Name: Fortschritte bei humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die von chimären Antigenrezeptoren abgeleitet werden und natürliche Killerzellen exprimieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung von CAR-NK-Zellen aus humanen iPSCs zur Krebsimmuntherapie. Dieses Protokoll ermöglicht skalierbare Produktion mit verbesserter antitumorale Aktivität und persistenz in vivo.

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<table><tbody><tr><td>aAPC&nbsp;</td><td>Dekan A. Lee Labor&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>a-MEM-Nährmedium</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>Cat#12634</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-DYKDDDDK (FLAG Tag)</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Kat#637308</td><td></td></tr><tr><td>APC-Anti-Mensch TRA-1-81&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17-8883-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD16</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Kat#302015</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD43&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Kat# 560198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD45&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Kat# 555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-GPC3</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Kat#DB100B</td><td></td></tr><tr><td>APC-NKG2D&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Kat# 558071&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 Grünes Detektionsreagenz&nbsp;</td><td>Thermo-Fischer&nbsp;</td><td>Cat#C10423</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violettes Zellproliferationskit&nbsp;</td><td>Thermo-Fischer&nbsp;</td><td>Cat#C34571</td><td>Zellverfolgung Fluoreszenzfarbstoff&nbsp;</td></tr><tr><td>CryoStor Lösung&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>https://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.html</td><td>Kryokonservierungsmedium</td></tr><tr><td>CTS NK Xpander</td><td>Gibco</td><td>A5019001</td><td></td></tr><tr><td>CTS NK-Xpander Medium</td><td>Life Technologies</td><td>Cat#A5019001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX Supplement, Pyruvat</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Humanes NK-Zellanreicherungskit&nbsp;</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>Cat#19055</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>Kat# 10437010</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CD94&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Cat#555888</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Kat#555029</td><td></td></tr><tr><td>GolgiStop&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Cat#554724</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nährstoffmischung, GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>Katze#16050130</td><td></td></tr><tr><td>Menschliches Serum&nbsp;</td><td>AB Sigma-Aldrich</td><td>Cat#BP2525100</td><td></td></tr><tr><td>NucleofectorTM Kit für menschliche Stammzellen&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>Kat# VPH-5012</td><td></td></tr><tr><td>Mensch: HePG2-Zellen&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>Kat#HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Mensch: HePG2-td-tomaten-luc-Zellen&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman Labor</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mensch: iPS-Zellen&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman Labor&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mensch: SNU-449 Zellen&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Kat#CRL-2234</td><td></td></tr><tr><td>Mensch: SNU-449-td-tomato-luc Zellen&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman Labor</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Caspase-3/7 Green Apoptose Assay&nbsp;</td><td>EssenBiowissenschaften&nbsp;</td><td>Cat#4440</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>MP Biomedicals&nbsp; Humanserum, Typ AB</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN2938249</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpress Software&nbsp;</td><td>ACEA Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805</tr><tr><td>PE/Cy7 Anti-Human-SSEA-4-Antikörper&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>330420</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD16&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Kat#560995&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD226</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Kat#559789</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD34&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Kat# 555822&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD45&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Kat# 555483&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD94&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Kat#555888&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-cy7-CD56&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 318318&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-FAS Ligand&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Kat#564261&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp30</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>Kat# 558407</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp44&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Kat#558563&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Kat#331908</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Kat#557991&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Peripheres Blut Buffy Coat&nbsp;</td><td>Blutbank von San Diego (https://www. sandiegobloodbank.org/)&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PE-TRAIL&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>Kat#565499&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO&nbsp;</td><td>Branden Moriarity Labor&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pMAX-GFP Plasmid</td><td>Lonza</td><td>N/A</td><td>GFP Positivkontrolle&nbsp;</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>Graphpad&nbsp;</td><td>Version 9</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9&nbsp;</td><td>GenScript</td><td>PX165</td><td></td></tr><tr><td>RBC-Lysepuffer (10x)</td><td>Biolegend</td><td>Cat#420301</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner bFGF basic&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systems&nbsp;</td><td>Cat#4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes BMP-4&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#120-05</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner FLT-3-Ligand&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-19</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-15&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-15</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-2&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-3&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#200-03</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-7&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-07</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes Knotenprotein</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>Cat#3218-ND-025</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante menschliche SCF&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-07</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TGF-&beta; 1</td><td>PeproTech</td><td>Cat#100-21</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes VEGF&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 100-20</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Medium</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>5270</td><td>EB-Bildung</td></tr><tr><td>Medium STEMdiff APEL2 Mittel&nbsp;</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>Cat#05270</td><td></td></tr><tr><td>Super piggyBac Transposase Expressionsvektor</td><td>SBI</td><td>Cat#PB210PA-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX AADvanced Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S10274, S10349</td><td>Dead cell Staining Solution Kit</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

fortschritte bei humanen induzierten pluripotenten stammzellen, die von chimären antigenrezeptoren abgeleitet werden und natürliche killerzellen exprimieren

Advances in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Chimeric Antigen Receptor-Expressing Natural Killer Cells

Schematische Darstellung der Differenzierung und Expansion von anti-GPC3-CAR iPSC-abgeleiteten NK-Zellen Das schematische Diagramm veranschaulicht die in vitro Differenzierung von anti-GPC3-CAR-manipulierten NK-Zellen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gewonnen wurden, und eine schematische Darstellung eines piggyBac-Vektors, der das GPC3-CAR-Konstrukt trägt. Zunächst werden unmodifizierte iPS-Zellen mit einem piggyBac-Vektor transfiziert, der für den GPC3-CAR (chi...

Fortschritte bei humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die von chimären Antigenrezeptoren abgeleitet werden und natürliche Killerzellen exprimieren

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of ...

advances-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-chimeric-antigen

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Aktivierung und Ausbau menschlichen NKT-Zellen aus losem T-Zellpopulationen mit künstlichen Antigen-präsentierende Zellen (AAPC). Die Verwendung von CD1d basierenden AAPC bietet eine standardisierte Verfahren zur Erzeugung hoher Anzahl funktioneller NKT-Zellen.

Künstliche Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC) vermittelte Aktivierung und Expansion der Natural Killer-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur ex vivo Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA tragen, werden mit Milzzellen in einem mit Interleukin-2 supplementierten Medium gemischt, um das Überleben und die Proliferation von T-Zellen zu fördern. Das Gemisch wird dann auf eine mit rekombinanten menschlichen Fibronektinfragmenten beschichtete Platte überführt und zentrifugiert, um die Fusion des Virus mit der Zelle...

Eine ex vivo-Technik zur Erzeugung tumorspezifischer chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Eine einfache und zuverlässige Methode wird hier beschrieben eine Reihe von NK-Zellfunktionen wie Degranulierung, Zytokin und Chemokin-Produktion in verschiedenen NK-Zelluntergruppen zu analysieren.

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Wir beschreiben ein quantitatives Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay-System zur Bewertung der Wirksamkeit von chimeric antigenen Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf flüssige und solide Tumorzellen abzielen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Immuneffektorzellen sowie Kombinationsbehandlungen zu bewerten.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Hier beschreiben wir eine in-vitro-Kokultur Methode rekursiv Herausforderung Tumor gezielt T-Zellen, die phänotypische und funktionelle Analyse der Antitumor-T-Zell-Aktivität ermöglicht.

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

Hier stellen wir ein Protokoll für die Genbearbeitung in primären menschlichen T-Zellen vor, das die CRISPR Cas-Technologie verwendet, um CAR-T-Zellen zu modifizieren.

Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen

Hier stellen wir eine Methode zur Erweiterung von peripheren Blut-Naturkillern (PBNK), NK-Zellen aus Lebergeweben und chimären Antigenrezeptor (CAR)-NK-Zellen vor, die aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder Nabelschnurblut (CB) stammen. Dieses Protokoll demonstriert die Expansion von NK- und CAR-NK-Zellen unter Verwendung von 221-mIL-21-Feederzellen zusätzlich zur optimierten Reinheit expandierter NK-Zellen.

Natural Killer (NK) und CAR-NK Zellexpansionsmethode unter Verwendung der membrangebundenen IL-21-modifizierten B-Zelllinie

Das vorliegende Protokoll zeigt, wie CD3−/CD45+CD56+-Zellen mit leichter Zytotoxizität von humanen Stammzellen mit expandiertem Potenzial (hEPSCs) sowohl unter 3D- als auch unter 2D-Kulturbedingungen unterschieden werden können. Dies ermöglicht eine routinemäßige phänotypische Validierung, ohne die komplexe Mikroumgebung zu zerstören.

Generierung natürlicher Killerzellen aus humanen Stammzellen mit erweitertem Potenzial

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf zur Generierung und zum Testen von humanen chimären Antigenrezeptor-regulatorischen T-Zellen (CAR-Tregs).

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Wir skizzieren ein Transfektionsprotokoll zur Herstellung von chimären Antigenrezeptor-natürlichen Killerzellen (CAR-NK), die auf pilzliche Krankheitserreger abzielen, unter Verwendung des nicht-viralen Dornröschen-Transposon-Systems. Um die antigenspezifische Aktivierung zu beurteilen, haben wir die gentechnisch veränderten Zellen mit Aspergillus fumigatus-Keimröhrchen co-kultiviert und die IFN-γ-Sekretion gemessen.

Entwicklung chimärer Antigenrezeptor-natürlicher Killerzellen zur Bekämpfung von Pilzinfektionen mit dem nicht-viralen Transposon-System von Dornröschen

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten in-vitro. Arbeitsablauf für die konsistente Messung der natürlichen, chimerischen Antigenrezeptor-vermittelten und antikörperabhängigen Zytotoxizität menschlicher natürlicher Killerzellen mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie.

Quantifizierung der NK-Zell-Zytotoxizität, verstärkt durch chimerische Antigenrezeptoren und therapeutische Antikörper mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie

Erfahren Sie die Entwicklung von CAR-NK-Zellen aus humanen iPSCs zur Krebsimmuntherapie. Dieses Protokoll ermöglicht skalierbare Produktion mit verbesserter antitumorale Aktivität und persistenz in vivo.

Fortschritte bei humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die von chimären Antigenrezeptoren abgeleitet werden und natürliche Killerzellen exprimieren (Video) | JoVE Journal

Fortschritte bei humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die von chimären Antigenrezeptoren abgeleitet werden und natürliche Killerzellen exprimieren

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