Name: Fluoreszierende Endmarkierung und Verkapselung von langen RNAs für die Einzelmolekül-FRET-TIRF-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Erfahren Sie die fluoreszierende Endmarkierung und Verkapselung langer RNAs für Einzelmolekül-FRET-TIRF-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von RNA-Faltungsdynamiken unter physiologischen Bedingungen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Zweifarbige Endmarkierung und Vesikelverkapselung von RNAs für smFRET-TIRF-Studien

<ol><li>Eitan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+dynamic+structural+biology%3A+Challenges%2C+perspectives+and+an+appeal+for+open-science+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices.</a> Elife. 10, e60416(2021).</li>
<li>Taekjip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer at the single-molecule level.</a> Nat Rev Methods Primers. 4, 22(2024).</li>
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<li>Steiner, M., Karunatilaka, K. S., Sigel, R. K. O., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+group+II+intron+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of group II intron ribozymes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (37), 13853-13858 (2008).</li>
<li>Karunatilaka, K. S., Solem, A., Pyle, A. M., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+Mss116-mediated+group+II+intron+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of Mss116-mediated group II intron folding.</a> Nature. 467 (7318), 935-939 (2010).</li>
<li>Paudel, B. P., Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+crowding+accelerates+group+II+intron+folding+and+maximizes+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular crowding accelerates group II intron folding and maximizes catalysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (47), 11917-11922 (2018).</li>
<li>Saha, R., Verbanic, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+vesicles+chaperone+an+encapsulated+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid vesicles chaperone an encapsulated RNA aptamer.</a> Nat Commun. 9 (1), 2313(2018).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+surface-tethered+lipid+vesicles+as+a+new+tool+for+single+biomolecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Immobilization in surface-tethered lipid vesicles as a new tool for single biomolecule spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Cisse, I., Okumus, B., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+protein+DNA+interactions+inside+porous+nanocontainers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Fueling protein DNA interactions inside porous nanocontainers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (31), 12646-12650 (2007).</li>
<li>Zelger-Paulus, S., Hadzic, M. C. A. S., Sigel, R. K. O., Börner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+fluorescently+labeled+RNAs+into+surface-tethered+vesicles+for+single-molecule+FRET+studies+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of fluorescently labeled RNAs into surface-tethered vesicles for single-molecule FRET studies in TIRF microscopy.</a> Methods Mol Biol. 2331, 1-16 (2020).</li>
<li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>RNA-Markierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml-DNA-LoBind-Röhrchen&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>30108035</tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC-HCl oder EDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11844071</td><td>Pierce EDC, unwägbares Format. Aufbewahren bei&nbsp; -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>3-Morpholinpropan-1-sulfonsäure (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, für die Molekularbiologie, &ge; 99,5% (Titration)</td></tr><tr><td>Essigsäure (glazial)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1,00063</td><td>100%, wasserfrei für die Analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Zentrifugalfiltrationseinheit&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>VS0132</td><td>Vivaspin 500, MWCO 50.000, PES, 500 &mu; L</td></tr><tr><td>Cyanin5-hydrazid (Cy5-hydrazid)</td><td>Lumiprobe</td><td>23070</td><td>5 mg, CAS-Nummer 1427705-31-4&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>New England Biolabs</td><td>12611P</td><td>Ethanol in molekularbiologischer Qualität</td></tr><tr><td></td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>Absolut &ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>für die Molekularbiologie, &ge; 99,0%</td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00317</td><td>rauchend 37%, für die Analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimid (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>98%</td></tr><tr><td>Natriumacetat (NaOAc)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>wasserfrei, ReagentPlus, &ge; 99,0%</td></tr><tr><td>Natriummetaperiodat (NaIO4)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Life Technologies</td><td>20504</td><td>Pierce Produktlinie</td></tr><tr><td>Sulfo-Cyanin3-Amin (sCy3-amin)</td><td>Lumiprobe</td><td>213C0</td><td>5 mg, CAS-Nummer 2183440-43-7</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)</td><td>Biosolve</td><td>200923</td><td>Molekularbiologiequalität</td></tr><tr><td><stark>Kammervorbereitung</ stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl)triethoxysilan (APTES)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>99%</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00014</td><td>für die Analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Biotin-Polyethylenglykol-Succinimidylvalerat (Biotin-PEG-SVA, bPEG) und Methoxypolyethylenglykol-Succinimidylvalerat (mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td>BIO-PEG-SVA, MW 5.000 und MPEG-SVA, MW 5.000 - Kombi-Set</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Carl Roth</td><td>H876.2</td><td>24 x 24 mm, 0,13-0,16 mm; mm Dicke</td></tr><tr><td>Deconex 11 universal</td><td>Borer Chemie AG</td><td>17416492</td><td>Reinigungslösung für Laborglaswaren</td></tr><tr><td>Diamantbeschichteter Kernbohrer</td><td>Crystalite Corporation</td><td></td><td>1 mm Dicke</td></tr><tr><td>Diamantbohrer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>Absolut &ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Coplin Färbeglas mit Deckel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Spacer</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>SecureSeal, 8 Vertiefungen, 9 Vertiefungen; mm & mal; 0.12&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Sauerstoff-Plasmareiniger</td><td>Zepto One</td><td></td><td>Diener</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>für die Molekularbiologie, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>Quarz-Objektträger</td><td>G. Finkenbeiner, Inc.</td><td></td><td>7.5&nbsp; x&nbsp; 2.5&nbsp; cm, 1 mm Dicke</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (NaHCO3)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>BioXtra, 99,5-100,5</td></tr><tr><td>%<stark>Lipidkuchenzubereitung</stark></td>16:<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0 Biotinyl Cap PE, bPE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(cap Biotinyl) (Natriumsalz), C53H98N4O11PNaS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870277P</td><td>Stabil für 1 Jahr bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>14:0 PC, DMPC (1,2-Ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin oder 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, C36H72NO8P)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345P</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen, Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>Autoklav zur Sterilisation von</td></tr><tr><td>500&nbsp; mL Schlenk Kolben</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>1.02445</td><td>für die Analyse EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oberflächenimmobilisierung durch Verkapselung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure (Trolox&reg;)</td><td>Thermo Fischer</td><td>53188-07-1</td><td>97%</td></tr><tr><td>3-Morpholinpropan-1-sulfonsäure (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, für die Molekularbiologie, &ge; 99,5 % (Titration). Bei +4 Grad lagern; C im Dunkeln.</td></tr><tr><td>Klebelaschen</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>629200</td><td></td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-05-2, C30</td><td>aus Rinderleber, wässrige Suspension, 10.000-40.000 Einheiten/mg Protein</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>&ge; 99,5% (GC), BioXtra</td></tr><tr><td>Extruder Polycarbonat (PC) Membran</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005-1EA</td><td>0,1 &mu; m, 19 mm</td></tr><tr><td>Extruder-Set mit Heizblock</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Glukoseoxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-37-0</td><td>aus Aspergillus niger, Typ VII,&nbsp; lyophilisiertes Pulver, &ge; 100.000 Einheiten/g Feststoff (ohne Zusatz von Sauerstoff)</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3, M1028</td><td>für die Molekularbiologie, 1,00 M &plusmn; 0,01 M Lösung</td></tr><tr><td>Abflussscheibe aus Polyester (PE), Membran</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>230300</td><td>10 mm</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td>BioUltra, für die Molekularbiologie, &ge; 99,5 % (AT)</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>für die Molekularbiologie, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fischer</td><td>434301</td><td></td></tr></tbody></table>

fluoreszierende endmarkierung und verkapselung von langen rnas für die einzelmolekül-fret-tirf-mikroskopie

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

Wir präsentieren die ortsspezifische Einzel- und Dual-Fluoreszenz-Markierung der interessierenden 915-nt-RNA, des mitochondrialen Sc.ai5γ-Gruppe II-Introns der Hefe, flankiert von exonischen Sequenzen. Das FRET-Fluorophorpaar wird an den RNA-Enden durch EDC/NHS-Aktivierung des 5'-Phosphats und Periodatoxidation der 3'-Ribose positioniert, gefolgt von entsprechenden Farbstoffbindungen. Anschließend verifizierten wir die RNA-Farbstoff-Konjugate durch Fluoreszenz-Gelelektrophorese, wie in Abbildung 4A dargestellt. Die Co-Migration von RNA und den Fluorophoren auf dem Agarosegel bestätigt die erfolgreiche Markierung. Als nächstes wurde, wie in Abbildung 4B gezeigt, die Ensemble-Fluoreszenzspektroskopie verwendet, um das dual-markierte Intron der Gruppe II zu charakterisieren. Bei Anregung des Donorfarbstoffs wurde ein Energietransfer, d.h. FRET, beobachtet, was die duale Markierung der RNA beweist. Bemerkenswert ist, dass die Faltung der Intron-RNA der Gruppe II in Gegenwart von Metallionen zu einer Erhöhung der FRET-Effizienz führte, was durch die Abnahme der Donoremission (grüner Pfeil) und eine entsprechende Zunahme der Akzeptoremission (roter Pfeil) belegt wird. Dies deutet darauf hin, dass diese FRET-Markierung die Konformationsänderungen des Ribozyms verfolgt.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Charakterisierung der RNA-Farbstoff-Konjugate. (A) Die analytische gelbasierte Analyse von einfach- und dual-fluoreszenzmarkierter RNA zeigt die Co-Migration der Farbstoffe mit der RNA auf einem 2%igen Agarosegel. Die Co-Lokalisierung der Fluorophore in der doppelt markierten Probe wird durch die gelbe Bande im zusammengeführten Bild (unten) der Kanäle Cy3 (oben, grün) und Cy5 (Mitte, rot) angezeigt, die bei einer Beleuchtung von 532 nm bzw. 635 nm sichtbar sind. Spur 1: 5'-sCy3 nur markierte RNA, Spur 2: 3'-Cy5 nur markierte RNA und Spur 3: Dual-End (5'-sCy3 und 3'-Cy5) markierte RNA. (B) Die Ensemble-Fluoreszenzspektroskopie bestätigt die Doppelmarkierung. Der Energietransfer bei Donoranregung (λex = 515 nm, λem = 670 nm) bestätigt, dass beide Farbstoffe erfolgreich an die RNA gekoppelt sind. Die graue Kurve stellt das Emissionsprofil der präkatalytischen RNA dar, während die schwarze Kurve eine erhöhte FRET-Effizienz in der gefalteten Intron-RNA der Gruppe II zeigt (inkubiert mit 500 mM KCl bei 70 °C für 3 min, abgekühlt auf 42 °C für 5 min, gefolgt von der Zugabe von 100 mM MgCl2). Diese Abbildung wurde von Ahunbay et al. übernommen.3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Mit dem fluoreszierenden, dual-markierten Wildtyp-Intron der Gruppe II in der Hand sind wir nun in der Lage, seine Dynamik auf Einzelmolekülebene zu untersuchen. Nach der Verkapselung in Phospholipid-Vesikeln wird die markierte RNA auf einer Mikroskopieoberfläche bei sehr niedrigen Oberflächendichten immobilisiert, um eine Einzelmolekülauflösung für smFRET-TIRF zu erreichen. Wie in Abbildung 5A zu sehen ist, können mehrere einzelne Moleküle gleichzeitig verfolgt werden. Die TIRF-Mikroskopie ermöglicht die Echtzeitüberwachung der FRET-Effizienz und ihrer Veränderungen im Laufe der Zeit. Abbildung 5B zeigt beispielhaft die statischen und dynamischen Einzelmolekül-FRET-Spuren der markierten und verkapselten RNA. Eine typische dynamische Spur weist eine Antikorrelation zwischen Donor- und Akzeptorsignalen auf, die die FRET-Effizienz schwankt. Wenn die Akzeptoremission bei Donoranregung zunimmt, nimmt die Donoremission entsprechend ab, was auf eine dynamische Änderung des Interfarbstoffabstands hinweist. Diese Antikorrelation deutet auf Konformationsänderungen im RNA-Molekül hin.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Hochdynamisches Verhalten von Intron-RNA der Gruppe II, nachgewiesen durch smFRET. Die Dual-End-markierte Intron-RNA der Gruppe II wird in einem Phospholipid-Vesikel eingekapselt und auf der Oberfläche für die Bildgebung mit einem objektiven TIRF-Mikroskop immobilisiert. (A) Zusammengeführtes Bild einzelner markierter RNA-Moleküle, die bei 532 nm Anregung Donoremission (sCy3, grün) und Akzeptoremission (Cy5, rot) aufweisen. (B) Die typischen smFRET-Trajektorien eines statischen RNA-Moleküls, bei dem die Donor- und Akzeptorintensitäten im Laufe der Zeit nicht schwanken, und (rechts) eines dynamischen RNA-Moleküls, bei dem die Donor- und Akzeptorintensitäten antikorrelieren, mit FRET-Effizienzen in Gelb. Einzelmoleküle werden mit MASH-FRET17 lokalisiert und analysiert. Es werden direkte Erregungs-, Durchblutungs- und γ-Faktor-Korrekturen angewendet. Abkürzungen: smFRET = single-molecule Förster Resonance Energy Transfer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Fluoreszierende Endmarkierung und Verkapselung von langen RNAs für die Einzelmolekül-FRET-TIRF-Mikroskopie

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

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