugationsröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen eine Stunde lang bei 20.000 g bei vier Grad Celsius.
Zur Isolierung der extrazellulären Vesikelfraktion P2 wird der Überstand nach der Zentrifugation bei 20.000 G in ein Ultrazentrifugenröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie es eine Stunde lang bei 110.000 g bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die überschüssige Feuchtigkeit im Röhrchen mit einem Labortuch abgewischt haben, suspendieren Sie die restlichen Pellets im Zentrifugationsröhrchen in 50 Mikrolitern zweifachem Probenpuffer, um die extrazelluläre Vesikelfraktion P1 vorzubereiten.
Anschließend den Überstand durch Dekantieren entfernen. Wischen Sie die überschüssige Feuchtigkeit im Inneren des Röhrchens mit einem Labortuch ab und resuspendieren Sie die restlichen Pellets im Ultrazentrifugationsröhrchen in 50 Mikrolitern Zweifach-Probenpuffer, um die extrazelluläre P2-Vesikelfraktion vorzubereiten. Inkubieren Sie die extrazellulären Vesikelfraktionen P1 und P2 bei 100 Grad Celsius auf einem Wärmeblock für 10 Minuten.
Nachdem Sie das Kulturmedium von der 10-Zentimeter-Platte in ein 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt haben, waschen Sie die Zellen in der 10-Zentimeter-Schale mit PBS. Setzen Sie dann die Zellen fünf Minuten lang zwei Milliliter 0,25 % Trypsin und eine millimolare EDTA-Lösung bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und kontrollierter Luftfeuchtigkeit aus. Geben Sie acht Milliliter Wachstumsmedium in die Zellen.
Pipettieren Sie die Zellen mit einer Pasteur-Transferpipette mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellsuspension wird in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt und bei 1.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Entfernen Sie dann den Überstand mit einem Aspirator.
Geben Sie PBS zum Zellpellet und zentrifugieren Sie es bei 1.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Entfernung des PBS wird das Zellpellet in einem Milliliter A68-Puffer mit 1 % Sarkosil beschallt. Mischen Sie 300 Mikroliter des Zelllysats mit 100 Mikrolitern Vierfach-Probenpuffer.
Inkubieren Sie die Mischung bei 100 Grad Celsius auf einem Heizblock für 10 Minuten, um die Zellfraktion vorzubereiten.
Übersicht
Diese Studie untersucht die Rolle von TDP-43 bei neurodegenerativen Erkrankungen und dessen Freisetzung über extrazelluläre Vesikel (EVs). Die Forschung unterstreicht die Beteiligung der Autophagie an der Regulation der TDP-43-Freisetzung, was möglicherweise zu therapeutischen Ansatzpunkten für ALS und FTLD-TDP führen könnte.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Neurodegenerative Erkrankungen
Hintergrund
- TDP-43 ist ein nukleäres Protein, das mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert ist.
- ALS und FTLD-TDP sind durch die Anreicherung von TDP-43 im Zytoplasma gekennzeichnet.
- Das Verständnis der TDP-43-Pathologie könnte Mechanismen der Krankheitsausbreitung aufdecken.
- Extrazelluläre Vesikel spielen eine Rolle bei der Freisetzung von TDP-43.
Zweck der Studie
- Aufklärung, wie Autophagie die Produktion und Freisetzung von TDP-43-haltigen EVs reguliert.
- Untersuchung potenzieller therapeutischer Zielstrukturen für ALS und FTLD-TDP.
- Untersuchung der Rolle von Progranulin bei der Freisetzung von TDP-43.
Verwendete Methoden
- Zellkultur von HeLa-Zellen.
- Zählung der Zellen mithilfe eines Zellzählgeräts.
- Aussäen der Zellen in Kulturmedium für die Experimente.
- Immunoblotting zur Bestimmung der Autophagosomen-Marker-Level.
Hauptergebnisse
- Identifizierung der Rolle von STX6 bei der Freisetzung von LC3-II-positiven EVs.
- Analyse der Auswirkungen der Hemmung der Fusion von Autophagosomen mit Lysosomen.
- Nachweis einer Dysregulation der Autophagie bei der Freisetzung von TDP-43.
- Die Beteiligung von Progranulin an der Freisetzung von TDP-43 über extrazelluläre Vesikel.
Schlussfolgerungen
- Die Autophagie ist entscheidend für die Regulation der Freisetzung von TDP-43.
- Die gezielte Beeinflussung der Autophagie könnte neue therapeutische Ansätze für ALS und FTLD-TDP eröffnen.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um die beteiligten Mechanismen vollständig zu verstehen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Bewertung der Freisetzung von LC3-II über extrazelluläre Vesikel (EVs) bietet einen mechanistischen Einblick in den autophagieabhängigen Proteintransport, ein Prozess, der mit dem Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht wird. Dieses Protokoll ermöglicht es Biopharma-Teams, die molekularen Determinanten der pathologischen Proteinausbreitung zu untersuchen und unterstützt die Zielvalidierung sowie die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Programmen zu neurodegenerativen Erkrankungen. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit im Schnittfeld der Modulation der Autophagie und der von EVs vermittelten Biomarkerfreisetzung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die funktionelle Beurteilung autophagiebezogener Gene bei der von extrazellulären Vesikeln vermittelten Proteinausschüttung.
- Unterstützt die mechanistische Risikominderung, indem die Wirkung von Zielkandidaten wie STX6 auf den LC3-II-Transport isoliert wird.
- Erleichtert die hypothesengeleitete Untersuchung krankheitsrelevanter Signalwege bei Neurodegeneration.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht einen reproduzierbaren, immunoblotbasierten Arbeitsablauf zur Quantifizierung von LC3-II in zellulären Fraktionen und Fraktionen extrazellulärer Vesikel (EVs).
- Legt Assay-Kontrollen unter Verwendung von Bafilomycin A1 fest, um die Hemmung der Fusion von Autophagosomen mit Lysosomen als Referenzwert zu bestimmen.
- Ermöglicht die Standardisierung der Isolierung extrazellulärer Vesikel und der Quantifizierung von Markern für nachgeschaltete Screening-Anwendungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ergänzt translationale Biomarker-Strategien, indem die mit extrazellulären Vesikeln assoziierte LC3-II unter krankheitsrelevanten Störungen quantifiziert wird.
- Ermöglicht die kontinuierliche Übertragung von mechanistischen Erkenntnissen zur präklinischen Validierung von Interventionen, die die Autophagie modulieren.
- Bietet eine Plattform zur Beurteilung der extrazellulären Verbreitung von pathologischen Proteinen in Modellen neurodegenerativer Erkrankungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Forschung, indem es quantitative, mechanistische Messungen der Autophagie und der EV-Biologie ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Prüfung der Nullhypothese für Zielgene, die den LC3-II-Export über EVs regulieren.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Immunoblot-Ergebnisse für den vergleichenden Analysen über verschiedene Bedingungen hinweg.
- Analytik: Ermöglicht die Messung von LC3-II und TSG101 als orthogonale Marker für die Spezifität von Signalweg und Vesikel.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse mit krankheitsrelevanten Modellen der Proteinaggregation und -ausbreitung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen modularen Arbeitsablauf, der an verschiedene Forschungsprogramme zur Autophagie und zu EVs angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagegenauigkeit bei der Target-Validierung für Autophagie- und EV-Wege.
- Operativer Wert: Standardisiert die Isolierung von EVs und die Quantifizierung von LC3-II für reproduzierbare, skalierbare Studien.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen für Zielstrukturen bei Neurodegeneration, indem mechanistische Rollen bei der Proteindissemination geklärt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten, die die Autophagie modulieren, in der Entwicklung von Wirkstoffen gegen neurodegenerative Erkrankungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, siRNA-Transfektion und Immunblotting-Techniken.
- Benötigt Zugang zu Hochgeschwindigkeits- und Ultrazentrifugationsanlagen für die Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs).
- Setzt eine strenge, interdisziplinäre Standardisierung der Probenvorbereitung und Markerquantifizierung voraus.
- Kann auf verschiedene Zellmodelle übertragen werden, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung für primäre oder krankheitsrelevante Systeme.
- Bei der Interpretation der LC3-II- und TSG101-Signale müssen die Spezifität der Signalwege und die experimentellen Kontrollen berücksichtigt werden.
