Name: Herstellung und Markierung von Mikrobläschen mit fluoreszierenden und radioaktiven Tracern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung und Markierung von Mikrobläschen mit fluoreszierenden und radioaktiven Tracern für die Krebsbildgebung. Diese Methode erreicht über 95% Markierungseffizienz ohne Reinigungsschritte.

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Mikrobläschen sind mikrometergroße supramolekulare Theranostika mit einem Gaskern, der durch ein Protein, Polymer oder in den meisten Fällen eine Lipidhülle stabilisiert wird (Abbildung 1A). Wenn Mikrobläschen in den Blutkreislauf injiziert werden, behalten sie Gas-Flüssigkeits-Grenzflächen bei, die durch Ultraschall für minutenlange Zeiträume vor der Auflösung ihrer Gaskerne detektiert werden können 1,2. Folglich war die erste klinische Verwendung von Mikrobläschen als Kontrastmittel für die Echtzeit-Ultraschallbildgebung3. Die Erfindung des therapeutisch fokussierten Ultraschalls (FUS) erweiterte den klinischen Nutzen der Mikroblase. Bei Stimulation durch niederfrequente FUS oszillieren Mikrobläschen und erzeugen gezielte, abstimmbare mechanische Kräfte, die von der transienten Gefäßpermeabilisierung bis zur fokalen Gewebeablation reichen 4,5. Infolgedessen wurde in den letzten 20 Jahren die Mikrobläschen-FUS für die Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS), die Verabreichung von Tumoren (z. B. Bauchspeicheldrüsen-, Hirn- und Lebermetastasierungen), die Verabreichung von Medikamenten und bildgebenden Sonden, die Therapie neurodegenerativer Erkrankungen und die Krebsablationerforscht 6,7,8,9,10,11.
Das theranostische Arsenal der Mikrobläschen entwickelt sich weiter in neue und aufregende Richtungen. Herkömmliche Mikrobläschen-FUS-Verabreichungsanwendungen beruhen auf der gleichzeitigen Verabreichung von therapeutischer oder bildgebender Fracht neben kommerziellen Mikrobläschen. Es besteht ein wachsendes Interesse an der Verbesserung der Mikroblasen-FUS-Verabreichungsfähigkeiten durch das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Mikroblasenhülle und biologischer Hülle, die Erforschung maßgeschneiderter nichtkommerzieller Mikroblasenformulierungen und die Erzeugung von all-in-one theranostischen Mikrobläschen mit Fracht, die direkt auf die Mikroblasenhüllegeladen wird 12,13,14. Tatsächlich verwenden etwa 40 % der Studien zur Verabreichung von Lipid-Mikrobläschen solche schalenbeladenen Mikrobläschen15. Über die Bildgebung und die Verabreichung von Medikamenten hinaus hat sich Mikroblasen-FUS auch als vielversprechend erwiesen, um die Strahlentherapie bei Krebszu verbessern 16 und die antineoplastische Wirkung von ansonsten gutartigen schalenbeladenen Wirkstoffen durch die sonodynamische Therapie zu aktivieren17,18.
Diese konventionellen und erweiterten Richtungen bei Mikrobläschenkrebsanwendungen können strategisch weiter vorangetrieben werden, indem Mikrobläschenschalen mit radioaktiven Tracern markiert werden. Im Bereich der All-in-One-Fracht-beladenen Mikrobläschen erleichtert eine solche Radiomarkierung 1) die quantitative Bewertung der On- und Off-Target-Bioverteilung dieser beladenen Mikrobläschenschalen nach Goldstandard, leitet 2) pharmakokinetische Struktur-Wirkungs-Beziehungen ab, die eine optimale Auswahl der Mikroblasenzusammensetzungen ermöglichen, um die On-Target-Abgabe zu maximieren, und 3) leitet eine strategische und geeignete bildgesteuerte Anwendungs- und Behandlungsplanung (z. B. Arten von Gewebetargets, Dosimetrie, Medikamentenauswahl zur Minderung von Sicherheitsbedenken außerhalb des Ziels, Nutzen im Vergleich zu herkömmlichen Co-Treatment-Paradigmen) von All-in-One-Cargo-Loaded-Systemen15,19. In einem präklinischen Stadium kann ein solches Verständnis des Schicksals von Mikrobläschenschalen auch breitere Wirkmechanismen von Mikrobläschen-FUS aufklären. So wurde beispielsweise gezeigt, dass der Lipidtransfer von Mikrobläschenschalen zu Zielzellen die FUS-aktivierte Sonoporation beeinflusst12,20. Das Verständnis und die Optimierung eines solchen Transfers können daher präklinische und klinische Mikroblasen-FUS-Therapien beeinflussen, bei denen Sonoporation eine Rolle spielt (in vitro Transfektion, Wirkstoffabgabe, Tumorablation, Strahlensensibilisierung und sonodynamische Therapie 20,21,22,23,24,25). Duale Ultraschall- und Radiobildgebungsgeräte würden auch die Öffnung von FUS-Gefäßen und die Überwachung der Behandlung (z. B. BHS-Öffnungskinetik) mit einem einzigen Wirkstoff anstelle herkömmlicher Dual-Agenten-Designs ermöglichen26. In gleicher Weise könnte die Lipid-Mikrobläschen-Radiomarkierung als All-in-One-Alternative zu Mikroblasen-FUS + Radiopharmaka als All-in-One-Alternative zu Mikroblasen-FUS + radiopharmazeutischen Co-Delivery-Plattformen dienen27.
Die Zerbrechlichkeit von Mikrobläschen ist eine unerhebliche Herausforderung für eine solche Kennzeichnung. Alle bestehenden Radiomarkierungsstrategien sind durch Reinigungsmethoden eingeschränkt, von denen bekannt ist, dass sie die Stabilität und Größe der Mikroblase stören, während einige auch eine ineffektive und instabile Radiomarkierung aufweisen 28,29,30,31,32. Die Anforderungen an die Reinigung führen auch zu langwierigeren Protokollen. In Kombination mit der Verwendung kurzlebiger Radioisotope (z. B. 18F t1/2 1,8 h,28,29 99mTc t1/2 6 h,3268Ga t1/2 1 h31) führt dies zu Ineffizienzen im Zusammenhang mit dem Radioisotopenzerfall und schränkt die Zeitrahmen für die Röntgenbildgebung und die Behandlungsplanung ein. Zusammengenommen bergen diese Einschränkungen das Risiko einer verkürzten und nicht repräsentativen Röntgenbildgebung, ungenauer pharmakokinetischer Daten und einer ineffizienten Abgabe von Tumorradioisotopen.  
In diesem Bericht werden diese Einschränkungen durch die Nutzung der starken und stabilen Metallchelatisierungsfähigkeiten von Porphyrin überwunden. Porphyrine sind organische, heterocyclische Makromoleküle mit einem hochkonjugierten planaren Ring und einer zentralen Koordinationsstelle, die eine Vielzahl von Metallen aufnehmen kann. Dazu gehören langlebige Radioisotope wie Kupfer-64 (t1/2 12,7 h), ein Radiopharmakon mit Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und γ-Zähl-Machbarkeiten33. Wenn Porphyrine an ein Lipidrückgrat konjugiert werden, können sie leicht in supramolekulare Strukturen eingebaut und anschließend mit Kupfer-64 mit Geschwindigkeit, hoher Chelateffizienz und Serumstabilität markiert werden, während die Eigenschaften der unmarkierten Ausgangspartikelbeibehalten werden 33,34. Darüber hinaus sind Porphyrine fluoreszenzaktiv mit modularer Selbstlöschung in Nano- und Mikropartikeln, die bei Partikelaufschluss wiederhergestellt wird; eine ergänzende Auslesung zu PET und γ-Zählen, die sowohl die Analyse des Verbleibs von Schüttgütern als auch von mikroskopischen Schalen ermöglicht (Abbildung 1A)15.
Durch die Verwendung von Porphyrin-Lipid als Chelator wurden diese Eigenschaften genutzt, um eine neue, aufreinigungsfreie Eintopf-Methode zur Radiomarkierung von Mikrobläschen zu entwickeln (Abbildung 1B, C), die die Einschränkungen bestehender Methoden zur Radiomarkierung von Mikrobläschen überwindet. Dieses Protokoll erreicht eine Kupfer-64-Chelateffizienz von &gt;95 %, erfordert keine Reinigung nach der Markierung und bewahrt die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Mikroblase. Es kann leicht in die "grundlegende" Herstellung von Lipid-Mikrobläschen integriert werden, bevor diese aktiviert werden (Abbildung 1B). Es ist vielseitig und kann erfolgreich auf kundenspezifische und kommerzielle Mikroblasenformulierungen mit unterschiedlicher Acyllipidkettenlänge (C16 bis C22), Ladung (neutral und anionisch) und Porphyrin-Lipid-Zusammensetzungen (1 mol %, 10 mol %, 30 %) angewendet werden, wodurch Mikrobläschen mit Radio- und Fluoreszenzaktivität erzeugt werden. Seine Anpassungsfähigkeit kann auch über Porphyrin hinausgehen. Das Ein-Topf-Protokoll kann modifiziert werden, um alternative kommerziell erhältliche Chelatoren (z. B. Diethylentriaminpentaacetat (DTPA)-Lipid) und Fluorophore (z. B. DiI) zu verwenden. Es kann auch modifiziert werden, um vorgefertigte Mikroblasenformulierungen durch einen "Spiking"-Ansatz zu kennzeichnen. Dementsprechend ermöglicht dieses Verfahren die Herstellung von maßgeschneiderten, rückverfolgbaren (Radio-, Fluoreszenz- oder dualen Radio-/Fluoreszenz-Aktiven) Mikrobläschen, die für die Weiterentwicklung mechanistischer, bildgebender und therapeutischer Mikroblasen-FUS-Anwendungen nützlich sind. Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung von Lipid-Mikrobläschen, die Anwendung des Ein-Topf-Radiomarkierungsprotokolls, die erforderliche Radiomarkierung und die Charakterisierung physikalisch-chemischer Eigenschaften sowie mögliche Modifikationen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67431/67431fig01v4.jpg"> 
Abbildung 1: Protokoll zur Herstellung von Mikrobläschen und zur radioaktiven Markierung. (A) Porphyrin-Lipid in Form von Pyropheophorbid-a-Lipid dient als multimodaler Chelator innerhalb dieses Protokolls. Als Monomer, das an Kupfer-64 (i) chelatisiert ist, verfügt es über PET- und Bildgebungsfunktionen. Seine Fluoreszenz wird in Partikelform (Mikrobläschen (ii) und ihre Nanoprogenien nach der Auflösung (iii)) gelöscht und nicht mit Partikelaufschluss (iv) gelöscht. (B) Das in diesem Bericht beschriebene Protokoll zur Hydratation/Aktivierung von Lipidfilmen zur Erzeugung von Lipidmikrobläschen aus dem Boden und (C) die Integration der Eintopf-Radiomarkierung zwischen der Bildung der Lipidsuspension und der Aktivierung der Mikroblase. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Rajora et al.15 angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67431/67431fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>64CuCl2</td><td>Washington University School of Medicine, Mallinckrodt Institute of Radiology</td><td>N/A</td><td>Bestellung in kleinem Volumen (< 10 & Mikro; L) gelöst in 0,1 N HCl</td></tr><tr><td>Essigsäure&nbsp;</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>&ge; 95% Reinheit</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Reinheit: &ge; 98%</td></tr><tr><td>Waage - analytisch</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Kann bis zu 0,1 mg messen</td></tr><tr><td>Badsonicator</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Kann auf 69 oC</td></tr><tr><td>CC-Apertur - 30 Mikron erhitzt werden</td><td>Beckman Coulter</td><td>A36391</td><td>Partikeldurchmesserbereich: 0,6-18 μm</td></tr><tr><td>CC-Elektrolyt</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td>Isoton II Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>CC Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>Multisizer 4e</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenfiltereinheiten (0,5 mL 30.000 MWCO) mit kompatiblen Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC503096</td><td>Amicon Ultra - 0,5 mL</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen - 15 mL mit Verschlüssen</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Reinheit: &ge; 99,8%&nbsp;</td></tr><tr><td>Coulter Zähler</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43905</td><td>Multisizer 4e Coulter Counter</td></tr><tr><td>Cover Slips</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td>VWR Micro Cover</td></tr><tr><td>Glas CuCl2</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Sicherstellen nicht oxidiert</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küvetten- Quarts, 1 cm Weglänge</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küvetten - 10 mL Kunststoff für CC-Messungen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A35471</td><td>Coulter Counter Accuvette ST</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Kann durch ein Reinstwasseraufbereitungssystem</td></tr><tr><td>DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat)</td> bezogen werden. Jedes <td>Unternehmen</td><td></td><td>Pulverform</td></tr><tr><td>Dosiskalibrator</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Kann Kupfer-64 lesen</td></tr><tr><td>DPPA (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphat (Natriumsalz))</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>830855P</td><td>Pulver Form</td></tr><tr><td>DPPC (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850355P</td><td>Pulver Form</td></tr><tr><td>DPPE-MPEG (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(Polyethylenglykol)-5000] (Ammoniumsalz))</td><td>Avanti Polar Lipide</td><td>880200P</td><td>Pulverform</td></tr><tr><td>DTPA-Lipid (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-diethylentriaminpentaessigsäure (Ammoniumsalz))</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>790106P</td><td>Pulverform</td></tr><tr><td>EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gamma-Zähler</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Kann Kupfer-64</td></tr><tr><td>lesen Gamma-Zählrohr Druckkappen</td><td>Globe Scientific</td><td>22-171-665</td><td>Flansch Stopfen für 12 mm Röhrchen</td></tr><tr><td>Gamma-Zählröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>55.1579</td><td>5 mL, 75 x 12 mm, PS</td></tr><tr><td>Glasbecher - 250 mL</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td> Kann <td>Temperaturen bis zu 100 oC</td></tr><tr><td>aushalten Glastrockenschrank</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Kann auf 80 oC erhitzt</td></tr> werden <tr><td>Mikroliterspritzen aus Glas - 25, 50, 100, 1000 &Mikro; L</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Kompatibel mit organischen Lösungsmitteln</td></tr><tr><td>Szintillationsfläschchen aus Glas - 20 mL</td><td>VWR</td><td>66022-081</td><td>VWR&reg; Szintillationsfläschchen, Borosilikatglas, mit Schraubverschlüssen, mit Zellstofffolienauskleidung</td></tr><tr><td>Glasfläschchen - 0,5 Dram</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>VWR Fläschchen 1/2 dram, mit schwarzem Phenol-Schraubverschluss und polyvinylbeschichteter Zellstoffauskleidung</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757-1L</td><td>Reinheit:&nbsp; &ge; 99,0%&nbsp;</td></tr><tr><td>Graduierte Pipette/Pistole</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heiz-/Rührplatte</td><td></td><td></td><td>Ausgestattet mit Temperaturfühler für automatische Temperaturregelung</td></tr><tr><td>Salzsäure - 0,1 N</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTLC-Platten</td><td>Agilent</td><td>A120B12</td><td>&nbsp; iTLC-SA Chromatographie-Papier</td></tr><tr><td>Laborgewebe</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medien Vakuumfiltrationseinheit</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>0,22 Mikron Porengröße, PES-Membran, 500 mL Trichterkapazität</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Reinheit: &nbsp; &ge; 99,8%, HPLC-Qualität, erfüllt die ACS-Spezifikationen</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen unsteril - 1,5 mL</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen steril - 1,5 mL</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten - p1000, p200, p20, p10</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Stellen Sie sicher, dass kalibriert sind</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Superfrost Plus Objektträger Vorgereinigte</td></tr><tr><td>Nadeln - 18 g</td><td></td><td></td><td>steriler</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>DPBS, modifiziert, ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkultur</td></tr><tr><td>PFP</td><td>FluoroMed</td><td>APF-N40HP</td><td>Reinheit:&nbsp; &ge; 99,8%</td></tr><tr><td>PFP-Leitung</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>1/4 Zoll Durchmesser Kunststoffschlauch ca. 50 cm lang</td></tr><tr><td>geschnitten PFP-Regler</td><td>Swagelok</td><td>SS-1RF4 und SS-4HC-1-4</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Standards 4 und 7</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen für p1000, p200, p10 - unsteril</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen für p1000, p200, p10 - steril</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffspritze - 1 mL</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Steriles</td></tr><tr><td>Propylenglykol</td><td>BioShop</td><td>PRO888.500</td><td>Reinheit:&nbsp; &ge; 99,5%</td></tr><tr><td>Pyro-Lipid</td><td>N/A</td><td></td><td>Made in house</td></tr><tr><td>Pinzetten mit Gummispitze</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Mix aus feinen und flachen/quadratischen Kanten empfohlen</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid - 1 N</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid - 10 N</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorometer</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Geeignet für 410 nm Anregung und 600-850 nm Emission</td></tr><tr><td>Spektrofluorometrie-Software</td><td>Horiba</td><td>FluorEssence</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometer</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritze - 1 mL</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Einweg-Spritzenvorsatzfilter aus Kunststoff - 0,2 Mikron Porengröße</td><td>Beliebig Unternehmen</td><td></td><td>Membranmaterial: PES oder anderes, das mit Ammoniumacetat/Essigsäure und PBS-Reagenzglas kompatibel</td></tr><tr><td>ist - 10 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikator / Vakuum</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>Lantheus Medical Imaging</td><td>515030-0508</td><td>Im Protokoll als mechanischer Fläschchenschüttler bezeichnet</td></tr><tr><td>Wiegen Papier</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td>Um Produktverluste zu vermeiden, wird empfohlen, das Wägepapier in 3x3 cm große Quadrate zu schneiden</td></tr></tbody></table>

herstellung und markierung von mikrobläschen mit fluoreszierenden und radioaktiven tracern

Fabricating and Labeling Microbubbles with Fluorescent and Radioactive Tracers

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Herstellung und Markierung von Mikrobläschen mit fluoreszierenden und radioaktiven Tracern

Microbubbles are lipid-shelled, gas-filled particles that have evolved from vascular ultrasound contrast agents into revolutionary cancer therapy ...

fabricating-labeling-microbubbles-with-fluorescent-radioactive

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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