Herstellung und Markierung von Mikrobläschen mit fluoreszierenden und radioaktiven Tracern

Mikrobläschen sind gasgefüllte, ultraschallempfindliche Partikel mit einzigartigen Bildgebungs- und Therapiemöglichkeiten bei Krebs. Ihre sich entwickelnden Dienstprogramme können strategisch weiterentwickelt werden, indem anwendungsgesteuerte, rückverfolgbare Mikroblasen aufgebaut werden. Unser Ziel ist es, dieses Ziel zu erreichen, indem wir ein Herstellungsprotokoll für Lipid-Mikrobläschen entwickeln, das die anpassbare Erzeugung von unmarkierten, radioaktiv markierten, fluoreszierenden und multimodalen Mikrobläschen ermöglicht.

Eine effiziente und stabile Mikroblasen-Radiomarkierung zu erreichen, ist eine nicht triviale Herausforderung. Lipid-Mikrobläschen sind zerbrechlich, so dass sie Hitze, Zeit und Reinigungsschritten bei der Radiomarkierung nach der Herstellung ausgesetzt werden können, was ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften und ihre Stabilität beeinträchtigen kann. Auf der anderen Seite erfordert die Vorfertigung von Funkmarkierungen spezielle Geräte und eine erhöhte Strahlenbelastung.

Wir überwinden diese Herausforderungen, indem wir ein neues Hybridprotokoll entwickeln, bei dem die Radioisotopenchelatbildung vor der Aktivierung der Mikroblase, aber nach der Bildung der Lipidsuspension erfolgt. Dieser Ein-Topf-Ansatz ermöglicht zum ersten Mal eine hocheffiziente, aufreinigungsfreie Mikroblasen-Radiomarkierung, die die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Partikel beibehält. Ein wesentlicher zusätzlicher Vorteil ist die Vielseitigkeit des Protokolls. Es kann bei der Herstellung von kundenspezifischen Mikroblasen von Grund auf eingearbeitet und an vorgeformte Mikroblasen-Lipidsuspensionen, wie sie im Handel erhältlich sind, angepasst werden. Es kann erfolgreich auf verschiedene Lipid- und Chelatorzusammensetzungen von Mikrobläschen angewendet werden und kann dementsprechend maßgeschneiderte radioaktive, fluoreszierende oder trimodale Mikrobläschen erzeugen.

Zusammen ermöglichen diese Eigenschaften eine multimodale repräsentative Rückverfolgung von Mikroblasen-Lipidhüllen, die mechanistische Erkenntnisse verbessern und die Weiterentwicklung von mikroblasenfokussierten Ultraschalltherapien in vielen Bereichen unterstützen kann, einschließlich pharmakokinetischer Mikroblasenstudien, multimodaler Bildgebung, Behandlungsplanung und der Ermöglichung synergistischer Therapien.

[Erzähler] Um mit der Verwendung einer Mikropipette zu beginnen, geben Sie einen Milliliter AA-PGG-Lösung entlang der Ränder des Mikroblasen-Lipidfilms Ihrer Wahl in ein Fläschchen, um Blasenbildung zu vermeiden. Decken Sie die Öffnung der Durchstechflasche teilweise mit der Kappe ab und lassen Sie genügend Platz zum Einführen der Perfluorpentan- oder PFP-Leitung. Fließen Sie PFP 20 Sekunden lang über der Flüssigkeit in den Kopfraum des Fläschchens und verschließen Sie das Fläschchen. Tauchen Sie die untere Hälfte des Fläschchens eine Minute lang in ein 70 bis 80 Grad Celsius heißes Wasserbad. Dann beschallen Sie das Fläschchen 30 Sekunden lang in einem 69 Grad Celsius heißen Bäder-Ultraschallgerät. Wischen Sie das Fläschchen nach der Beschallung ab und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen. Füllen Sie den Kopfraum der Durchstechflasche mit PFP-Gas auf. Verschließen Sie dann das Fläschchen und versiegeln Sie die Ränder mit Parafilm. Um ein 60 Grad Celsius heißes Wasserbad in einer Kristallisationsschale einzurichten, legen Sie einen magnetischen Rührstab in die Schüssel und positionieren Sie ihn auf einer temperaturgesteuerten Heißrührplatte. Führen Sie eine Thermosonde in das Wasser ein, um die Temperatur zu überwachen, und stellen Sie die Rührgeschwindigkeit so ein, dass ein schwacher, aber sichtbarer Trichter entsteht. Ein verschlossenes Fläschchen, das Kupfer 64 in Form von Kupferchlorid in 0,1 % normaler Salzsäure enthält, wird mit einer Pinzette in einen Dosiskalibrator überführt. Notieren Sie die Kupfer-64-Aktivität und die Zeit. Nehmen Sie die Durchstechflasche mit einer Pinzette aus dem Dosiskalibrator und stellen Sie sie in einen bleihaltigen Behälter. Um den Wert in Megabecquerel pro Milliliter zu berechnen, dividiert man die auf dem Dosiskalibrator notierte Aktivität durch das Volumen von Kupfer 64. Öffnen Sie die Kappe der Lipidsuspension und befestigen Sie sie in einem Fläschchenhalter. Lösen Sie dann die Kappe des Kupferfläschchens 64 und fassen Sie es mit einer Pinzette an. Mit einer Mikropipette wird ein Volumen der Kupfer-64-Lösung, das einer Aktivität von 40 bis 250 Megabecquerel entspricht, in die Lipidsuspension übertragen. Drehen Sie die radioaktive Lipidsuspension mit einer flachen Zange mit Gummispitze mindestens fünfmal auf und ab, um das Kupfer 64 in die Suspension zu mischen. Während das Fläschchen mit der rechten Seite nach oben zeigt, schnippen Sie vorsichtig mit der Kappe, während Sie das Fläschchen stabilisieren. Lösen Sie die Kappe der Durchstechflasche vorsichtig teilweise und führen Sie eine mit einer Nadel versehene PFP-Leitung ein. Füllen Sie den Kopfraum des Fläschchens 20 Sekunden lang mit PFP. Dann verschließen und verschließen Sie das Fläschchen mit Parafilm. Messen Sie die Aktivität der Durchstechflasche mit einem Dosiskalibrator und notieren Sie die Zeit. Stellen Sie dann das Fläschchen in einen Schaumstofffläschchenhalter, so dass die untere Hälfte des Fläschchens der Hitze ausgesetzt ist. Tauchen Sie die Halterung in das 60 Grad Celsius heiße Rührwasserbad und erhitzen Sie sie eine Stunde lang. In der Zwischenzeit schneiden Sie zur Vorbereitung der iTLC-Streifen Glasmikrofaser-Chromatographiepapier in Streifen. Erhitzen Sie die Streifen in einem 80 Grad Celsius heißen Glastrockenofen, um sie zu aktivieren. Nehmen Sie das Fläschchen nach einer Stunde aus dem Wasserbad und wischen Sie die Ränder mit Seidenpapier ab. Drehen Sie das Fläschchen mit einer Pinzette mit Gummispitze auf und ab. Während sich das Fläschchen in einer aufrechten Position befindet, schnippen Sie mit der Kappe, während Sie das Fläschchen stabilisieren. Entfernen Sie den Parafilm und wischen Sie um die Kappe herum, um eingeschlossenes Wasser zu entfernen. Spotten Sie ein bis zwei Mikroliter der Lipidsuspension einen Zentimeter von der unteren Mitte eines aktivierten iTLC-Streifens entfernt. Lassen Sie die Stelle trocknen. Geben Sie mit einer Mikropipette 200 Mikroliter iTLC-Eluent in den Boden eines 10-Milliliter-Reagenzglases. Bewahre das Rohr in einem Bleibehälter auf. Geben Sie den gefleckten iTLC-Streifen in das Röhrchen und lassen Sie ihn sich entwickeln, bis der Eluent etwa einen Zentimeter von der Oberseite des Streifens entfernt ist. Entfernen Sie anschließend mit einer Pinzette den entwickelten Streifen und halten Sie ihn senkrecht. Schneiden Sie den Streifen über gamma-konterkompatiblen Fünf-Milliliter-Kunststofftuben in Drittel. Setze die Druckkappen in die Röhrchen ein. Messen Sie den Streifen mit den Rohren und ein leeres Kontrollrohr mit einem Gamma-Zähler, um die Kupfer-64-Aktivität zu erkennen. Zeichnen Sie die Zählungen pro Minute auf und subtrahieren Sie die Aktivität des Steuerrohrs von den anderen Messwerten, um die Hintergrundstrahlung zu korrigieren. Berechnen Sie dann die radiochemische Reinheit auf der Grundlage der korrigierten Zählungen pro Minute. Öffnen Sie als Nächstes den Deckel des radioaktiv markierten Lipidsuspensionsfläschchens und geben Sie 8,89 Mikroliter eines normalen Natriumhydroxids in die Suspension. Klopfen Sie nach dem Verschließen und Drehen des Fläschchens vorsichtig auf das Fläschchen, um die eingeschlossene Suspension im Verschlussraum zu entfernen, und füllen Sie den Kopfraum mit PFP-Gas. Stellen Sie das Fläschchen auf einen mechanischen Schüttler und aktivieren Sie es 45 Sekunden lang bei 4.530 U/min, um eine milchige Mikroblasensuspension zu erzeugen. Nach dem passiven Abkühlen auf Raumtemperatur das Fläschchen vorsichtig umdrehen, um die Mikroblasensuspension wieder zu resuspendieren. Stellen Sie die Durchstechflasche auf eine ebene Fläche und warten Sie zwei Minuten. Rüsten Sie in der Zwischenzeit eine Ein-Milliliter-Kunststoffspritze mit einer 18-Gauge-Nadel aus und entlüften Sie die Spritze, indem Sie Luft ein- und ausströmen. Nach zwei Minuten öffnen Sie den Deckel des Fläschchens schnell und ziehen 400 bis 550 Mikroliter der Suspension vom Boden des Fläschchens ab. Wischen Sie vorsichtig über die Ränder der Nadel und geben Sie die Mikroblasensuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Messen Sie nach dem Verschließen des Röhrchens die Aktivität des endgültigen Mikroblasenprodukts auf einem Dosiskalibrator und notieren Sie die Zeit. Dividieren Sie den Aktivitätswert durch das dekantierte Volumen, um die Aktivität in Megabecquerel pro Milliliter zu erhalten. Geben Sie zunächst 10 bis 200 Mikroliter der Mikroblasensuspension in eine Zentrifugenfiltereinheit mit einem Cutoff-Fassungsvermögen von 0,5 Millilitern und 30.000 Molekulargewicht in einem kompatiblen Mikrozentrifugenröhrchen. Die Suspension wird bei 12.000 g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Schneiden Sie anschließend mit einer Schere die Verbindung zwischen dem Mikrozentrifugenröhrchen und seiner Kappe ab. Setzen Sie die Kappe in ein 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen mit der Aufschrift CAPS ein. Übertragen Sie die Filtereinheit in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung TUBE 2. Das erste Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Überstand in ein 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen mit der Aufschrift TUBE 1 geben. Geben Sie 200 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser in die Filtereinheit in TUBE 2. Zentrifugieren Sie die Filtereinheit erneut bei 12.000 G für 10 Minuten. Nach dem letzten Transfer der Filtereinheit 200 Mikroliter destilliertes Wasser in die Filtereinheit in TUBE 3 geben und zentrifugieren. Schneiden Sie nach der Zentrifugation die Kappe des Röhrchens ab, geben Sie sie in das Kappen-Szintillationsfläschchen und übertragen Sie die Filtereinheit in ein neues 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen mit der Bezeichnung UNIT. Legen Sie TUBE 3 in ein neues 20-Milliliter-Glasszintillationsfläschchen. Verschließen Sie die fünf Szintillationsfläschchen und bereiten Sie ein leeres und verschlossenes Szintillationsfläschchen als Blindkontrolle vor. Messen Sie die sechs Szintillationsfläschchen auf einem Gamma-Zähler, um die Aktivität von Kupfer 64 nachzuweisen. Subtrahieren Sie die Blindsteuerung von den anderen Fläschchenmessungen. Berechnen Sie die Radiomarkierungs- oder Chelateffizienz.