Mukoviszidose-Aggregat-Biofilm-Modell zur Untersuchung der infektionsrelevanten Genexpression

Unsere Forschung entwickelt ein aggregiertes Biofilmmodell in künstlichem Sputum, um Lungeninfektionen bei Mukoviszidose-Patienten zu replizieren. Dieses Modell ermöglicht es uns, Veränderungen der Genexpression zu analysieren und zu verstehen, warum Bakterien unter diesen Bedingungen im Vergleich zu Standard-Wirkstofftestumgebungen resistenter gegen Therapeutika werden. Die Entwicklung eines komplexen Biofilmmodells hat die Herausforderungen bei der Rekapitulation der feindlichen Lungenumgebung deutlich gemacht, was es schwierig macht, vorherzusagen, ob die antimikrobielle Wirkung in vitro mit den In-vivo-Ergebnissen übereinstimmt.

Die patientenspezifische Natur von CF-Lungeninfektionen erschwert die Entwicklung wirksamer Labormodelle zur Prüfung antimikrobieller Wirkstoffe zusätzlich. Im Rahmen dieser Forschung haben wir erfolgreich ein polymikrobielles Aggregat-Biofilmmodell erstellt, das eine Plattform zum Testen von Antibiotika in einer realistischen Umgebung bietet, das Ausmaß der Resistenz zeigt, die in diesen Biofilmen beobachtet werden kann, und das Potenzial für Antivirulenztherapien hervorhebt, die auf Komponenten wie Alginat abzielen. Ein antimikrobielles Testmodell, das die Umgebung der CF-Lunge nachahmt, wird die Lücke schließen, die zwischen In-vivo- und In-vitro-Tests besteht.

Darüber hinaus wird die Beurteilung des Viroms von Bakterien in einer Umgebung, die einer CF-Lunge näher kommt, die Entwicklung und Erprobung von Antivirulenz-Therapeutika ermöglichen. Streichen Sie zunächst eine einzelne Perle von Pseudomonas aeruginosa PAO1 aus gefrorenen Perlenstammkulturen auf die Lysogenese-Bouillonschnecke. Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Für die Herstellung eines Biofilms mit einer einzigen Spezies werden über Nacht Kulturen von Pseudomonas aeruginosa PAO1 mit einer einzigen Kolonie aus der Streifenplatte hergestellt und über Nacht 18 Stunden lang inkubiert. Verdünnen Sie dann die Kultur auf eine optische Dichte von 0,05 bei 600 Nanometern, was 1 mal 10 hoch 8 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter entspricht. Verdünnen Sie diese Kultur außerdem 1 bis 100 in SCFM2-Medium.

Geben Sie als Nächstes 180 Mikroliter des Inokulums in die Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit rundem Boden. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie 24 Stunden lang bei 75 Umdrehungen pro Minute. Wiederbelebung von Pseudomonas aeruginosa PAO1 und Staphylococcus aureus SH1000 aus gefrorenen Perlenstammkulturen, wie bereits gezeigt.

Beleben Sie Candida albican CAF 2.1 als einzelne Perle auf Sabouraud-Agar und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie über Nacht Kulturen von Staphylococcus aureus und Candida albicans mit einzelnen Kolonien aus ihren jeweiligen Streifenplatten in 5 Millilitern Lysogeniebrühe vor. Verdünnen Sie die standardisierten Kulturen, um ein einzelnes Inokulum zu bilden, das beide Spezies in den erforderlichen Konzentrationen an SCFM2 enthält.

Geben Sie dann 162 Mikroliter des gemischten Inokulums in die Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie 24 Stunden lang mit 75 Umdrehungen pro Minute, um die Bildung von Biofilmen mit mehreren Spezies zu ermöglichen. Geben Sie anschließend 14,2 Mikroliter der vorbereiteten Übernachtkultur von Pseudomonas aeruginosa in die Vertiefungen der 96-Well-Mikrotiterplatte und inkubieren Sie die Platte erneut, um die Bildung eines polymikrobiellen Biofilms zu ermöglichen.

Gewinnen Sie zunächst Biofilme mit einer und mehreren Spezies in 96-Well-Mikrotiterplatten. Um den Biofilm aufzubrechen, geben Sie 8,81 Mikroliter DNase 1-Material direkt in die Vertiefungen, die die Biofilme enthalten, und erreichen Sie eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie mit 75 Umdrehungen pro Minute.

Besorgen Sie sich eine antibiotische Stammlösung von Meropenem mit 2,56 Milligramm pro Milliliter. Führen Sie serielle Verdünnungen um den Faktor zwei durch, um einen Konzentrationsbereich von 0,01 Milligramm pro Milliliter bis 2,56 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Geben Sie nun 20 Mikroliter jeder Miropenem-Verdünnung zu den Biofilmen, um einen Dosierungsbereich von 1 Mikrogramm pro Milliliter bis 256 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen.

Versiegeln Sie die 96-Well-Mikrotiterplatte mit transparenter Folie und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, während Sie sie mit 75 Umdrehungen pro Minute schütteln. Die Pseudomonas-Biofilme einer einzigen Spezies zeigten keine signifikante Abnahme der lebensfähigen Zellen, wenn sie mit Meropenem in einer Dosierung von bis zu 256 Mikrogramm pro Milliliter behandelt wurden. Die Wiederfindung von Pseudomonas aeruginosa war in Einzeltierumgebungen um 0,74 log 10 koloniebildende Einheiten pro Milliliter höher als in polymikrobiellen Umgebungen ohne Antibiotika.

Bereiten Sie zunächst die Einzel- und Mehrspezies-Biofilme für die RNA-Extraktion vor. Übertragen Sie nach der Inkubation die Biofilme aus jeder Vertiefung in ein Ein-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, in dem die Biofilm-Replikate für jede Probe zusammengefasst werden. Das Röhrchen wird fünf Minuten lang bei 16.000 g zentrifugiert.

Wenn die RNA-Extraktion später durchgeführt wird, entfernen Sie den Überstand und lagern Sie das Pellet in 250 Mikrolitern RNA-Stabilisierungslösung bei 80 Grad Celsius. Später das Röhrchen mit Pellet bei Raumtemperatur auftauen und fünf Minuten bei 16.000 g zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in 600 Mikrolitern TRIzol-Reagenz und brechen Sie es manuell mit einer 0,2-Millimeter-Nadel auf, die an einer Zwei-Milliliter-Spritze befestigt ist, indem Sie es 5 bis 10 Mal aspirieren oder bis das Pellet vollständig aufgebrochen ist.

Befolgen Sie die Richtlinien des Herstellers, um die RNA von den gestörten Biofilmen zu reinigen. Um die gereinigte RNA zu quantifizieren, bereiten Sie die Arbeitslösung mit 199 Mikrolitern Puffer und einem Mikroliter Reagenz für jede Probe vor. Mischen Sie 190 Mikroliter der Arbeitslösung und 10 Mikroliter Standard eins und Standard zwei in separate Röhrchen.

Geben Sie dann 199 Mikroliter der Arbeitslösung und 1 Mikroliter der RNA-Probe in einzelne Röhrchen. 30 Sekunden lang vortexen und fünf Minuten lang an einem dunklen Ort lagern. Wählen Sie anschließend auf dem Fluorimeter RNA aus, gefolgt von Broad Range RNA, und befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm.

Nach der Blindablesung pipettieren Sie einen Mikroliter RNA auf den Probenhalter des Spektralphotometers und messen Sie die Absorption bei 260 x 280 Nanometern. Für die komplementäre DNA-Synthese bereiten Sie das Reaktionsgemisch in Röhrchen vor. Legen Sie die Röhrchen in einen Thermocycler und führen Sie das Programm aus.

Verwenden Sie das CDNA sofort oder lagern Sie es bei 80 Grad Celsius. Die algD-Expression in Einzelspezies-Biofilmen von Pseudomonas aeruginosa variierte nicht signifikant zwischen den Meropenem-Konzentrationen. In polymikrobiellen Biofilmen war die algD-Expression mit 256 Mikrogramm pro Milliliter signifikant höher, was auf eine erhöhte Alginatproduktion in Gegenwart von co-kolonisierenden Organismen hinweist.