Fluoreszierende Endmarkierung und Verkapselung von langen RNAs für die Einzelmolekül-FRET-TIRF-Mikroskopie

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Dynamik katalytischer aktiver RNAs und wie sich diese Dynamik unter verschiedenen Umweltbedingungen verändert. Wir verwenden Einzelmolekül-FRET, um den Einfluss von Faktoren wie monovalenten und zweiwertigen Mittellinien, Chaperonproteinen und Crowding-Agenten auf die RNA-Dynamik zu untersuchen. Der präzise Einbau von Donor- und Akzeptorfluorophoren ohne Störung der RNA-Struktur und -Funktion ist eine Herausforderung.

Darüber hinaus ist es schwierig, die Faltung einer großen dynamischen RNA zu verfolgen. Das etablierte Markierungs- und Verkapselungsprotokoll ermöglicht es uns jedoch, die Faltungsdynamik der funktionellen RNA im Laufe der Zeit zu überwachen. Unser Protokoll adressiert die Herausforderung, große, katalytisch aktive RNAs in Echtzeit und unter neophysiologischen Bedingungen zu beobachten.

Durch die kovalente Markierung und Verkapselung der RNA und der Vesikel, die dann oberflächenimmobilisiert werden, können wir die RNA-Funktion mit Einzelmolekül-TIRF überwachen. Wir konzentrieren uns auf die kovalente FRET-Markierung von langen katalytischen RNAs und insbesondere von Introns der Gruppe II. Dies ist aufgrund ihrer strukturellen Komplexität eine Herausforderung.

Wenn sie in Vesikeln verkapselt ist, können wir die RNA für die TIRF-Mikroskopie im evaneszenten Feld halten, und dennoch kann die RNA frei schweben. Auf diese Weise kann smFRET das dynamische Verhalten der RNA ungehindert aufdecken. Wir werden weiterhin versuchen zu verstehen, wie die Natur wirklich funktioniert, indem wir uns auf die Struktur-Funktions-Beziehung und -Dynamik von Ribosomen, Riboschaltern und anderen regulatorischen RNAs konzentrieren, indem wir einen Multi-Technik-Ansatz verfolgen.

Der Übergang zu Untersuchungen unter physiologischen und zellulären Bedingungen wird daher in Zukunft ein wichtiger Schwerpunkt unserer Arbeit sein. Zu Beginn aliquotieren Sie die interessierende RNA mit 50 bis 75 Mikrogramm RNA pro Röhrchen in 55 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser und fügen Sie dann 45 Mikroliter des EDC/NHS-Natriumacetat-pH-6-Gemisches zur RNA hinzu. Inkubieren Sie die Mischung vier Stunden lang bei 25 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 500 U/min.

Nach der Inkubation resuspendieren Sie das aktivierte RNA-Pellet in 95 Mikrolitern 100-Millimolar-MOPS-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5. Fügen Sie dann fünf Mikroliter zwei-millimolares sulfoniertes Cyanin-3-Amin zur aktivierten RNA hinzu und inkubieren Sie 16 Stunden lang bei 25 Grad Celsius bei 500 U/min, um das Fluorophor an das aktivierte 5-Prime-Phosphat zu koppeln. Am nächsten Tag fügen Sie 200 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzu, um die Trennung zu verbessern.

Dann reinigen Sie die mit 5-Prime-Phosphat markierte RNA durch Ethanolfällung. Nach der Reinigung resuspendieren Sie die markierte RNA in 100 Mikrolitern 100-millimolarem Tris-HCl und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Um die freien Farbstoffe zu entfernen, waschen Sie die markierte RNA in doppelt destilliertem Wasser mit Zentrifugalfiltration.

Für die Dual-End-Markierung aliquotiert die 5-Prime-End-markierte RNA mit etwa 50 bis 75 Mikrogramm RNA pro Röhrchen in 90 Mikrolitern Lösung. Fügen Sie fünf Mikroliter einmolaren Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 5,5 hinzu. Fügen Sie dann vier Mikroliter frisch zubereitete 500-Millimolar-Natriummetaperiodat-Stammlösung hinzu.

Für die Einzelmarkierung mit 3 Primzahlen fügen Sie acht Mikroliter Metaperiodat-Stammlösung hinzu. Nachdem Sie die Lösungen zwei Stunden lang im Dunkeln inkubiert haben, pipettieren Sie 30 Mikroliter 50%iges Glycerin, um die Reaktion zu stoppen. Nach 30 Minuten Inkubation fügen Sie 400 Mikroliter eiskaltes Ethanol-Natriumacetat-Fällungsgemisch hinzu.

Resuspendieren Sie das oxidierte RNA-Pellet in 95 Mikrolitern 50-Millimolar-Natriumacetat-Puffer mit einem pH-Wert von sechs. Aufreinigung der Dual-End-markierten RNA durch Ethanolfällung und Zentrifugalfiltration, wie zuvor gezeigt. Eluieren Sie die gereinigte RNA in doppelt destilliertem Wasser.

Vergleichen Sie visuell die Überstands- und Pelletfarben, die nach jedem Schritt erhalten werden. Berechnen Sie die RNA- und Konjugatfarbstoffkonzentrationen auf einem UV-sichtbaren Spektralphotometer. Die Fluoreszenz-Gelelektrophorese bestätigte die erfolgreiche Einfach- und Doppelmarkierung der RNA, wie die Comigration der RNA mit den Fluorophoren zeigte.

Die FRET-Effizienz stieg in Gegenwart von Metallionen, was auf eine RNA-Faltung hinweist, was zu einer Abnahme der Donoremission und einer Zunahme der Akzeptoremission führte. Um eine mikrofluidische Kammer vorzubereiten, bohren Sie mit einem Diamantbohrer vier Löcher in die Quarzobjektträger, um zwei Kanäle zu bilden. Legen Sie die gebohrten Quarz-Objektträger und etwa doppelt so viele Deckgläser in ein Coplin-Färbeglas aus Glas mit Deckel.

Beschallen Sie die Objektträger und Deckgläser fünf Minuten lang in doppelt destilliertem Wasser. Als nächstes beschallen Sie das Glas 30 Minuten lang bei 50 Grad Celsius in einer 10%igen Reinigungslösung für Laborglas. Nachdem Sie das Glas mit doppelt destilliertem Wasser gespült haben, beschallen Sie es 30 Minuten lang in einer molaren Kaliumhydroxidlösung und lassen Sie es über Nacht in der Lösung.

Trocknen Sie die Objektträger und Deckgläser nach mehrmaligem Spülen und Beschallung mit destilliertem Wasser mit Stickstoffgas. Behandeln Sie die getrockneten Objektträger und Deckgläser 30 Minuten lang mit einem Sauerstoffplasmareiniger. Legen Sie die sauberen Objektträger und Deckgläser in ein Coplin-Färbeglas mit 3%iger AP-Test-Ethanollösung, beschallen Sie sie eine Minute lang und inkubieren Sie sie dann 30 Minuten lang.

Spülen Sie die Objektträger und Deckgläser jeweils dreimal mit absolutem Ethanol und doppelt destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie dann unter Stickstoffgasstrom. Bereiten Sie als Nächstes eine feuchte Box vor, indem Sie eine leere Pipettenspitzenbox zur Hälfte mit doppelt destilliertem Wasser füllen. Legen Sie die Objektträger mit der zu behandelnden Seite nach oben in die Box.

Geben Sie 30 Mikroliter frisch zubereitetes bPEG/mPEG-Gemisch in die Mitte des Objektträgers, um beide Kanäle abzudecken. Decken Sie das Tröpfchen mit einem sauberen Deckglas ab und verschließen Sie die Feuchtbox. Inkubieren Sie die Box über Nacht im Dunkeln für die PEGylierung.

Spülen Sie am nächsten Tag die PEG-passivierten und biotinylierten Objektträger und Deckgläser mit doppelt destilliertem Wasser ab und beobachten Sie die Veränderung der Hydrophobie der behandelten Oberflächen. Befestigen Sie den doppelseitigen Aufkleber an der Folie und stellen Sie sicher, dass der Aufkleber den gewünschten Bereich abdeckt. Legen Sie dann das Deckglas vorsichtig auf den Objektträger und richten Sie die PEGylierten Flächen so aus, dass sie einander zugewandt sind.

Übertragen Sie die zusammengebaute Kammer in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und füllen Sie das Röhrchen mit Stickstoffgas. Stechen Sie zunächst mit einer sterilen Nadel ein Loch von innen nach außen in den Deckel eines sterilen, sauberen Zwei-Milliliter-Röhrchens. Geben Sie 109 Mikroliter bPE-DMPC-Gemisch in das Röhrchen.

Legen Sie einen Trennwandeinsatz aus einer Mikroröhrchen-Aufbewahrungsbox in einen 500-Milliliter-Schlenk-Kolben, der als Röhrchenhalter dient. Setzen Sie die Röhrchen mit der Lipidmischung vorsichtig mit einer langen Pinzette in den Röhrchenhalter ein. Verdampfen Sie das Chloroform bei geringem Stickstoffstrom über Nacht.

Nachdem Sie die getrocknete Lipidschicht erhalten haben, versiegeln Sie die Röhrchen mit Parafilm, um die Löcher abzudecken. Montieren Sie den Extruder mit einer 100-Nanometer-Polycarbonatmembran und einer 10-Millimeter-Polyester-Ablaufscheibe. Äquilibrieren Sie die Spritze und die Membranen mit einem Anti-Blink-Puffer.

Nach dem Mischen von Dual-End-markierter RNA mit Anti-Blink-Puffer hydratisieren Sie den Lipidkuchen mit einer RNA-Anti-Blink-Puffermischung bei 30 Grad Celsius. Fünf Minuten lang bei 1.400 U/min schütteln, gefolgt von 15 Minuten bei 700 U/min. Die Mischung wird zwei Minuten lang bei 13.000 g zentrifugiert und der Überstand mit 250 Mikrolitern Antiblinkpuffer verdünnt.

Füllen Sie die Spritze mit der RNA-Lipidsuspension und extrudieren Sie sie 35 Mal bei 30 Grad Celsius auf einem Heizblock, um die Dual-End-markierte RNA in Phospholipid-Vesikeln mit einem Durchmesser von 100 Nanometern einzukapseln. Spülen Sie die Kammer zweimal mit 200 Mikrolitern 5X Standardpuffer bei Raumtemperatur. Füllen Sie die Kammer mit 50 Mikrolitern Streptavidin-Lösung von 20 Mikrolitern pro Milliliter und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang.

Spülen Sie dann die Kammer mit 200 Mikrolitern Standardpuffer und 100 Mikrolitern Antiblinkpuffer. Fügen Sie 75 Mikroliter Vesikelsuspension hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang, um die verkapselte RNA auf der Oberfläche zu immobilisieren. Spülen Sie die Kammer nach der Immobilisierung mit 200 Mikrolitern frisch zubereitetem Bildgebungspuffer.

Für die Datenerfassung montieren Sie die Kammer am TIRF-Mikroskop und erfassen smFRET-Daten mit abwechselnder Laseranregung. Die Einzelmolekül-FRET-Bildgebung mittels TIRF-Mikroskopie verfolgte einzelne RNA-Moleküle und erkannte Veränderungen der FRET-Effizienz in Echtzeit. Dynamische Einzelmolekül-Spuren zeigten antikorrelierte Fluktuationen zwischen Donor- und Akzeptorsignalen, was auf bestätigende Veränderungen in der RNA hinweist.