Name: Erzeugung von Sphäroiden aus verschiedenen Chondrozyten unter Verwendung von niedrigadhäsiven Bedingungen unter Schwerkraft und selbstgemachten Mini-Bioreaktoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Lernen Sie die Herstellung stabiler chondrozytärer Sphäroide aus iPSCs unter niedrigadhäsiven Bedingungen in Mini-Bioreaktoren. Diese Methode unterstützt die Geweberegeneration bei chronischen Gelenkerkrankungen.

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Die Studie wurde von der Ethikkommission des LOPUKHIN FRCC PCM geprüft und genehmigt (Protokoll Nr. 2019/02 vom 9. April 2019). Alle Spenderproben wurden in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki entnommen. Die Einverständniserklärung wurde von allen Teilnehmern und/oder ihren Erziehungsberechtigten eingeholt.
HINWEIS: Behalten Sie während des gesamten Protokolls die sterile Technik bei. Erwärmen Sie alle Nährmedien und -lösungen auf 37 °C, bevor Sie sie auf Zellen oder Sphäroide auftragen. Kultivieren Sie die Zellen in einem CO2 -Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 bei 80 % Luftfeuchtigkeit. Das Protokollschema ist in Abbildung 1 dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67481/67481fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Protokoll zur Herstellung von Chondrosphären aus iPS-Linie IPSRG4S. (A) Zunächst werden iPSCs in pluripotenten Stammzellmedien kultiviert, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist. (B) Um eine Differenzierung in Richtung der chondrozytären Linie zu induzieren, werden die iPSCs dann 2 Tage lang in Medium A kultiviert. Das Medium wird anschließend durch eine Formulierung ersetzt, in der Chir 99021 und Rho-Kinase-Inhibitor fehlen, und die Zellen werden für weitere 6 Tage kultiviert, wobei das Medium alle 2 Tage gewechselt wird. (C) Die Zellen werden dann in Medium B übertragen, um die Chondrogenese für die nächsten 10 Tage zu fördern. (D) Sobald eine ausreichende Zellzahl erreicht ist, geht der Prozess in die Phase der Sphäroidproduktion über. (E) Die Zellen werden unter wenig adhäsiven Bedingungen unter der Schwerkraft zu Sphäroiden aggregiert. (F) Die resultierenden Sphäroide werden in Mini-Bioreaktoren mit Medium B kultiviert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67481/67481fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
1. Umwandlung von Petrischalen in Mini-Bioreaktoren
HINWEIS: Details in einem früheren Artikel5.
<ol>
	<li>Schneiden Sie die Zentrifugenröhrchen mit einer sterilen Autoklavenschere in 7-8 mm hohe Ringe (Autoklaveneinstellungen: 121 °C (250 °F) bei 15 psi, 30 min und Trocknung nach dem Autoklaven für 20 min).</li>
	<li>Zerkleinern Sie unbehandelte oder mikrobiologische Petrischalen mit geringer Adhäsion in kleine Stücke. Lösen Sie über Nacht etwa 1 g Kunststoffpartikel in 10 ml Chloroform auf, um eine flüssige Kunststofflösung zu erhalten. Führen Sie diesen Vorgang in einem Abzug durch.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der flüssige Kunststoff für das Pipettieren viskos genug ist. Stellen Sie sicher, dass die Tröpfchen eine kugelförmige Form behalten und sich nicht auf der Oberfläche ausbreiten. Wenn die Lösung zu dünnflüssig ist, fügen Sie weitere Kunststoffpartikel hinzu, die normalerweise 1-3 g benötigen. Wenn es zu dickflüssig ist, fügen Sie zusätzliches Chloroform hinzu, das normalerweise bis zu 5 ml benötigt.</li>
	<li>Formen Sie einen Kunststoffknauf in der Mitte einer sterilen, 60 mm Petrischale mit extrem geringer Adhäsion mit einer der beiden unten beschriebenen effektiven Methoden.<ol>
		<li>Option 1: Platzieren Sie den autoklavierten Kunststoffring in der Mitte der Petrischale und tragen Sie dann flüssigen Kunststoff in den Ring auf. Für einen Tropfen werden etwa 100-200 μl Tropfen flüssiger Kunststoff benötigt.</li>
		<li>Option 2: Tragen Sie die gleiche Anzahl von Tropfen flüssigem Kunststoff direkt in die Mitte der Petrischale auf, ohne den Kunststoffring zu verwenden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lassen Sie das Geschirr 2-3 h unbedeckt in einer Laminar-Flow-Haube trocknen. Nach dem Trocknen das Geschirr 20-30 Minuten lang ultravioletter Strahlung aussetzen.</li>
</ol>
2. Behandlung von Kulturschalen mit Gelatine
<ol>
	<li>Bereiten Sie eine 0,1%ige Gelatinelösung vor, indem Sie Gelatinepulver in destilliertem Wasser bei 95 °C auflösen. Die Lösung wird nacheinander durch 0,45 μm und 0,25 μm Membranfilter geleitet und das Filtrat dann bei 4 °C gelagert.</li>
	<li>Unmittelbar vor der Nachsaat der Chondrozyten tragen Sie die 3 ml Gelatinelösung auf den 25 cm2 Kolben auf (bis zu 15 g Knorpelgewebe pro T25-Kolben werden empfohlen). 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren, die Gelatine entfernen, zweimal mit PBS spülen und mit der Zellaussaat fortfahren.</li>
</ol>
3. Isolierung und Kultivierung von Chondrozyten
HINWEIS: Chondrozyten werden aus nicht tragenden Knorpelregionen von Patienten isoliert, die sich einem Kniegelenkersatz unterziehen. Alle Proben werden unter sterilen Bedingungen entnommen und in sterilen Röhrchen gelagert, die mit DMEM gefüllt sind, die 200 U/ml Penicillin/Streptomycin-Lösung enthalten. Knorpelgewebe im Kühlschrank bei 2-8 °C lagern.
<ol>
	<li>Beginnen Sie innerhalb von 2 Tagen nach der Knorpelentnahme mit der enzymatischen Behandlung. Waschen Sie Knorpelstücke in Hanks-Lösung mit 60-mm-Petrischalen und schneiden Sie den Knorpel dann mit einer autoklavierten Schere in Fragmente von etwa 1-2 mm Durchmesser.</li>
	<li>Übertragen Sie Knorpelstücke in 15-ml-Röhrchen und verdauen Sie sie in 0,01%iger Kollagenase-Typ-II-Lösung in DMEM, ca. 1 ml pro 1 g Knorpel, innerhalb von 8-12 h in einem CO2 -Inkubator, der auf 37 °C mit 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit eingestellt ist, unter kontinuierlichem Rühren auf einem Orbitalschüttler bei 150-200 U/min.</li>
	<li>Nach dem Aufschluss waschen Sie die Knorpelfragmente, indem Sie DMEM in ein 15-ml-Röhrchen geben, und zentrifugieren Sie dann 10 Minuten lang bei 300 × g . Die Fragmente werden in einem Chondrozyten-Nährmedium resuspendiert (Ergänzende Tabelle 1) und auf einen selbstklebenden T25-Kolben gesät, der mit 0,1%iger Gelatinelösung vorbeschichtet ist.</li>
	<li>Passage Chondrozyten, wenn eine konfluente Dichte von 80% erreicht wird.<ol>
		<li>Für die Passage werden die Chondrozyten mit Hanks-Lösung gewaschen und die Zellen dann 5 Minuten lang mit 0,25%iger Trypsinlösung bei 37 °C inkubiert.</li>
		<li>Um Trypsin zu inaktivieren, fügen Sie ein gleiches Volumen DMEM + 10 % FBS hinzu. Resuspendieren Sie Chondrozyten in frischem Kulturmedium und verteilen Sie sie dann im Verhältnis 1:3, wobei Sie 20.000-30.000 Zellen pro 1 cmaussäen 2.</li>
		<li>Der Kulturkolben wird bei 37 °C mit 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit in einen Inkubator gestellt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kultivierung von pluripotenten Stammzellen
HINWEIS: In Zusammenarbeit mit dem Stammzelllabor der Molecular Brain Research Group, Abteilung für Neurobiologie, A.I. Virtanen Institute, Universität von Ostfinnland, Kuopio, Finnland, wurde in einer früheren Studie erfolgreich eine iPSCs-Linie IPSRG4S erzeugt8.
<ol>
	<li>Kultivieren Sie iPSCs in 6-Well-Platten, die mit einer Matrix vorbeschichtet sind, die extrazelluläre Proteine enthält ( Abbildung 1A). Verwenden Sie ein Medium für pluripotente Stammzellen (Ergänzende Tabelle 1).</li>
	<li>Passagezellen bei 80 % Konfluenz unter Beibehaltung eines Verhältnisses von 1:4 (50.000-75.000 Zellen pro 1 cm2). Etwa 2-3 h vor der Ablösung iPS-Zellen in das Medium für pluripotente Stammzellen, die den Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 enthalten, in einer Endkonzentration von 1 μM für 1 Tag übertragen.</li>
	<li>iPS-Zellen werden mit Hanks-Lösung gewaschen und bei 37 °C mit 0,05 %iger Trypsinlösung inkubiert. Um Trypsin zu inaktivieren, fügen Sie ein gleiches Volumen DMEM + 10 % FBS hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 x g für 5 min in 15 mL Röhrchen.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem frischen Medium für pluripotente Stammzellen. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern, geben Sie den Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 in einer Endkonzentration von 1 μM für 1 Tag in das Medium. Stellen Sie die Kulturplatte in einen CO2 -Inkubator, der auf 37 °C mit 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit eingestellt ist.</li>
</ol>
5. Chondrogene Differenzierung von iPSCs
<ol>
	<li>Initiieren Sie die Differenzierung in Richtung der chondrozytären Linie, indem Sie in den ersten 2 Tagen Zellen in Medium A (Ergänzende Tabelle 1) kultivieren. Ersetzen Sie Medium A an Tag 3 durch eine Lösung, die Chir 99021 und Rho-Kinase-Inhibitor ausschließt, während alle anderen Komponenten unverändert bleiben. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage von Tag 3 bis 9 (Abbildung 1B).</li>
	<li>Übertragen Sie am Tag 10 Chondrozyten-ähnliche Zellen auf Medium B (Ergänzende Tabelle 1), das zur Erleichterung der Chondrogenese formuliert ist. Wechseln Sie das Medium 10 Tage lang alle 2 Tage (Abbildung 1C).</li>
	<li>Bereiten Sie im Voraus eine 96-Well-Zellsuspensionskulturplatte vor, indem Sie jede Well mit 1,5 % Agarose in destilliertem Wasser beschichten. Die Agarose in der Mikrowelle schmelzen, bis sie kocht (ca. 60-90 s bei 700 W). Sobald Agarose verflüssigt ist, geben Sie 75 μl Agarose in jede Vertiefung und lassen Sie sie bei RT (ca. 15 min) aushärten.</li>
	<li>Geben Sie 150 μl DMEM-Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte mindestens 12 Stunden lang in einem CO2 - Inkubator. HINWEIS: Vorbereitete Platten können bis zu 1 Monat in einem CO2 -Inkubator bei 37 °C gelagert werden, wenn das Medium in jeder Vertiefung aufgefüllt wird, um die Verdunstung auszugleichen.</li>
	<li>Am Tag 12, nachdem phänotypische Veränderungen im Zusammenhang mit der Chondrogenese beobachtet wurden, initiieren Sie die Bildung von Sphäroiden mit den erzeugten Chondrozyten-ähnlichen Zellen. HINWEIS: In diesem Stadium ist es ratsam, die Expression wichtiger chondrozytärer Marker mit Immunzytochemie (ICC) und quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) unter Verwendung der 2-ΔΔCT-Methode 9 zu analysieren, um eine erfolgreiche chondrogene Differenzierung von iPSCs zu bestätigen. Während der Übergabe von einer 6-Well-Platte an einen 75 cm 2-Zellkulturkolben kann ein kleiner Teil der Zellen in eine 48-Well-Platte ausgesät werden, die der Anzahl der zu analysierenden Marker entspricht. Führen Sie eine ICC-Analyse an diesen Proben durch, um die Genexpression zu überprüfen.</li>
</ol>
6. Bildung von Sphäroiden aus Chondrozyten-ähnlichen iPSC-abgeleiteten Zellen
<ol>
	<li>Nach der Gewinnung von Chondrozyten-ähnlichen Derivaten bilden sich die Passagezellen mit einer Konfluenz von 80 %. Trennen Sie die Zellen mit einer 0,05%igen Trypsinlösung von den 6-Well-Platten. Um Trypsin zu inaktivieren, fügen Sie ein gleiches Volumen DMEM + 10 % FBS hinzu und geben Sie die Zellen dann in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 200 x g .</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Medium B und geben Sie sie in einen 75 cmgroßen 2-Zell-Kulturkolben, der mit 0,1%iger Gelatinelösung vorbeschichtet ist (Abbildung 1D). Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % als Monoschicht erreicht haben, lösen Sie die Zellen wieder mit Trypsin ab und resuspendieren Sie wie beschrieben in Medium B.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in eine 96-Well-Platte, die mit 1,5 % Agarose bei einer Dichte von 100.000 Zellen pro Well beschichtet ist. Kultivieren Sie in Medium B und fügen Sie 150 μl vollständiges Medium pro Vertiefung hinzu (Abbildung 1D, 3A).</li>
	<li>Halten Sie die Zellen in der 96-Well-Platte, die mit 1,5 % Agarose beschichtet ist, für mindestens 1 Tag und maximal 3 Tage, bis Sphäroide gebildet werden (Abbildung 2B). Übertragen Sie die Sphäroide aus den Vertiefungen mit einer 1-ml-Pipettenspitze mit abgeschnittenem Ende und geben Sie sie dann in ein 15-ml-Röhrchen. Lassen Sie die Sphäroide 2-3 Minuten einwirken und entfernen Sie den Überstand.</li>
	<li>Tauchen Sie die Sphäroide in frisch aufgetaute, unverdünnte Basalmembranmatrixlösung, die bei 4 °C gehalten wird. Nach 30 min werden die Sphäroide durch passive Sedimentation in einem 15 mL Röhrchen oder durch schonende Zentrifugation bei 100 x g für 1 min gesammelt. HINWEIS: Die Matrix sollte über Nacht auf Eis im Kühlschrank bei 2-8 °C aufgetaut werden. Nach dem ersten Auftauen werden Einmal-Aliquots der Matrix hergestellt, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden. Es werden Polypropylen oder andere gefrierkompatible Tuben verwendet und bei -70 °C oder -20 °C gelagert. Achten Sie auf das Verfallsdatum der Charge/Charge, das 2 Jahre ab dem Herstellungsdatum liegt.</li>
	<li>Übertragen Sie die Sphäroide in Mini-Bioreaktoren und fügen Sie 6 ml Medium B hinzu. Stellen Sie den Mini-Bioreaktor auf einen Orbitalschüttler in einem CO2 -Inkubator, der auf 37 °C mit 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit und einer Rührgeschwindigkeit von 70-75 U/min eingestellt ist (Abbildung 1F).</li>
	<li>Wechseln Sie das Medium wöchentlich oder je nach Bedarf bei Mediummangel oder Farbwechsel des Säure-Base-Indikators. Lassen Sie dazu die Sphäroide durch die Schwerkraft in einem 15-ml-Röhrchen absetzen und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand. Geben Sie frisches Medium B in das Röhrchen und übertragen Sie die Sphäroide zurück in die Mini-Bioreaktoren.</li>
</ol>

<ol><li>Cieza, A., Causey, K., Kamenov, K., Hanson, S. W., Chatterji, S., Vos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+the+need+for+rehabilitation+based+on+the+Global+Burden+of+Disease+study+2019%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global estimates of the need for rehabilitation based on the Global Burden of Disease study 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> Lancet. 396, e10267(2021).</li>
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<li>Endo, K., Fujita, N., Nakagawa, T., Nishimura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fibroblast+growth+factor-2+and+serum+on+canine+mesenchymal+stem+cell+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of fibroblast growth factor-2 and serum on canine mesenchymal stem cell chondrogenesis.</a> Tissue Eng Part A. 25 (11-12), 901-910 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-Lösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin-Lösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12 Eagle's</td><td>Medium Thermo Fisher Scientific</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Aggrecan monoklonaler Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>AHP0022</td><td>Wirt: Maus; Verdünnung: 1/500</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td>50 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>1x oder 2%</td></tr><tr><td>Beta-Mercaptoethanol</td><td>Serva</td><td>28625</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-110-922</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-926</td><td>10 &mu; M</td></tr><tr><td>COL1A1 (E6A8E) Monoklonaler Antikörper</td><td>CellSignalling</td><td>39952</td><td>Wirt: Kaninchen; Verdünnung: 1/800</td></tr><tr><td>COL2A1 (M2139) monoklonaler Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-52658</td><td>Wirt: Maus; Verdünnung: 1/50</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II Lösung&nbsp;</td><td>PanEco</td><td>P011-2</td><td>0,01%</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td>1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM Medium ohne Glutamin</td><td>PanEco</td><td>?420?</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>10%</td></tr><tr><td>Die Lösung von Hanks&nbsp;</td><td>PanEco</td><td>?020?</td><td></td></tr><tr><td>Hybris 8 medium</td><td>PanEco</td><td>?780?/?780</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen-Lösung</td><td>PanEco</td><td>?065</td><td>1x Lösung hat folgende Konzentrationen: Insulin: 10 &micro; g/ml; Transferrin: 5,5 &Mikro; g/ml; Selen 5 ng/ml</td></tr><tr><td>L-Alanyl-L-glutamin</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 35050038</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>BD</td><td>354277</td><td>300 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>PanEco</td><td>?063?</td><td>100 U/ml</td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-117-339</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Rho-Kinase-Inhibitor Y27632</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-922&nbsp;</td><td>ca. 10 mM</td></tr><tr><td>Sekundärer Antikörper Ziege Anti-Maus IgG (H+L) kreuzadsorbiert, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>Wirt: Ziege; Verdünnung: 1/500</td></tr><tr><td>Sekundärantikörper Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) hoch kreuzadsorbiert, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientsp;</td><td>?32732</td><td>Gastgeber: Ziege; Verdünnung: 1/500</td></tr><tr><td>Sox9 (D8G8H) Monoklonaler Antikörper</td><td>CellSignalling</td><td>82630</td><td>Wirt: Rb; Verdünnung: 1/400</td></tr><tr><td>TeSR-1 Medium</td><td>STEMCELL technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-095-067</td><td>10 ng/ml</td></tr></tbody></table>

erzeugung von sphäroiden aus verschiedenen chondrozyten unter verwendung von niedrigadhäsiven bedingungen unter schwerkraft und selbstgemachten mini-bioreaktoren

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

Das skizzierte Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Bei dieser Methodik werden zwei unterschiedliche Nährmedien verwendet, um die Differenzierung von iPSCs in Chondrozyten-Sphäroide über einen Zeitraum von mindestens 1 Monat voranzutreiben (Abbildung 2). Der Differenzierungsprozess wird eingeleitet, wenn iPSCs eine Konfluenz von 75 % bis 90 % erreichen (Abbildung 1B). Frühindikatoren für eine ch...

Erzeugung von Sphäroiden aus verschiedenen Chondrozyten unter Verwendung von niedrigadhäsiven Bedingungen unter Schwerkraft und selbstgemachten Mini-Bioreaktoren

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a ...

generating-spheroids-from-various-chondrocytes-using-low-adhesive

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ein 3D-System zur Kultivierung menschlichen Chondrozyten in ein hohes Maß an Gelenkflüssigkeit beschrieben. Synovialflüssigkeit spiegelt den natürlichen Mikroumgebung für Gelenkknorpel, und kann leicht erreicht werden und gespeichert werden. Dieses System kann daher für die Untersuchung Knorpelregeneration und zum Screening von Therapeutika zur Behandlung von Arthritis verwendet werden.

Ein 3D-System für Züchtung menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit

Die Biosynthese von knorpeligen extrazellulären Matrix durch Chondrocyten können durch Einwirkung mechanischer Reize beeinflußt werden. Diese Methode beschreibt die Technik der Anwendung dynamisch Druckspannungen zu Chondrozyten in 3D-Konstrukte und die Auswertung der induzierten Veränderungen in Chondrozytenmetabolismus verkapselt.

Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

Die Knorpelreparatur stellt eine ungelöste medizinische Herausforderung dar und zellbasierte Ansätze zur Entwicklung von menschlichem Gelenkknorpel sind eine vielversprechende Lösung. Hier beschreiben wir dreidimensionale (3D) biomimetische Hydrogele als ideales Werkzeug für die Expansion und Reifung menschlicher Gelenkchondrozyten.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Mechanischer Stress kann die chondrogene Differenzierung von Stammzellen induzieren und bietet damit einen potentiellen therapeutischen Ansatz für die Reparatur von gestörtem Knorpel. Wir stellen ein Protokoll vor, um die chondrogene Differenzierung von aus Fett gewonnenen Stammzellen (ASCs) mit Hilfe der Zentrifugalgravitation (CG) zu induzieren. Die CG-induzierte Hochregulierung von SOX9 führt zur Entwicklung chondrogener Phänotypen.

Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden zur Herstellung und Charakterisierung einer pneumatisch betätigten mikrofluidischen Vorrichtung für die Chondrozytenkompression.

Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression

Wir präsentieren ein motorbetriebenes zentrifugales mikrofluidisches Gerät, das Zellsphäride kultivieren kann. Mit diesem Gerät können Sphäroide von einzelnen oder mehreren Zelltypen leicht unter hohen Schwerkraftbedingungen kokultiviert werden.

Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

Hier beschreiben wir die großtechnische Produktion von aus Fett gewonnenen Stroma-/Stammzell-Sphäroiden (ASC) unter Verwendung eines automatisierten Pipettiersystems zur Aussaat der Zellsuspension, wodurch die Homogenität der Sphäroidgröße und -form sichergestellt wird. Diese ASC-Sphäroide können als Bausteine für 3D-Bioprinting-Ansätze verwendet werden.

Großflächige, automatisierte Produktion von aus Fett gewonnenen Stammzellsphäroiden für den 3D-Bioprinting

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur kostengünstigen Herstellung von Gewebesphäroiden in großem Maßstab unter Verwendung eines 3D-gedruckten stempelähnlichen Geräts.

Erzeugung von Gewebesphäroiden über ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Chondrozyten, Fibronektin-Adhäsionsassay-abgeleiteten Chondroprogenitoren (FAA-CPs) und migratorischen Chondroprogenitoren (MCPs) aus menschlichem Gelenkknorpel. Es umfasst enzymatischen Verdau, Fibronektin-Adhäsion und migrationsbasierte Assays zur Isolierung und Charakterisierung dieser Zellen.

Isolierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren mittels Fibronektin-Adhäsions- und Migrationsassay

In dieser Studie wird eine kostengünstige und effiziente Methodik zur Generierung von 3D-Zellstrukturen unter Verwendung eines stempelbasierten Systems zur Erstellung von Mikrovertiefungen in Agaroseformen vorgestellt. Das System fördert die Bildung einheitlicher Sphäroide/Organoide und verbessert so die Zellinteraktionen. Dieser Ansatz reduziert die experimentelle Variabilität und unterstützt Anwendungen in der Wirkstoffdiagnostik und im Tissue Engineering.

Erzeugung von dreidimensionalen Sphäroiden/Organoiden aus zweidimensionalen Zellkulturen mit Hilfe eines neuartigen Stempelgeräts

Lernen Sie die Herstellung stabiler chondrozytärer Sphäroide aus iPSCs unter niedrigadhäsiven Bedingungen in Mini-Bioreaktoren. Diese Methode unterstützt die Geweberegeneration bei chronischen Gelenkerkrankungen.

Erzeugung von Sphäroiden aus verschiedenen Chondrozyten unter Verwendung von niedrigadhäsiven Bedingungen unter Schwerkraft und selbstgemachten Mini-Bioreaktoren (Video) | JoVE Journal

Erzeugung von Sphäroiden aus verschiedenen Chondrozyten unter Verwendung von niedrigadhäsiven Bedingungen unter Schwerkraft und selbstgemachten Mini-Bioreaktoren

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