Hochauflösende Respirometrie in einer kleinvolumigen Kammer

In dieser Studie wollen wir untersuchen, ob die auf 0,5 Milliliter kalibrierte Kammer mit kleinem Volumen in respirometrischen Assays verwendet werden kann, ohne die Genauigkeit zu beeinträchtigen, die für das klassische Zwei-Milliliter-Volumen in der Oroboros-Plattform erreicht wird.

Die Entwicklung der Kammer mit kleinem Volumen und die Auswertung durch hochauflösende Respirometrie mit strenger Qualitätskontrolle unter Verwendung der präzisen OXPHOS-Analyse ebneten den Weg für Entwicklungen, neue Innovationen, d.h. Nummer eins, ein 12-Kammer-O2k-Respirometer, Nummer zwei, ein Roboter für die automatische Titration von Substanzen in komplexen Protokollen, die für die OXPHOS-Analyse angewendet werden. Diese Anwendungen werden entscheidend für die weitere Expansion in Richtung mitochondriale Analytik, Diagnose von mitochondrialen Erkrankungen und Bewertung von Arzneimittelentwicklungen sein, wobei der Schwerpunkt sowohl auf dem Nutzen der Medikamente für die mitochondriale Funktion als auch auf Off-Target-Effekten liegt, die die mitochondriale Funktion unwillkürlich stören. Als mein Team vor mehr als 30 Jahren die hochauflösende Respirometrie entwickelte, gab es ein Paradigma, das Mitochondrien, Mitochondrien, Mitochondrien umfasste. Vielleicht gab es einen Unterschied zwischen Muskel- und Lebermitochondrien, aber das war es auch schon. Niemand interessierte sich wirklich für Mitochondrien außerhalb dieser Paradigmen. Mit unseren Protokollen, die für die hochauflösende Respirometrie entwickelt wurden, zeigten wir eine große Vielfalt an mitochondrialen Funktionen. Dies ermöglicht es uns, die mitochondriale Atmungskontrolle in verschiedenen Zelltypen, Geweben und Spezies mit einem neuen Auge zu bewerten. Vor 30 Jahren gab es etwa 10 Publikationen, die dies würdigten. Inzwischen haben wir mit unserem Instrument mehr als 1.500 Geräte, die diese Protokolle verwenden.

In der Kammer mit kleinem Volumen wird viermal weniger Probe benötigt als in der klassischen Zwei-Milliliter-Kammer. Bei Proben mit niedrigen Atemfrequenzen kann die gleiche Probenmenge verwendet werden, um die volumenspezifischen Sauerstoffflüsse zu erhöhen und die Unsicherheit der Messung zu verringern.

Der Schwerpunkt unserer Arbeit im Forschungs- und Entwicklungslabor von Oroboros liegt auf der Verbindung von instrumenteller Entwicklung und akademischer Forschung. Wir bewerten die mitochondriale Atmungsfunktion und biogenetische Profilierungen mit Multisensoranalysen. Das ist die Messung der Atmung, des Redoxpotentials, des Membranpotentials, der Kalziumaufnahme, der Wasserstoffperoxidproduktion und verschiedener anderer Parameter, die uns einen tieferen Einblick in das biogenetische Profil und die mitochondriale Funktion und Dysfunktion ermöglichen.

[Erzähler] Montieren Sie zunächst die Kammer für das kleine Volumen oder die SV-Kammer auf den Oroboros. Schalten Sie dann die Oroboros ein und klicken Sie auf Verbinden, um die Oroboros mit der DatLab-Software zu verbinden. Nachdem Sie die Kammern vollständig getrocknet haben, geben Sie mit einer Pipette 0,54 Milliliter Wasser in die SV-Kammer. Schalten Sie dann die Rührwerke ein. Befeuchten Sie vor dem Schließen der Kammer die O-Ringe der Stopfen und halten Sie die Kapillare trocken. Lösen Sie den Volumenkalibrierring und setzen Sie den Stopfen nach unten ein, bis Flüssigkeit die Stopfenkapillare füllt und sich in der Aufnahme am oberen Kapillarende ein Meniskus bildet. Ziehen Sie den Volumenkalibrierring fest, um seine Position zu sichern und die kalibrierte Volumenkonsistenz für aufeinanderfolgende Einfügungen zu gewährleisten. Füllen Sie zunächst die Kammern mit dem Beatmungsmedium MiR05 Starten Sie die DatLab-Software. Wählen Sie das passende Protokoll für den instrumentellen Hintergrundtest aus. Stellen Sie die Rührdrehzahl auf 550 U/min, das Kammervolumen auf 0,5 Milliliter, das Datenaufzeichnungsintervall auf zwei Sekunden und die Versuchstemperatur auf 37 Grad Celsius ein. Führen Sie den Rührertest und die Luftkalibrierung durch. Setzen Sie die R1-Markierung auf dem Sauerstoffkonzentrationsdiagramm, indem Sie den Cursor bewegen, während Sie die Umschalttaste gedrückt halten. Führen Sie gelegentlich Null-Sauerstoff-Kalibrierungen durch. Während der Luftkalibrierung wird eine frische Natriumdithionit-Stammlösung hergestellt, indem das O2-Zero-Pulver in 50 Millimolar Phosphatpuffer auf eine Konzentration von 2,5 Millimolar für das SV aufgelöst wird. Schließen Sie nach Abschluss der Luftkalibrierung die Kammer. Überwachen Sie das Sauerstoffsignal für etwa 60 bis 120 Minuten, so dass die Sauerstoffkonzentration von der Luftsättigung auf etwa 150 Mikromolar sinkt. Legen Sie vier Markierungen mit den Bezeichnungen J01 bis J04 im negativen Diagramm der Sauerstoffsteigung fest. Titrieren Sie optional mit einer Hamilton-Spritze die Natriumdithionitlösung, um die Sauerstoffkonzentration auf 100 Mikromolar einzustellen, und setzen Sie die Markierung J05. Um die Steigung des instrumentellen Sauerstoffhintergrunds in DatLab zu berechnen, wählen Sie Flusssteigung. Öffnen Sie als Nächstes das Fenster zur Korrektur des Sauerstoffhintergrunds und wählen Sie Aktive Datei als Quelle der Sauerstoffhintergrunddaten aus. Überprüfen Sie, ob alle J0-Markierungen für die Berechnung der linearen Regression verwendet werden. Klicken Sie dann auf Anwenden für die Korrektur des Sauerstoffhintergrunds. Waschen Sie zunächst die Oroboros-Kammern mit entionisiertem Wasser und geben Sie frisches MiR05-Medium in die Kammer. Öffnen Sie nach dem instrumentellen Hintergrundtest einen neuen DatLab-Tab und wählen Sie das SUIT-003-Protokoll für Experimente mit menschlichen Blutplättchen aus. Wählen Sie in der DatLab-Protokollübersicht, die in der Seitenleiste Protokoll angezeigt wird, die chemischen Stammlösungen aus. Wählen Sie dann die Hamilton-Spritzen entsprechend der Chemikalien aus. Legen Sie die Spritzen mit den Etiketten in der Reihenfolge des SUIT-Protokolls auf das Spritzengestell. Für den teilweisen Volumenaustausch ist das Volumen V äquivalent zu dem Volumen V zu berechnen, das aus dem tatsächlichen Volumen in der offenen Kammer entfernt wurde, wobei das Kapillartotvolumen berücksichtigt wird. Entfernen Sie dann den vollständig eingesetzten Stopper und legen Sie ihn auf den Rost. Entfernen Sie das berechnete Volumen V aus MiR05 aus der Kammer basierend auf dem Zelltyp und der Konzentration der Stammzellensuspension. Pipettieren Sie nun ein äquivalentes Volumen der Stammzellsuspension mit einer bekannten Zellkonzentration in die Kammer. Im Gegensatz dazu saugen Sie für einen vollständigen Volumenaustausch das gesamte Medium aus der Kammer ab. Geben Sie 0,54 Milliliter des Bestands an isolierten Herzmitochondrien in die SV-Kammer. Schließen Sie die Kammer und saugen Sie überschüssige Probenlösung aus dem Stopfenbehälter ab. Um ein SUIT-Protokoll (Substrate Uncoupler Inhibitor Titration) zu starten, öffnen Sie das Ereignisfenster in DatLab, um die Titrationsvolumina zu visualisieren. Titrieren Sie mit der Hamilton-Mikrospritze die chemischen Stammlösungen in die Kammer. Legen Sie dann das Ereignis in DatLab fest. Ermöglichen Sie die Stabilisierung des Flusses nach der Titration. Setzen Sie für die Datenanalyse eine Markierung auf dem repräsentativen und stabilen Teil des Diagramms. Der Hintergrundsauerstofffluss bei Luftsättigung war in der 0,5-Milliliter-Kammer 3,9-mal höher als in der 2,0-Milliliter-Kammer, was mit der theoretisch erwarteten vierfachen Differenz des volumenspezifischen Hintergrundsauerstoffflusses übereinstimmt. Die Variabilität der instrumentellen Hintergrundflüsse war in den beiden Kammervolumina nahezu identisch. Die Atemfrequenzen von lebenden Blutplättchen, permeabilisierten Fibroblasten und isolierten Mitochondrien waren in beiden Kammertypen eng korreliert, wenn die entsprechende Hintergrundkorrektur angewendet wurde. Der Sauerstofffluss stabilisierte sich in der Zwei-Milliliter-Kammer nach der Reoxygenierung schneller als in der 0,5-Milliliter-Kammer. Der Restsauerstoffverbrauch nach der Hemmung von Komplex III war zwischen den beiden Kammern konsistent und entsprach der instrumentellen Nachweisgrenze.