Name: Vorbereitung der Gene Gun und Aufzählungszeichen Biolistic Transfektion von Neuronen in Scheiben Kultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Lernen Sie die biolistische Transfektion von Neuronen in hippocampalen Schnittkulturen mit DNA-beschichteten Goldpartikeln. Diese Methode ermöglicht die gezielte Markierung einzelner Neuronen für morphologische Studien.

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Wir möchten Mark lukanische und Hwai-Jong Cheng für die Hilfe bei dem Erwerb der geringer Vergrößerung Bilder des gesamten Hippocampus Scheiben in diesem Video vorgestellt danken. Wir möchten auch Sarah Parrish für die Unterstützung mit dem Begleittext das Video zu danken.

PROTOKOLL FÜR biolistischen TRANSFEKTION Erstellen Kugeln Bullets sind gut für bis zu 6 Monate, kann aber anfangen, in Transfektionseffizienz nach 2-3 Monaten zu verringern. Bullets sollte bei 4 ° C in Anwesenheit von Trockenmittel Pellets gelagert werden. Lassen Sie immer das Szintillationsgefäße, in denen Kugeln gespeichert sind, auf Raumtemperatur erwärmt vor dem Öffnen der Flasche. Bevor Sie beginnen müssen bereit: <ul><li> Spermidin (0,05 M) </li><li> CaCl 2 (1M) </li><li> EtOH (100%-high grade-ungeöffnete Flasche) </li><li> Autoklaviert H 2 0 </li><li> DNA zu transfizieren </li><li> Polyvinylpyrrolidon (PVP-20 mg / ml Stammlösung) </li><li> 2 X 15 ml konisch (2/bullet set) </li><li> Tubing (Schnitt in 1 X ~ 30 Zoll / Kugel gesetzt) </li><li> Szintillationsgefäße (1/bullet set) </li><li> Austrocknung Pellets </li><li> 10 ml Spritze w / Schläuche am Ende </li></ul> Bereiten Schlauch: <ol><li> Dry ~ 30 Zoll-Schlauch (ungefähr 2 Zoll, die über rechten O-Ring) in den Schlauch Station w / N 2-Gas (0,4 Druck) für mindestens 20 min. </li></ol> Ausfallende DNA auf Gold Perlen: <ol><li> Bereiten DNA in 50 μmL Gesamtvolumen in Mikrozentrifugenröhrchen (maximal 50 ug Gesamt-DNA) transfiziert werden </li><li> Abwiegen 6-8 mg Gold und Überweisung auf ein Mikrozentrifugenröhrchen </li><li> 100 l 0,05 M Spermidin, um Gold und beschallen für 20 sec </li><li> Fügen Sie die 50 ul DNA, um das Gold / Spermidin </li><li> Vortex (rund Einstellung 5) w / cap öffnen </li><li> Fügen Sie tropfenweise 100 ul 1M CaCl 2 </li><li> Ultraschallbad kurz (&lt;5 sec) </li><li> Absetzen lassen für 10 Minuten bei Raumtemperatur </li><li> Ultraschallbad kurz </li></ol> Bereiten Sie PVP-Lösung während der Beschallung: <ol><li> Machen Sie verdünnten PVP-Lösung in 15 ml konisch, 3.5ml verdünnten PVP für jeden Satz von Kugeln (add 7,5 ul der 20mg/ml PVP Lager zu 3,5 ml 100% EtOH) </li></ol> Spülen Goldperlen mit EtOH: <ol><li> Spin down Goldperlen bei voller Geschwindigkeit für 10 Sekunden in Mikrozentrifuge </li><li> Überstand, aber halten Sie eine kleine Menge der Flüssigkeit auf der Goldperlen </li><li> Waschen mit 1 ml EtOH 3X, kurz beschallen jedes Mal, wenn nötig </li></ol> Resuspendieren gold / DNA in PVP-Lösung: <ol><li> Resuspendieren Gold Pellet in 200 ul der 3,5 ml verdünnten PVP / EtOH-Lösung </li><li> Vortex das Gold Pellet zu resuspendieren (kurz beschallen falls erforderlich) </li><li> Übertragen Sie die 200 ul von Gold / PVP-Lösung zu einem neuen 15 ml konischen </li><li> Fahren Sie auf diese Art und Weise, Zugabe von 200 ul von PVP in einer Zeit, bis alles Gold ist, die 15 ml konische übertragen worden, und das Endvolumen beträgt 3,2 mL </li></ol> Coating-Schlauch: <ol><li> Schalten N 2 bei der Schlauch-Station und nehmen Sie getrocknete Schlauch </li><li> Bringen getrocknet Schlauch an den 10 ml-Spritze </li><li> Kräftig schütteln 15 ml konisch mit gold / PVP gefüllt </li><li> Das Ende des Schlauches in gold / PVP-Lösung und saugen sich langsam darauf achten, um Blasen zu vermeiden </li><li> Lassen Sie ~ 2 Zoll trocken von beiden Enden des Rohres </li><li> Mit dem Schlauch noch Spritze befestigt und mit dem Gold / PVP-Lösung, vorsichtig die Schläuche wieder in die Station </li><li> Mark die Enden des Rohres, wo die Lösung liegt </li><li> Lassen Sie das Gold für 5 Minuten absetzen mit der Spritze befestigt </li><li> Suck-up die Lösung sehr langsam, indem Sie die Spritze so, dass die ständige Gold hinter sich (vergewissern Sie sich, um Back-wash) links </li><li> Trennen Sie die Spritze </li><li> Um 90 ° und lassen Sie sich 2 Sekunden </li><li> Um 180 ° drehen und lassen Sie sich weitere 2 Sekunden </li><li> Drehen Rohr für 5 Sek. </li><li> Schalten Sie die N 2, so dass das Ventil liest zwischen 0,4 bis 0,5 und drehen Sie das gold-beschichtete Schlauch während der Trocknung für 5 min. </li></ol> Cutting-Schlauch: <ol><li> Entfernen Sie den Schlauch aus dem Schlauch prep-Station und schneiden Sie die Enden an den Markierungen. </li><li> Setzen Sie ein markiertes Scintillationsfläschchen unter dem Schlauch Chopper zu schneiden Patronen zu fangen </li><li> Legen Sie Schlauch in das Rohr Chopper und schneiden Sie den Schlauch mit sauberen Rasierklinge </li><li> Legen Sie eine Austrocknung Pellets in Scintillationsfläschchen </li><li> Lagern Sie Kassetten bei 4 ° C </li></ol> Shooting Gewebeschnitten Bei der Aufnahme von kultivierten Scheiben, ist es wichtig, eine relativ sterile Technik einzusetzen, um Kontaminationen zu vermeiden. Denken Sie daran, dass bei der Aufnahme von zwei verschiedenen Konstrukte, beide Sätze von Kugeln in der gleichen Patronenhalter geladen werden kann, aber der Lauf-Liner und Bildschirm sollte zwischen Konstrukten verändert werden. Bevor Sie beginnen müssen bereit: <ul><li> DNA Kugeln (let Scintillationsfläschchen auf Raumtemperatur erwärmt, bevor) </li><li> Gewebeschnitten </li><li> Helios Gene Gun </li><li> Helium-Tank mit Gen-Kanone Schlauch angebracht &lt;/ Li&gt; <li> Kartuschenhalter </li><li> Barrel-Liner mit Kunststoff-O-Ring an seinem Platz </li><li> Diffuser (modifiziert) </li><li> Streuscheibe </li><li> Zange </li></ul> Prepping der Gen-Kanone: <ol><li> Mit einer Pinzette Ort der mit Gold beschichteten Kunststoff-Patronen in den Patronenhalter. </li><li> Setzen Sie den Patronenhalter in die Gen-Kanone, indem Sie zuerst Zurückschieben lock </li><li> Sichern Sie den Patronenhalter mit Schloss </li><li> Besorgen Sie sich einen Barrel-Liner mit einem O-Ring und der Diffusor Bildschirm sicher in Position </li><li> Schrauben Sie die Lauf-Liner in die Gen-Kanone </li></ol> Shooting kultivierten Scheiben mit der Gen-Kanone: <ol><li> Setzen Sie auf Gehörschutz </li><li> Stecken Sie den Gen-Kanone in Schlauch verbunden Helium-Gas-Tank </li><li> Schalten Sie den Druck auf Tank bis 180 PSI </li><li> Nehmen Sie ein leeres in die Luft, um Staub und Schmutz aus dem Diffusor Bildschirm zu entfernen. Um die Waffe zu schießen, zuerst drücken Sie die Sicherheitsverriegelung drücken, bis die Waffe piept, dann abdrücken. </li><li> Nach der Aufnahme des Rohlings, entfernen Sie die Scheiben aus dem Inkubator </li><li> Advance-Pistole an erste Konstrukt </li><li> Schießen Sie mit dem Diffusor-Bildschirm über 0,5 bis 1 Zoll von der Scheibe </li><li> Schieben Sie die Patrone zwischen den Wells. </li><li> Nach der Aufnahme der letzten gut, legen Sie die Scheiben wieder in den Inkubator </li><li> Schalten Sie Gas-und Lösedruck vor dem Abnehmen der Pistole aus dem Helium-Schlauch </li><li> Lösen Sie den Lauf-Liner, und entfernen Sie die Patrone und die verwendeten Schalen </li></ol> Reinigungskassette Inhaber und Lauf-Liner: <ol><li> Legen Sie Patronen, Fass-Linern und Diffusor-Bildschirme in ein Becherglas mit Seifenwasser </li><li> Legen Becher in Ultraschallbad und beschallen für 20 min </li><li> Gründlich mit Wasser ausspülen, bis alle Seifenreste entfernt werden </li><li> Tauchen Sie ein in 70% EtOH für eine Stunde </li><li> Legen Sie auf trockenen Papiertuch über Nacht zu trocknen </li><li> Reinigen der Patronen, Fass-Linern und Bildschirmen kann dann in nachfolgenden biolistischen Transfektionen wiederverwendet werden </li></ol> Fehlersuche Tipps für Biolistic Transfektion Biolistic Transfektion kann manchmal zu einer suboptimalen Transfektionsbedingungen führen. Es kann zu wenige oder zu viele Zellen transfiziert, zu hohe oder zu niedrige Expression führen können oder Gewebeschnitten dazu führen, dass sich in der Regel gesund. Oft ungesund Scheiben ergeben sich aus der Druckwelle. Hier sind einige Tipps, um optimal transfiziert Gewebeschnitte zu erhalten. Wenn Scheiben scheinen ungesund sein (oder, wenn zu viele Zellen / Scheibe transfiziert), versuchen Sie: <ul><li> zunehmende Aufnahmeabstand </li><li> abnehmendem Druck auf Gastank </li><li> Verringerung der Menge an Gold </li><li> Ausschneiden der Mitte des Bio-Rad-Diffusor und Ersetzen der Mitte mit einer Streuscheibe. </li></ul> Wenn zu wenige Zellen transfiziert sind, versuchen Sie: <ul><li> abnehmender Aufnahmeabstand </li><li> zunehmenden Druck auf die Gas-Tank </li><li> Erhöhung der Menge von Gold </li><li> Erhöhung der Anzahl von Gewebeschnitten / well </li><li> sicherstellen, dass die O-Ring in den Lauf-liner ist intakt. </li></ul> Wenn Sie Slices erhalten sowohl mit zu vielen und zu wenigen Zellen während der gleichen Aufnahmebedingungen stellen Sie sicher, transfiziert: <ul><li> dass Sie mit der Waffe symmetrisch über gut </li><li> dass Gold gleichmäßig Beschichtung der Innenseite der Rohre. (Wenn Sie immer eine Reihe von Gold sind, ziehen den Überstand vom Schlauch mit einer schnelleren Rate, wenn das Gold abgesetzt hat, und drehen Sie das Gold mehr, bevor Sie den Stickstoff. Wenn auf der anderen Seite bekommen Sie Streifenbildung von Gold Dies ist wahrscheinlich auf zu viel Feuchtigkeit Exposition während der Kugel machen: stellen Sie sicher, Sie verwenden eine ungeöffnete Flasche EtOH, dass der Schlauch gründlich vor der Beschichtung trocken, und dass Sie Capping Deckel und Vorbereitung Kugeln in einer fristgerechten Weise). </li></ul> Wenn Transfektionseffizienz scheint optimal (#-Zellen transfiziert / Stück), aber der Ausdruck Ebene scheint zu hoch oder zu niedrig: <ul><li> Anpassung des Verhältnisses DNA zu Gold. (ZB wenn sie zu niedrig halten die Menge des Goldes, sondern die Menge an DNA.) </li><li> Anpassung der Höhe der Zeit zwischen Aufnahme-und Datenerfassung </li></ul> Im Falle von Dual-Transfektion, wenn Sie auch zu wenig Ausdruck eines Ihrer Konstrukte, passen Sie das Verhältnis der beiden Konstrukte in geeigneter Weise und stellen Sie sicher, dass beide Konstrukte unter den gleichen Promotor, so stellen Sie sicher, dass man Promotor wird nicht out-Wettbewerb der anderen Seite.

<ol><li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li>
<li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
</ol>

Biolistic Transfektion ist eine physikalische Mittel zur Transfektion von Zellen über Beschuss von lebendem Gewebe mit hoher Geschwindigkeit DNA beschichtete Goldpartikel. In der Teilchen-vermittelten Gentransfer im Allgemeinen transfizierten Zellen entstehen, wenn die Kugel kommt in den Kern ruhen. Während viele verschiedene Transfektion Methoden existieren, wie Mikroinjektion, Lipofektion, Calcium-Phosphat-Transfektion, Elektroporation und virale Transfektion kann biolistischen Transfektion bieten eine weniger arbeitsintensiv und effiziente Alternative zur Transfektion von Zellen, die nicht einfach sind, transfiziert mit diesen anderen Methoden. In der Tat war es zunächst als eine Technik für den Gentransfer in Pflanzen entwickelt, da das Vorhandensein der Zellwand aus Transfektion schwierig mit existierenden Methoden 1. Ebenso hat Biolistik Popularität auf dem Gebiet der Neurobiologie gewonnen, da post-mitotischen Neuronen notorisch schwer zu 2,3 transfizieren sind. Insbesondere ist es weithin als das Prinzip Technik, um in Experimenten bei der Beurteilung feinen Morphologie der einzelnen Neuronen im intakten Gehirn Scheiben sollen verwendet werden anerkannt. Die hier beschriebenen Methoden liefern eine detaillierte und umfassende Erklärung, wie biolistischen Transfektion von kultivierten Hirnschnitten durchführen mit einer Hand gehalten Gen-Kanone (die Helios Gene Gun-System; Bio-Rad). Biolistic Transfektion ist die bevorzugte Methode zur Transfektion von Neuronen in Scheiben Kultur, weil es die Transfektion von einem spärlichen Anzahl von Zellen im Gehirn Scheibe ermöglicht. Auf diese Weise können einzelne Neuronen isoliert betrachtet werden. Da diese Technik eignet sich besonders gut zur Transfektion von Neuronen im Gehirn Scheibe geeignet, ist es oft in Verbindung mit 2-Photonen-Mikroskopie verwendet, da 2-Photonen-Anregung ermöglicht die Visualisierung von fluoreszenzmarkierten Zellen tief im Lichtstreuung Gewebe 4. In der Tat die hohe Vergrößerung Bilder einzelner Pyramidenneuronen in diesem Video vorgestellt wurden unter Verwendung einer speziell angefertigten 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop. Abschließend biolistischen Transfektion ist ein effizientes Mittel zur Transfektion von einzelnen Zellen im Kontext einer hohen Dichte von umgebenden Zellen, und als solche hat sich als extrem nützlich für die Fluoreszenzmarkierung einzelner Neuronen in neuronalen Stück Kultur.

Obwohl wir alle aufgeführten Produkte sind getrennt, ist es wirtschaftlich in der Anschaffung &quot;Helios Gene-Gun System&quot;, das mit allen Produkten von Bio-Rad oben aufgeführt wurden (cat # 165-2431) enthält.

vorbereitung der gene gun und aufzählungszeichen biolistic transfektion von neuronen in scheiben kultur

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic Transfektion ist eine physikalische Mittel zur Transfektion von Zellen durch den Beschuss Gewebe mit hoher Geschwindigkeit DNA beschichtete Partikel. Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll für biolistischen Transfektion von Ratten-Hippocampus Scheiben, von der ersten Herstellung von DNA-ummantelten Kugeln um die letzten Schießen der organotypischen Kulturen mit einer Gen-Kanone. Gene gun Transfektion ist eine effiziente und einfach mittels Transfektion von Neuronen und ist besonders nützlich für Fluoreszenzmarkierung eine kleine Untergruppe von Zellen im Gewebe zu schneiden. In diesem Video haben wir zunächst einen Überblick über die erforderlichen Schritte zu beschichten Goldpartikel mit DNA. Wir nächsten demonstrieren, wie auf der Innenseite der Kunststoffschlauch mit dem Gold / DNA Kugeln Linie, und wie man diese Rohre geschnitten, um die Kunststoff-Patronen zum Laden in den Gen-Kanone zu erhalten. Schließlich führen wir biolistischen Transfektion von Ratten-Hippocampus Scheibe Kulturen demonstrieren Umgang mit dem Bio-Rad Helios Gene Gun, und bietet Fehlersuche Ratschläge für gesunde und optimal transfiziert Gewebeschnitte zu erhalten.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von DNA beschichteten Gold-Kugeln und zeigen die Verwendung solcher Geschosse zu biolistically transfizieren Neuronen in kultivierten Hippocampus-Schnitten.

Vorbereitung der Gene Gun und Aufzählungszeichen Biolistic Transfektion von Neuronen in Scheiben Kultur

Die biolistische Transfektion ist ein physikalisches Verfahren zur Transfektion von Zellen durch das Beschießen von Gewebe mit DNA-beschichteten Partikeln hoher Geschwindigkeit. Wir bieten eine detaillierte ...

Die Biotische oder Genschieß-Transfektion ist ein physikalisches Verfahren zur Transfektion von Zellen, bei dem Gewebe mit DNA-beschichteten Teilchen hoher Geschwindigkeit beschossen wird. Diese Technik ist eine effiziente und einfache Methode zur Transfektion von Neuronen und besonders nützlich, um nur eine geringe Anzahl von Zellen in einem Gewebeschnitt zu transfizieren. Beispielsweise bei der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung der neuronalen Morphologie in einem intakten Schnitt.Mittels Bic-Transfektion lässt sich die Visualisierung einzelner Neuronen vor einem sauberen Hintergrund nicht transfizierter Zellen ermöglichen. In diesem Video demonstrieren wir eine Methode zur Herstellung DNA-beschichteter Genkanonen-Pellets und anschließender Bic-Transfektion an organotypischen hippokampalen Schnittkulturen. Hallo, ich bin Georgia Woods.Ich bin Doktorandin im Labor von Dr. Karen Zito an der University of California in Davis. Heute werde ich demonstrieren, wie man DNA-beschichtete Geschosse herstellt und wie man eine Bic-Transfektion an hippocampalen Schnitten von Ratten durchführt. Die grundlegenden Schritte der Bic-Transfektion bestehen darin, Goldpartikel mit der zu transfizierenden DNA zu beschichten, den Innenraum der Plastikschlauches mit diesem Gold zu beschichten und drei.Schneiden Sie den Schlauch in Kartuschen, um sie in die Genkanone zu laden, und schießen Sie das zu transfectierende Gewebe. Beginnen wir also. Bevor wir bereit sind, die Transfektion durchzuführen, müssen wir zunächst die mit DNA beschichteten Geschosse vorbereiten.Dies beinhaltet die Beschichtung von 1,6-Mikrometer-Goldpartikeln mit dem DNA-Plasmid, das transfiziert werden soll. Während des Abschießens fungiert ein einzelnes Goldpartikel als Geschoss, das in die Zelle eindringt und so die Transfektion bewirkt. Zunächst müssen wir daher die zu transfizierende DNA vorbereiten.Im Idealfall sollten Sie weniger als 50 Mikrogramm DNA pro Büchsenladung in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern Wasser verwenden. Beachten Sie, dass die genaue Menge an DNA empirisch für jeden Konstrukt bestimmt werden sollte, um den optimalen Expressionsgrad zu erzielen. Nun, da wir unsere DNA-Aliquoten haben, müssen wir Spermin an die Goldpartikel hinzufügen.Gebe zu den acht mg vorab gewogenem Gold hundert Mikroliter Sperma, Meine und sonifiziere etwa 20 Sekunden lang. Es ist Sperma.Meine ist ein Polyamin, das die Goldpartikel positiv lädt, wodurch sie mit der negativ geladenen DNA interagieren, die ihrerseits mit dem positiv geladenen Metall wechselwirkt. Nach dem 22. Sohn geben Sie die 50-Mikroliter-DNA-Wasserlösung zum Gold hinzu. Sobald die DNA zu den Perlen gegeben wurde, wirbeln Sie die Mischung im Vortex, während Sie hundert Mikroliter Calciumchlorid tropfenweise zugeben. Calciumchlorid bewirkt, dass die DNA ausfällt.Nach kurzem Wirbeln die Lösung 10 Minuten lang zur Fällung stehen lassen. Nach der 10-minütigen Fällung die DNA und das Gold im Tischzentrifugenröhrchen 30 Sekunden lang mit voller Geschwindigkeit zentrifugieren; nach dem 32. Hochgeschwindigkeitslauf den Großteil des Überstandes abpipettieren, jedoch vermeiden, das Gold-Pellet aufzusaugen. An dieser Stelle entferne ich lediglich jegliche DNA, die nicht auf dem Gold ausgefällt ist.Die Goldpartikel werden anschließend in einem Milliliter frischem Ethanol gewaschen und kurz beschallt. Sobald sich die DNA ausfällt, neigt sie dazu, das Gold zu agglomerieren. Eine leichte Beschallung löst diese Goldklumpen auf. Achten Sie jedoch darauf, die DNA nicht durch übermäßige Beschallung zu scheren.Die Goldpellets werden erneut abzentrifugiert und das Ethanol wird per Pipette entfernt. Wiederholen Sie die Ethanolwäsche noch zweimal. Nach der dritten Ethanolwäsche 200 Mikroliter der verdünnten Polyvinylpernon- oder PVP-Lösung hinzufügen und beschallen.Überführen Sie das beschichtete Gold kurzweilig in eine 15-mil-Kegelröhre, die bereits 200 Mikroliter verdünnte PVP-Lösung enthält. PVP ist ein Lösungsmittel, das bewirkt, dass die Goldpartikel an den verwendeten Kunststoffschläuchen haften. Entfernen Sie im nächsten Schritt Spuren verbliebener Goldkügelchen im Epi-Röhrchen, indem Sie 200 Mikroliter PVP zum Epi-Röhrchen hinzufügen.Dann kurz vermischen und in den 15 ml konischen Kolben überführen. Wiederholen Sie dies, bis das gesamte Gold in den 15 ml konischen Kolben überführt wurde. Überführen Sie die restliche PVP-Lösung, sodass das Gold nun in einer 3,2 ml Lösung aus PVP-Ethanol resuspendiert ist.Nun sind wir bereit, die Plastikröhrchen zu beschichten, die verwendet werden, um die Genkanonen-Geschosse aufzunehmen, wenn sie in die Genkanone eingelegt werden. Da das Gold nun mit DNA beschichtet ist, müssen wir das Innere der Plastikröhrchen mit den Goldpartikeln auskleiden. Diese mit Gold beschichteten Plastikröhrchen werden anschließend tatsächlich in das Rohr der Genkanone eingelegt.Beginnen Sie damit, ein Stück Schlauch so abzuschneiden, dass es etwa zwei Zoll über den O-Ring hinausragt. Sobald der Schlauch in der Schlauchvorbereitungsstation platziert wurde, drehen Sie das Druckventil, sodass das Durchflussmessgerät etwa 0,4 anzeigt. Stickstoff sorgt für eine wasserfreie Atmosphäre zum Trocknen des Schlauchs; trocknen Sie den Schlauch etwa 20 Minuten lang.Es ist am besten, diesen Trocknungsschritt durchzuführen, während Sie die Goldkugeln wie im vorherigen Schritt gezeigt mit DNA beschichten. Auf diese Weise ist das Röhrchen trocken und bereit, sobald Sie mit der Beschichtung beginnen können. Bereiten Sie nun die Goldkügelchen vor, da das Röhrchen trocken ist und das Gold bereits mit der DNA beschichtet wurde.Schalten Sie die N-two-Station aus, bevor Sie die Kapillare mit Ihrer Gold-PVP-Lösung füllen, und entfernen Sie die getrocknete Kapillare von der Station. Befestigen Sie sie anschließend an eine 10-mil-Spritze, bevor Sie das PVP und das Gold in die Kapillare aufsaugen. Schütteln Sie die Lösung gründlich und saugen Sie sie unverzüglich in die getrocknete Kapillare auf, wobei Luftblasen vermieden werden müssen. Achten Sie zudem darauf, die Lösung nicht in die Spritze selbst aufzusaugen.Wenn der Schlauch nun mit der PVP-Gold-Lösung gefüllt ist, stellen Sie den Schlauch vorsichtig wieder in die N-two-Station. Lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang mit angebrachter Spritze ruhen, damit sich die Goldpartikel am Boden des Schlauchs absetzen können. Markieren Sie die Enden des Schlauchs an den Stellen, an denen sich die Lösung abgesetzt hat.Nachdem sich die Lösung gesetzt hat, ist mit der befestigten Spritze ein goldener Streifen am Boden der Kapillare sichtbar. Entfernen Sie die Überstände sehr langsam und achten Sie darauf, dass keine Rückspülung erfolgt und die Kapillare nicht abgetrennt wird. Nun muss die Kapillare rotiert und getrocknet werden, um das Gold gleichmäßig an der Innenseite der Kapillare anzubringen.Zuerst drehen Sie den Schlauch um 90 Grad. Warten Sie zwei Sekunden. Drehen Sie ihn nun weitere 180 Grad und warten Sie erneut zwei Sekunden.Drehen Sie fünf Sekunden lang und schalten Sie anschließend das N zwei ein, sodass die Anzeige der Station zwischen 0,4 und 0,5 liegt, und lassen Sie es weiterlaufen, während das Schlauchmaterial fünf Minuten lang trocknet. Da die fünf Minuten abgelaufen sind und unser Gold trocken ist, müssen wir den Schlauch in Kartuschen schneiden, die in die Genkanone geladen werden können. Ich werde den Schlauch nun in etwa halbzolllange Abschnitte schneiden, um Hülsen herzustellen, die die geeignete Größe haben, um in den Zylinder der Genkanone eingelegt zu werden.Um die Hülsen zu sammeln, platzieren Sie die Simulationsgalle unter dem Schneidmesser, schneiden Sie den Schlauch an den Markierungen durch und verwenden Sie dazu ein sauberes Rasiermesser. Legen Sie den Schlauch in den Schlauchschneider, um eine geeignete Länge abzutrennen. Führen Sie den Schlauch einfach vorwärts, bis Sie Widerstand spüren, und schneiden Sie dann ab.Nachdem das Tubing geschnitten und in der Szintillationsflasche gesammelt wurde, eine Trockenpellet in die Szintillationsflasche geben. Die Pellets sind bis zu sechs Monate lang haltbar, zeigen jedoch nach zwei bis drei Monaten möglicherweise eine Abnahme der Transfektionseffizienz. Daher ist es empfehlenswert, die Flasche mit dem Konstruktname und dem Datum zu beschriften.Die Kolben können sofort nach der Herstellung verwendet oder bei vier Grad Celsius gelagert werden. Wenn Sie Kolben verwenden, die bei vier Grad Celsius gelagert wurden, lassen Sie das Vial vor dem Öffnen etwa 15 Minuten bei Raumtemperatur warm werden, um zu verhindern, dass die Kolben Feuchtigkeit aufnehmen. Nun sind wir bereit, die DNA-Kolben mit einer Genkanone abzuschießen.Nun, da die Geschosse hergestellt sind, bin ich bereit, tatsächlich Zellen zu ballistisch transfizieren. Ich werde eine BioRad Helios-Genkanone verwenden und damit auf Ratten-Hippocampus-Schnitte schießen, die seit ihrer Präparation fünf Tage lang inkubiert wurden. Die Genkanone wird an einen Heliumgasbehälter angeschlossen sein.Wenn die Pistole abgefeuert wird, beschleunigt ein kurzer Druckstoß aus dem Tank die Goldpartikel in Richtung des Schnitts. Im Allgemeinen: Wenn ein Goldpartikel in den Zellkern eingebettet wird, dann wird diese Zelle transfiziert.Da ich kultivierte Schnitte transversalisiere, verwende ich während der gesamten Bic-Transfektion eine relativ sterile Technik, um Kontaminationen zu vermeiden. Sobald die Kartuschen auf Raumtemperatur erwärmt sind, öffnen Sie das Simulationsfläschchen und legen die mit Gold beschichteten Kunststoffkartuschen in den Kartuschenhalter. Danach setzen Sie den Kartuschenhalter in die Genkanone ein, indem Sie zunächst die Zylindersperre zurückschieben.Jetzt muss die Laufauskleidung an die Pistole angebracht werden. Stellen Sie zunächst sicher, dass der O-Ring in der Laufauskleidung sitzt und der Diffusor-Schirm fest befestigt ist. Der Schirm dient dazu, den Druck aus dem Lauf zu verteilen und bewirkt ein Zerstäuben des Goldes, wodurch eine gleichmäßigere Verteilung des Goldes im Brunnen erreicht wird.Schrauben Sie den Barrel-Einsatz vollständig in die Genkanone hinein. Beim Abschießen von zwei unterschiedlichen Konstrukten können beide Sätze von Projektilem im selben Patronenhalter geladen werden, jedoch sollten der Barrel-Einsatz und der Schirm zwischen den Konstrukten gewechselt werden. Die Genkanone ist nun bereit, an die Heliumquelle angeschlossen zu werden.Stecken Sie das Genkanone in den Schlauch, der mit dem Heliumgasbehälter verbunden ist. Sie sollte einrasten, und erhöhen Sie dann den Druck am Behälter auf 180 PSI. Die Waffe ist nun schussbereit, aber tragen Sie zuerst Gehörschutz, und um Staub oder Schmutz vom Diffusorfilter zu entfernen, führen Sie einen Blindschuss durch, um die Waffe abzufeuern.Zuerst drücken Sie den Sicherheitsverriegelungsknopf, bis die Waffe piept, und ziehen dann den Abzug. Jetzt sind wir bereit, den Schnitt abzufeuern. Nach dem Abschießen des Blindwertes entfernen Sie die Schnitte aus dem Inkubator.Während unserer Hippocampus-Präparationen legen wir vier Schnitte pro Brunnen an und ordnen sie so an, dass sie die Ecken eines zwei Zentimeter großen Quadrats nahe dem Zentrum der Membran bilden. Beleuchten Sie jeden Brunnen mit dem Diffusorschirm in einem Abstand von etwa einem halben bis einem Zoll vom Schnitt. Transfizierte Zellen können in der Regel innerhalb von einem bis fünf Tagen untersucht werden, abhängig vom Konstrukt.Nachdem alle Vertiefungen beschossen wurden, schalten Sie das Gas ab und lassen Sie den Druck ab, bevor Sie die Pistole von dem Heliumschlauch trennen. Entfernen Sie die Kartuschen und die verwendeten Hülsen. Schrauben Sie das Laufinnrohr ab; die Kartuschen, Laufinnrohre und die Siebe können gereinigt werden, indem sie 20 Minuten lang in ein Wasserbad mit Seifenlösung gegeben und ultraschallgereinigt werden, anschließend gründlich mit Wasser gespült, eine Stunde lang in 70 %igem Ethanol getränkt und über Nacht auf einem trockenen Papiertuch abgetrocknet werden.Saubere Kartuschen und Siebe können anschließend bei nachfolgenden biotischen Transfektionen wiederverwendet werden. Nun betrachten wir einige der Transfektionsergebnisse. Selbst bei einer Standardpräparation von hippokampalen Schnitten kann die Transfektionseffizienz je nach Geschossen und Schnitten recht unterschiedlich ausfallen.Im Allgemeinen ist eine relativ geringe Transfektionsrate wünschenswert, um gut isolierte transfizierte Neuronen zu erhalten. Außerdem wird bei einer zu hohen Anzahl transfizierter Zellen die allgemeine Gesundheit des Schnitts unter optimalen Bedingungen beeinträchtigt. Üblicherweise sind es weniger als 20 Zellen pro Schnitt, jedoch enthalten oft andere Schnitte im gleichen Well deutlich mehr Zellen.Transfizierte und andere Schnitte weisen weniger Zellen auf. Inkonsistenzen bei der Transfektionseffizienz zwischen den Schnitten sind in der Regel darauf zurückzuführen, dass entweder die Positionierung der Schnitte relativ zum Barrel nicht symmetrisch war oder dass das Gold nicht gleichmäßig um die Tubing beschichtet war, sondern sich auf einer Seite konzentrierte. Wenn zu viele Zellen transfiziert werden, versuchen Sie, den Abschussabstand zur Probe zu vergrößern, den Abschussdruck zu verringern oder die Menge an Gold zur Herstellung der Geschosse zu reduzieren.Hier sehen Sie ein hervorragendes Beispiel einer transfizierten ca1-Parasagittalmotoneuron. In dieser speziellen Zelle ist eine Goldkugel in die Zelle eingebettet erkennbar. Hier sehen Sie eine vergrößerte Ansicht eines transfizierten Neurons. In ca1 kann das Beschleunigen manchmal zu ungesunden Schnitten führen.Häufig führt die Druckwelle zu beschädigten Schnitten. Das Helios-Genkanonensystem wird mit einem Diffusor geliefert, der in der Mitte einen metallischen Querbalken aufweist. Wir entfernen den inneren metallischen Querbalken und verwenden stattdessen einen Metallsieb in dessen Stelle.Wir schneiden den Schirm einfach etwas größer als das Ende des Barrel-Innenrohrs und klemmen ihn zwischen das Ende des Barrel-Innenrohrs und den zugeschnittenen Diffusor. Wir haben festgestellt, dass dies die Gesundheit der Schnitte verbessert. Zudem variieren optimale Abschießbedingungen je nach experimenteller Präparation; um verschiedene experimentelle Präparationen zu optimieren, sollten der Druck am Heliumtank und der Abschießabstand zur Probe angepasst werden.Schließlich, falls Sie Bullets mit zwei unterschiedlichen Konstrukten für eine Doppeltransfektion verwenden möchten, stellen Sie sicher, dass beide Konstrukte unter demselben Promotor stehen. Auf diese Weise wird ein Promotor den anderen nicht übertrumpfen. Ich habe Ihnen soeben gezeigt, wie man Genkanonen-Bullets herstellt und wie man Hippocampus-Schnitte mittels BIC-Transfektion transfiziert.Dies ist eine äußerst leistungsfähige Methode zur Durchführung morphologischer Untersuchungen an einzelnen Neuronen, die isoliert abgebildet werden können. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Biology

Biologie

Gene-gun Transfektion von Neuronen im Hippocampus

Dieser Artikel zeigt die Präparation und Inkubation von Kaninchen-Netzhaut und Partikel-vermittelte Gentransfer von Plasmiden GFP oder eine Vielzahl von subzellulären Marker in retinalen Ganglienzellen.

Organotypischen Kultur der Adult Kaninchen Retina

Direkte intranukleären Injektion von cDNA ist eine effektive Transfektion Technik zur post-mitotischen Zellen. Diese Methode bietet ein hohes Maß an heterologen Proteinexpression von einzelnen oder mehreren cDNA-Konstrukte und ermöglicht Protein-Funktion, um in einem physiologisch relevanten Umfeld mit einer Vielzahl von Einzel-Zell-Assays untersucht werden.

Intranukleäre Mikroinjektion von DNA in Dissoziierte Adult Mammalian Neurons

Dies ist ein Protokoll zu erstellen und Aufrechterhaltung eines Neokortex Scheibe Vorbereitung in organotypischen Kultur zum Zwecke der Herstellung elektrischer Aufnahmen von pyramidalen Neuronen.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

Um eine rasche Beurteilung der Funktion von Genen in der Entwicklung der Hirnrinde führen, beschreiben wir Verfahren, die...

Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

Quelle: Keener, D. G., et al. Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Schnittkulturen von erregenden und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen des Hippocampus der Maus. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video zeigt den Prozess der Einzelzell-Elektroporation, um Plasmid-DNA in Neuronen in hippokampalen Schnittkulturen von Mäusen einzuführen. Das Verfahren umfasst eine präzise Pipettenpositionierung, Druckanpassungen und Elektroporationsimpulse, um die neuronale Membran...

Genexpression durch Einzelzell-Elektroporation in hippokampalen Schnittkulturen der Maus

Dieses Video zeigt das Protokoll für die Einzelzell-Elektroporation von Genen sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen in einer Reihe von in vitro hippokampalen Schnittkulturen. Die Technik ist nützlich, um spezifische molekulare und physiologische Funktionen von Neuronen zu untersuchen, einschließlich zellautonomer Mechanismen und transsynaptischer Proteininteraktionen.

Einzelzell-Elektroporation in organotypischen Hirnschnittkulturen: Eine In-vitro-Technik zur Verabreichung von Plasmiden in Zielneuronen in Hippocampus-Schnitten des Gehirns

Quelle: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Injektion eines Plasmidvektors, der das interessierende Gen trägt, in Interneuron-Vorläuferzellen in einem embryonalen Hirnschnitt, gefolgt von einer Elektroporation für den Plasmideintritt und die Genexpression. Diese modifizierten Vorläuferzellen können später zur Behandlung von Hirnerkrankungen...

Agarose-eingebetteter Elektroporations-unterstützter Gentransfer in kortikalen Interneuronen-Vorläuferzellen der Maus

Jüngste Verbesserungen bei organotypischen Hirnschnittpräparaten haben ihre Nutzung für biotechnologische Anwendungen ermöglicht. Organotypische Schnitte behalten lokale strukturelle Eigenschaften der in vivo-Biologie bei, einschließlich funktioneller synaptischer Verbindungen. Hier stellen wir eine regioselektive biolistische Verabreichungsmethode vor, um diese Scheiben zu markieren und genetisch zu manipulieren.

Regioselektive Biolistic Targeting in Organotypische Hirnschnitten mit modifizierter Gene Gun

Hier wird ein Protokoll für die Einzelzellelektroporation vorgestellt, das Gene sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen über eine Reihe von In-vitro-Hippocampus-Schichtkulturaltern hinweg liefern kann. Unser Ansatz bietet eine präzise und effiziente Expression von Genen in einzelnen Zellen, mit denen zellautonome und interzelluläre Funktionen untersucht werden können.

Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus

Lernen Sie die biolistische Transfektion von Neuronen in hippocampalen Schnittkulturen mit DNA-beschichteten Goldpartikeln. Diese Methode ermöglicht die gezielte Markierung einzelner Neuronen für morphologische Studien.

Vorbereitung der Gene Gun und Aufzählungszeichen Biolistic Transfektion von Neuronen in Scheiben Kultur

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