Charakterisierung biologischer Absorptionsspektren vom sichtbaren bis zum kurzwelligen Infrarot

Unser Labor entwickelt lichtbasierte Werkzeuge, die diagnostische Informationen für Anwendungen im Bereich der Müttergesundheit liefern. Wir verwenden die optische Spektroskopie häufig, da sie eine Fülle von gesundheitsbezogenen Informationen nicht-invasiv liefern kann, wie z. B. die Überwachung der Blutsauerstoffversorgung und der Hämoglobinkonzentration, beides wichtige physiologische Parameter, die während der Schwangerschaft überwacht werden müssen. Einige Lösungsmittel in Partikelwasser haben eine starke Absorption, die die interessierenden gelösten Stoffe überschatten kann.

Darüber hinaus weisen Spektren, die sich über den VIS-SWIR-Bereich erstrecken, oft große Unterschiede in der Absorption in verschiedenen Wellenlängenbereichen auf, und wir müssen die experimentellen Einstellungen für verschiedene Regionen ändern, um Spektren mit hohem SNL-Wert zu erhalten. Schwierigkeiten bei der Erfassung biologischer VIS-SWIR-Spektren haben dazu beigetragen, dass nur wenige biologische Absorptionsspektren veröffentlicht wurden, und wir wollen diesen Prozess vereinfachen. Darüber hinaus wird ein verbessertes Verständnis der spezifischen spektralen Eigenschaften jeder biologischen Komponente dazu beitragen, optimierte Wellenlängen zu wählen, die die durch eine starke Melaninabsorption verursachte Verzerrung der Hautpigmentierung minimieren könnten.

Wir hoffen, dass unser Protokoll es den Forschern ermöglichen wird, die derzeitige VIS-SWIR-Bibliothek biologischer Absorber zu erweitern. Diese Ergebnisse unterstreichen auch den Einfluss von Melanin auf optische Geräte in Abhängigkeit von der Wellenlänge und können verwendet werden, um Systeme mit minimaler Hautpigmentierungsverzerrung zu entwerfen, wie z. B. im SWIR. Um die sauerstoffhaltige Hämoglobinprobe mit heparinisiertem menschlichem Vollblut vorzubereiten, pipettieren Sie 1,8 Milliliter Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 9,6 g und entsorgen Sie etwa 850 Mikroliter Überstand, ohne das Pellet zu stören. Rekonstituieren Sie das Pellet in ca. 850 Mikrolitern deuteriertem Wasser und zentrifugieren Sie es erneut bei 9,6 g für 10 Minuten. Nach der letzten Zentrifugation rekonstituieren Sie zur Lyse der roten Blutkörperchen die Pellets der roten Blutkörperchen mit 4,5 Millilitern deuteriertem Wasser.

Wenn das Pellet an der Tube haftet, spülen Sie es mit einer Portion deuteriertem Wasser ab, um es zu lösen. Entfernen Sie mit einer stumpfen Nadel und einer Spritze die lysierte Blutlösung aus dem Röhrchen. Nehmen Sie dann die Nadel mit der stumpfen Spitze von der Spritze ab und entsorgen Sie sie in einem Behälter für scharfe Gegenstände für biologische Gefährdung.

Befestigen Sie als Nächstes einen 0,22-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter an der Spritze und filtern Sie den Inhalt in ein 3,5-Milliliter-Glas mit einer Schichtdicke von 10 Millimetern oder eine Quarzküvette. Sichern Sie die Küvette mit einem luftdichten Verschluss, um eine Kontamination zu verhindern. Wickeln Sie Parafilm um den Stopfen, um einen vollständig luftdichten Verschluss zu gewährleisten.

Bereiten Sie eine Referenz vor, indem Sie eine saubere Küvette mit dem gleichen Weg, der gleichen Länge und dem gleichen Volumen mit deuteriertem Wasser für Basis- und Referenzmessungen füllen. Zur Vorbereitung der sauerstoffarmen Hämoglobinprobe fügen Sie der Blutlösung in der Küvette Natriumdithionit hinzu. Sichern Sie die Küvette mit einem luftdichten Stopfen und wickeln Sie Parafilm um den Stopfen, um einen luftdichten Verschluss zu gewährleisten.

Kippen Sie die Küvette vorsichtig von einer Seite zur anderen, bis sich der Natriumdithionit vollständig aufgelöst hat. Beobachten Sie den Farbwechsel der Blutlösung von Rot zu einem dunkleren Purpurrot. Schalten Sie zunächst die Spektrometerlampe und die Detektoren ein, sodass sich das System 5 bis 20 Minuten lang erwärmen kann.

Reinigen Sie die Küvetten mit Ethanol mit einem Kimwipe. Bei einem Zweistrahl-Spektrometer sind Küvetten, die mit deuteriertem Wasser als Referenzlösung gefüllt sind, sowohl in die Proben- als auch in die Referenzkammer zu legen. Wählen Sie den passenden Wellenlängenbereich und den Detektor basierend auf dem zu messenden Spektralbereich aus.

Erhalten Sie Referenzmessungen mit den Standardparametern. Ersetzen Sie anschließend die Küvette in der Probenkammer durch die Küvette mit dem sauerstoffhaltigen Hämoglobin. Wechseln Sie in den Live-Modus, um die Absorption kontinuierlich anzuzeigen, während die Messparameter abgestimmt werden.

Beginnend mit den Standardparametern des Spektrometers passen Sie die Messwerte pro Datum und Bandbreite an, um ein qualitativ sauberes Absorptionsspektrum ohne Sättigung zu erhalten. Wenn die Änderung der einfallenden Lichtleistung, der Bandbreite, der Belichtungszeit und der Messwerte pro Bezugspunkt nicht zu einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis-Spektrum führt, ändern Sie die Probenkonzentration, indem Sie die Referenzküvette entweder in der Proben- oder Referenzkammer oder in der Weglänge der Probe und der Referenz platzieren, um ein Spektrum mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Sobald die Einstellungen für das Sample optimiert sind, dokumentieren Sie die Einstellungen für jedes erfasste Spektrum.

Messen Sie mit den optimierten Einstellungen mit den gleichen Einstellungen mit der Referenzlösung in der Referenz- und Probenkammer erneut, um die optimierte Referenzmessung zu erhalten. Ersetzen Sie anschließend die Referenzküvette in der Probenkammer durch die sauerstoffhaltige Hämoglobin-Probenküvette und führen Sie eine optimierte Probenmessung durch. Speichern Sie sowohl die Referenz- als auch die Probenmessungen separat.

Berechnen Sie anhand der folgenden Gleichung die Extinktion A, indem Sie die Referenzmessung als I0 und die Probenmessung als I behandeln.Öffnen Sie für die Nachbearbeitung eine Datenanalysesoftware wie MATLAB, und laden Sie die Absorptionsmessungen, die aus verschiedenen Bereichen des Spektrums erfasst wurden. Wenden Sie einen Multiplikationsfaktor auf einen Spektralbereich an, um verschiedene Bereiche mit unterschiedlichen Probenkonzentrationen oder Weglängen zusammenzufügen. Das sauerstoffhaltige Hämoglobinspektrum zeigte eine starke Korrelation mit einem von Prahl veröffentlichten Spektrum, mit deutlichen Absorptionsspitzen bei 415 Nanometern und einem Dublett zwischen 540 und 575 Nanometern im sichtbaren Bereich, zusammen mit einem breiten Absorptionsmerkmal zwischen 800 und 1.100 Nanometern im nahen Infrarot.

Im kurzwelligen Infrarotbereich. Das sauerstoffreiche Hämoglobinspektrum zeigte eine geringe Absorption, was wahrscheinlich auf den Restwassergehalt zurückzuführen ist. Das sauerstoffarme Hämoglobinspektrum zeigte eine starke Korrelation mit dem Prahl-Spektrum, mit markanten Peaks bei 430 Nanometern, 560 Nanometern und 760 Nanometern und kleineren Peaks um 1.200 Nanometer und zwischen 1.400 und 1.600 Nanometern.