Fortschritte bei humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die von chimären Antigenrezeptoren abgeleitet werden und natürliche Killerzellen exprimieren

Der Schwerpunkt unserer Forschung konzentriert sich hauptsächlich auf die Entwicklung humaner iPSC CAR NK-Zellen mit verbesserter Anti-Tumor-Aktivität und in-vivo-Persistenz zur besseren Behandlung verschiedener bösartiger Erkrankungen. Mit diesem neuartigen CAR iPSC NK-Generationsprotokoll wollen wir beantworten, wie diese Zellen die Resistenz von Tumoren gegen Mikroumgebungen überwinden, die Wirksamkeit verbessern und eine sichere und skalierbare Produktion gewährleisten können. Zu den wichtigsten experimentellen Herausforderungen bei der Entwicklung von iPSC-abgeleiteten CAR-NK-Zellen gehören die konsistente und effiziente Differenzierung von iPSC in funktionelle Fälle, die Gewährleistung einer stabilen CAR-Expression ohne nachteilige Auswirkungen und die Verbesserung der In-vivo-Persistenz.

Darüber hinaus stehen Forscher vor Herausforderungen in Bezug auf Skalierbarkeit, Immunabstoßung und regulatorische Halterungen für klinische Anwendungen. Wir haben die iPSC-abgeleitete CAR-NK-Zellforschung erheblich vorangetrieben, indem wir eine effiziente nicht-virale CAR-Genintegration durch den Einsatz von Transposon-basierten Genmodifikationen etabliert haben. Darüber hinaus haben wir CRISPR-Cas9 auf iPS-Ebene optimiert, um Immun-Checkpoints zu löschen, TMA-Faktoren zur Verbesserung der Wirksamkeit von Zellen und Tumoren sowie der In-vivo-Persistenz in soliden Tumormodellen.

Mit unserem Protokoll, das die nicht-virale Huckepack-Vektor-vermittelte CAR-Genexpression verwendet, zielen wir darauf ab, die Lücke für die Entwicklung einer sicheren, effizienten und skalierbaren Genmodifikation für iPSC CAR NK-Zellen zu schließen. Diese Methode reduziert das Risiko einer Insertionsmutagenese und verbessert die Reproduzierbarkeit und Kosteneffizienz der Erzeugung von CAR-NK-Zellen für die Krebsimmuntherapie. In Zukunft wird sich unser Labor auf die Entwicklung neuartiger iPSC-abgeleiteter NK-Zellen konzentrieren, die auf Immun-Checkpoints abzielen. Wir werden auch untersuchen, wie wir verschiedene Mikroumweltfaktoren von Tumoren angreifen können, indem bispezifische oder trispezifische Antikörper verwendet werden, um die Spezifität in vivo, die Persistenz und die Anti-Tumor-Aktivität zu verbessern.

Um mit der Passage des Spin-Embryokörpers oder der EB-Bildung zu beginnen, werden etwa 200.000 manipulierte CAR-iPSCs pro Well in einer vorkodierten Platte mit sechs Vertiefungen aus der Basalmembranmatrix, die MT-Überschuss enthält, die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubiert, nach zwei Tagen das Kulturmedium entfernt und die Zellen abgelöst, indem sie fünf Minuten lang mit einem Milliliter vorwarmem TrypLE Select bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Dann dissoziieren Sie die Zellaggregate vorsichtig in eine Einzelzellsuspension und überführen die Suspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie drei Milliliter PBS hinzu, um die Dissoziationsreaktion zu stoppen.

Anschließend werden die Zellen wieder in MK SR-plus Medium suspendiert und durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb filtriert, um Aggregate zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Zellen. Waschen Sie das Pellet mit fünf Millilitern PBS und suspendieren Sie es dann wieder in einem Milliliter EB-Bildungsmedium.

Nach der Zählung verdünnen Sie die Zellen auf die entsprechende Dichte mit einem EB-Bildungsmedium, das Zytokine und 10 mikromolare ROCK-Inhibitoren enthält. Mit einer Mehrkanalpipette säen Sie 3000 bis 10.000 Zellen pro Well in 100 Mikrolitern EB-Medien in einer 96-Well-Platte. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 g und inkubieren Sie sechs Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Um die Körperqualität des Embryos zu überprüfen, bereiten Sie zunächst vier Milliliter vorgewärmtes 0,25%iges Trypsin mit 0,4%igem Hühnerserum vor, um die EBs zu dissoziieren. Nach sechs Tagen werden 10 bis 30 EBs in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Geben Sie Trypsin-Hühnerserumlösung zu den EBs und inkubieren Sie sie in einem Wasserbad.

Vortexen Sie die EBs während der Dissoziation alle drei bis fünf Minuten für 10 Minuten. Pipettieren Sie die trypsinisierten EBs, mischen Sie sich mehrmals auf und ab, um eine gründliche Dissoziation zu gewährleisten. Fügen Sie dann fünf Milliliter PBS hinzu, um den Trypsinisierungsprozess zu stoppen.

Filtrieren Sie die Zelllösung durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein neues konisches Rohr. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 G und suspendieren das Pellet in drei bis fünf Millilitern frischem EB-Medium erneut. Nach der Zählung färben Sie die Zellen mit typischen EB-Markern.

Geben Sie das empfohlene Volumen an Antikörpern in jedes Röhrchen, das dissoziierte Einzelzellen von EB in 100 Mikrolitern Flow-Puffer enthält, und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation zweimal mit Flow-Puffer. Fügen Sie SYTOX Blue Live Dead Stain, hinzu und analysieren Sie es mittels Durchflusszytometrie.

Beginnen Sie damit, jede Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen mit fünf bis 10 Mikrolitern einer 2%igen sterilisierten Gelatinelösung zu codieren. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für zwei bis vier Stunden. Nach der Inkubation aspirieren Sie die verbleibende Gelatinelösung und geben Sie drei Milliliter des natürlichen Killer- oder NK-Differenzierungsmediums, das Zytokine enthält, in jede Vertiefung der gelatinebeschichteten Sechs-Well-Platte.

Übertragen Sie anschließend mit einer Ein-Milliliter-Pipette vorsichtig Spin-EBs, die aus technisch hergestellten CAR-iPSCs gewonnen wurden, in eine 10-Zentimeter-Schale. Geben Sie drei Milliliter NK-Differenzierungsmedium, das Zytokine enthält, in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte. Mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette werden 16 bis 20 EBs in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte verteilt und drei bis vier Wochen lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Nach der Inkubation wird die Expression der NK-Zellmarker CD45 positiv und CD56 mittels Durchflusszytometrie an Suspensionszellen untersucht. Wenn mehr als 80 % der Suspensionszellen CD45-positiv und CD56-positiv exprimieren. Ernten Sie die Zellen, indem Sie sie durch einen 70-Mikrometer-Filter leiten, um Klumpen zu entfernen.

Vor der Co-Kultivierung künstlicher antigenpräsentierender Zellen oder künstlicher APCs innerhalb von NK-Zellen bestrahlen die künstlichen APCs mit 100 Gray und konservieren sie als gefrorene Stängel. Nach der Ernte von NK-Zellen kultivieren Sie sie bei einer Dichte von fünfmal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter in NK-Expansionsmedium, ergänzt mit 50 Einheiten pro Milliliter Interleukin-2 und Interleukin-15. Geben Sie aufgetaute, bestrahlte künstliche APCs im Verhältnis eins zu eins zu den NK-Zellen und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Schalten Sie zunächst das Durchflusszytometer ein. Bewerten Sie die Expression des NK-Aktivierungsrezeptors auf den von Anti-GPC3-CAR-iPSCs abgeleiteten NK-Zellen, um die Aktivität der CAR-Gehäusezellen und den Reifungsstatus zu bestimmen. Für die Caspase-3/7-Assays.

Zählen Sie die Zielzellen in GPC3 CAR iPSC-abgeleiteten NK-Zellen und färben Sie sie mit CellTrace Violet Farbstoff bei einer Endkonzentration von fünf Mikromolaren in PBS unter Lichtschutz für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius vor. Waschen Sie die Zielzellen der Färbung in einem vollständigen Kulturmedium Vor der Co-Kultur mit CAR iPSC-abgeleiteten NK-Zellen bei verschiedenen Effektor-Ziel-Verhältnissen bei 37 Grad Celsius. Nach drei Stunden und 30 Minuten Co-Kultur.

Caspase-3/7 grünes Nachweisreagenz zugeben und weitere 30 Minuten inkubieren. In den letzten fünf Minuten der Färbung SYTOX Lösung zum Färben von toten Zellen zugeben und vorsichtig mischen. Analysieren Sie die gefärbten Zellen mittels Durchflusszytometrie.

Die Bildung von Spin-EBs aus GPC3-CAR-modifizierten IPCs wurde am sechsten Tag beobachtet. Bestätigung der frühen Differenzierung. Differenzierte natürliche Killer- oder NK-Zellen aus GPC3-CAR-IPCs zeigten in verschiedenen Stadien vom dritten bis zum 28. Tag eine unterschiedliche Morphologie.

Die durchflusszytometrische Analyse zeigt die Expression der hämatopoetischen Antigene CD34 und CD31 sowie einer kleinen Menge an CD43, die jedoch noch kein CD45 exprimiert, sowohl in Wildtyp- als auch in GPC3-CAR-iPSCs-abgeleiteten Spin-EBs am sechsten Tag. Fallspezifisch wurden an Tag 35 Marker in reifen Wildtyp-Zellen in GPC3-CAR-iPSC-abgeleiteten NK-Zellen nachgewiesen. Bestätigung der erfolgreichen Differenzierung in NK-Zellen.

Expandierte Wildtyp- und Anti-GPC3-CAR-iPSC-abgeleitete NK-Zellen wiesen verschiedene Aktivierungsmarker auf, die die Reifung der NK-Zellen belegen. Die GPC3-Antigenexpression wurde auf Tumorzelllinien mittels Durchflusszytometrie bestätigt, wodurch die Zielspezifität für anti-GPC3 CAR iPSC-abgeleitete NK-Zellen validiert wurde. Anti-GPC3-CAR-iPSC-abgeleitete NK-Zellen zeigten eine höhere zytotoxische Aktivität gegen GPC3-exprimierende HepG2-, SNU-449-, CAL 27- und SKOV3-Zelllinien im Vergleich zu Wildtyp-iPSC-NK-Zellen.