Lebend-/Totfärbung zur Quantifizierung lebensfähiger, aber nicht kultivierbarer Zellen in mit Manuka-Honig behandelten wundverursachenden Bakterien

Ziel dieses Forschungsprojekts ist es, den Einfluss von Manuka-Honig auf die bakterielle Physiologie zu untersuchen. Jüngste Studien haben weitere Einblicke in die antimikrobielle Wirkung von Manuka-Honig auf die bakterielle Physiologie geliefert. Unsere vorläufigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Manuka-Honig-Bakterien in den antibiotikaresistenten, lebensfähigen, aber nicht kultivierbaren Ruhezustand übergehen, jedoch in geringerem Maße als solche, die mit herkömmlichen Antibiotika behandelt werden.

Basierend auf unseren Experimenten wäre es interessant, die Expressionsprofile von Manuka-Honig und konventionellen Antibiotika-induzierten VBNCs zu vergleichen. Nehmen Sie zunächst die Durchstechflaschen mit gefrorenen Bakterienstämmen. Öffnen Sie jedes Agar nacheinander und kratzen Sie mit einem sterilen Stäbchen eine kleine Menge gefrorener Bakterien auf die entsprechend beschriftete Luria-Bertani- oder LB-Agarplatte.

Setzen Sie die Kappe der Durchstechflasche wieder auf und stellen Sie sie schnell in den Gefrierschrank. Inkubieren Sie die Bakterienkulturen für 18 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag geben Sie mit einer serologischen Pipette zwei Milliliter LB-Brühe in zwei sterile Reagenzgläser.

Sterilisieren Sie die Impfschlaufe in der Flamme des Bunsenbrenners. Übertragen Sie dann eine Viertelschleife voll Bakterien von der LB-Agarplatte in das entsprechend beschriftete Reagenzglas mit LB-Brühe. Inkubieren Sie das Reagenzglas unter aeroben Bedingungen in einem Schüttelinkubator bei ca. 250 U/min bei 37 Grad Celsius für 18 bis 24 Stunden.

Für die Einrichtung von Manuka-Honig und Antibiotikabehandlungen von Bakterien fügen Sie 10 Mikroliter Bakterienkultur zu 10 Millilitern Müller-Hinton-Brühe hinzu, um die 1:1.000-Verdünnung der Bakterienkultur zu erhalten, die etwa 10 bis sechste koloniebildende Einheiten pro Milliliter aufweist. Verwenden Sie die verdünnten Kulturen, um drei Proben für jede Bakterienart vorzubereiten: eine unbehandelte Kontrolle, eine mit Manuka-Honig behandelte Probe und eine mit Antibiotika behandelte Probe. Den Manuka-Honig und das Antibiotikum in die entsprechenden Röhrchen geben.

0,1 Milliliter und 0,5 Milliliter der unbehandelten Probe werden in sterile Mikrozentrifugenröhrchen überführt, um die Anzahl der lebensfähigen Platten und die Lebend-/Totfärbung für die T gleich null Proben zu erhalten. Inkubieren Sie dann die unbehandelte Kontrolle, mit Manuka-Honig behandelte und mit Antibiotika behandelte Proben unter aeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator bei 250 U/min für 24 Stunden. Bereiten Sie eine zehnfache serielle Verdünnung der T gleich null unbehandelten Probe in LB-Bouillon vor, um eine zählbare Anzahl von Zellen für die lebensfähige Plattenzahl zu erhalten.

Verteilen Sie 50 Mikroliter jeder verdünnten Probe auf eine Hälfte einer LB-Agarplatte. Inkubieren Sie die Agarplatten unter aeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Am nächsten Tag nehmen Sie die LB-Agarplatten aus dem Inkubator.

Identifizieren Sie die Verdünnungsplatte mit ca. 25 bis 150 Völkern und zählen Sie die genaue Anzahl der Völker. Verwenden Sie die Formel für die koloniebildende Einheit, um die Anzahl der kultivierbaren Zellen pro Milliliter zu bestimmen. Am dritten Tag fügen Sie 0,5 Milliliter 0,85 % Natriumchlorid zu 0,5 Millilitern T hinzu entspricht null unbehandelter Kontrollprobe für Lebend-/Totflecken.

Kombinieren Sie 1,5 Mikroliter SYTO 9 und 1,5 Mikroliter Propidiumiodid pro Probe. Geben Sie dann drei Mikroliter der Mischung zu jeder Probe. Inkubieren Sie die Proben bei 21 Grad Celsius im Dunkeln für 15 Minuten.

Übertragen Sie sechs Mikroliter der gefärbten, schonend gemischten Probe in ein Einweg-Hämozytometer und betrachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Fluorescein-Isothiocyanat- oder FITC-Filter und einer 40-fachen Objektivlinse. Nehmen Sie ein Bild auf, das sowohl die Gitterlinien des Hämozytometers als auch die grünen Zellen zeigt. Zählen Sie die grünen Zellen in sechs Feldern pro Probe und notieren Sie sich die Rasterabmessungen, um die Anzahl der grünen Zellen pro Volumen zu berechnen.

Berechnen Sie schließlich die Anzahl lebensfähiger, aber nicht kultivierbarer Zellen, indem Sie die Anzahl der kultivierbaren Zellen pro Milliliter, die unter Verwendung der Anzahl lebensfähiger Platten erhalten wurden, von der Anzahl lebensfähiger Zellen pro Milliliter subtrahieren, die durch Lebend-/Totfärbung erhalten wurden. Am vierten Tag, nachdem Sie die unbehandelten, mit Manuka-Honig behandelten und mit Antibiotika behandelten Bakterienkulturen aus dem Inkubator entnommen haben, sammeln Sie 0,1 Milliliter und 0,5 Milliliter jeder Probe in Mikrozentrifugenröhrchen für die Zählung der lebensfähigen Platten und die Lebend-/Totfärbung. Diese Abbildung zeigt die Anzahl der kultivierbaren und lebensfähigen Zellen, die anhand der Anzahl der lebensfähigen Platten und der Lebend-/Totfärbung für S.aureus- und P.aeruginosa-Kulturen bestimmt wurden.

Die Ergebnisse zeigen, dass sich die Anzahl der lebensfähigen und kultivierbaren Zellen, die in den unbehandelten und mit Manuka-Honig behandelten Kulturen nachgewiesen wurden, nicht signifikant unterschied. S.aureus-Kulturen, die mit Tobramycin behandelt wurden, wiesen weniger kultivierbare Zellen als lebensfähige Zellen auf, aber dieser Unterschied war nicht signifikant. Nur mit Meropenem behandelte P.aeruginosa zeigte eine statistisch signifikante Reduktion an kultivierbaren Zellen im Vergleich zu lebensfähigen Zellen.