Name: Beurteilung der Eisenablagerung im Gehirn von 5xFAD-Mäusen durch Perls/DAB-Färbung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T12:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Lernen Sie die Perls/DAB-Färbung zur Bewertung von Eisenablagerungen im Gehirn von 5xFAD-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die sensitive Detektion von Eisen in Hippocampus und Cortex für Alzheimer-Forschung.

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<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+light+chain+interacts+with+pen-2+and+affects+%CE%B3-secretase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Ferritin light chain interacts with pen-2 and affects γ-secretase activity.</a> Neurosci Lett. 548, 90-94 (2013).</li>
<li>Jin Jung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+inactivation+of+protein+phosphatase+2a%2C+promoting+proinflammatory+nf-%CE%BAb+in+aged+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces inactivation of protein phosphatase 2a, promoting proinflammatory nf-κb in aged rat kidney.</a> Free Radic Biol Med. 61, 206-217 (2013).</li>
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Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung und hat sich zu einem ernsthaften Problem für die Gesellschaft entwickelt. Die Prävalenz von AD nimmt mit dem Altervon 1,2,3,4 Jahren dramatisch zu. Zu den primären pathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) gehören die Ablagerung von β-Amyloid (Aβ)-Plaques und neurofibrillären Tangles (NFTs) aufgrund einer aberranten Phosphorylierung von Tau-Proteinen. Aβ wird durch die sequentielle Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) durch β-Sekretase und γ-Sekretase-Enzyme erzeugt. Eine Dysregulation der Aβ-Produktion oder -Clearance führt zu einer Akkumulation im Gehirn und zur Bildung von Amyloid-Plaques, die als einer der frühesten pathologischen Marker der Alzheimer-Krankheit gelten. Diese Plaques verursachen nicht nur direkte neuronale Schäden, sondern lösen auch eine Kaskade schädlicher Effekte aus, darunter Neuroinflammation, oxidativer Stress und synaptische Dysfunktion. Zusammengenommen tragen diese Prozesse zum neuronalen Tod und dem fortschreitenden kognitiven Verfall bei, der in5 n. Chr. beobachtet wurde. Trotz jahrzehntelanger Forschung, die sich hauptsächlich auf die pathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) konzentriert, einschließlich der Ablagerung von Amyloid-β-Plaques und der hyperphosphorylierten Tau-Proteinaggregation, sind klinisch bedeutsame therapeutische Durchbrüche nach wie vor schwer fassbar, da bestehende Interventionen eine begrenzte Wirksamkeit bei der Modifizierung des Krankheitsverlaufs zeigen6.
Eisen ist ein wichtiges Metall für die Aufrechterhaltung der Gehirnfunktion und ist am Sauerstofftransport, der DNA-Synthese, der mitochondrialen Atmung, der Myelinsynthese, der Neurotransmittersynthese und dem Stoffwechsel beteiligt. Eisen wird jedoch schädlich, wenn die Konzentrationen die Kapazität der zellulären Sequestrierung überschreiten 6,7,8. Eine erhöhte Eisenablagerung, die in der Regel mit Aβ-Plaques kolokalisiert ist, wurde sowohl in kortikalen als auch in hippokampalen Regionen des Gehirns bei Patienten mitAD 9,10 beobachtet. Durch die Fenton-Reaktion11 kann intrazelluläres freies Eisen sowohl Hydroxylradikale (•OH) als auch reaktive Sauerstoffspezies erzeugen. Diese Schadstoffe induzieren nicht nur Neuroinflammation, indem sie Gliazellen aktivieren, sondern greifen auch die Biomoleküle der Zelle durch oxidativen Stress an, stören die normale Zellfunktion und führen zu synaptischer Dysfunktion 8,12. Darüber hinaus ist ein erhöhter Eisenspiegel direkt an der Entwicklung pathologischer Symptome der Alzheimer-Krankheit beteiligt: Eisen trägt zur Aβ-Produktion bei12 und erhöht auch die Dysfunktion des Tau-Proteins, was zu neurofibrillären Verwicklungen führt13.
Um den Eisengehalt im Gehirn zu bestimmen, wurden verschiedene Techniken entwickelt, darunter die Magnetresonanztomographie (MRT) sowie chemische und histochemische Methoden14. Die In-vivo-Quantifizierung des intrazerebralen Eisenspiegels mittels MRT ist klinisch wichtig für Patienten mit Alterung und Neurodegeneration15. Die MRT hat den Vorteil, dass sie nicht-invasiv und hochempfindlich ist: Sie kann Eisenablagerungen in den frühen Stadien der Erkrankung nachweisen. Insbesondere kann mit der feldabhängigen R2-Erhöhungstechnik (FDRI) zwischen verschiedenen Formen von Eisen unterschieden werden, wie z. B. Ferritineisen und Häm-Eisen16. Die MRT kann jedoch keine Eisenakkumulation auf zellulärer Ebene nachweisen und ist teuer, weshalb sie hauptsächlich in klinischen Untersuchungen eingesetzt wird17.
Die kolorimetrische Messung ist ein chemisches Verfahren, das die Konzentration einer Substanz (z. B. Eisen) bestimmt, indem die Intensität der Farbe gemessen wird, die durch die Reaktion der Substanz in Lösung mit einem chromogenen Mittel18 erzeugt wird. Diese Methode ist einfach durchzuführen und verwendet kostengünstige Reagenzien und Instrumente, wodurch sie für Labore mit begrenztem Budget geeignet ist18. Die Genauigkeit und Empfindlichkeit dieser Methode sind jedoch sehr begrenzt, da die Ergebnisse von Umweltfaktoren, der Farbentwicklungszeit und dem subjektiven Urteil des Bedieners beeinflusst werden. Die Flammenatomabsorptionsspektrometrie (FAAS) ist eine weitere Methode, mit der der Eisengehalt19 bestimmt werden kann. Bei diesem Verfahren wird eine geklärte Probenlösung erhalten, indem das interessierende Gewebe in einem Hochtemperaturofen verbrannt wird. Die Probe wird dann mit Salzsäure aufgelöst und die Eisenkonzentration in der Lösung mittels Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt. Diese Methode ist hochempfindlich und für alle Arten von biologischen Proben geeignet19. Das Verfahren ist jedoch zeitaufwändig und erfordert teure Geräte, so dass seine Verwendung begrenzt ist.
Die Perls'/DAB-Färbung zum Nachweis von Nicht-Häm-Eisen ist aufgrund ihrer hohen Spezifität und einfachen Implementierung im Vergleich zu anderen histochemischen Methoden die am häufigsten verwendete Eisennachweismethode14. Im Gegensatz zur kolorimetrischen Analyse handelt es sich bei der Perls-Färbung um eine qualitative histochemische Färbemethode, die auf der Reaktion zwischen Eisenionen und Kaliumferrocyanid beruht, um einen blauen Niederschlag zu erzeugen. Es wird verwendet, um das Vorhandensein und die Verteilung von Eisen im Gewebe mikroskopisch sichtbar zu machen. Darüber hinaus ermöglicht uns diese Methode, die Eisenablagerung in verschiedenen Zelltypen zu unterscheiden und die subzelluläre Verteilung der Eisenablagerung zu beobachten, was eine Methode zur Untersuchung von20 n. Chr. darstellt. Die Perls-Färbung weist in erster Linie Nicht-Häm-Eisen nach und hängt von der Bildung des Preußisch-Blau-Komplexes ab:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67501/67501eq01.jpg" style="margin: auto;">
(Preußisch blau)
Die traditionelle Perls-Färbung ist jedoch unwirksam, um die Eisenlokalisation bei niedrigen Eisengehalten zu erkennen. Wenn Diaminobenzidin (DAB) zugesetzt wird, reagiert es mit Eisenhexacyanoferrat unter Bildung einer braunen Verbindung, wodurch die Spezifität des Assayserhöht wird 21.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu beschreiben, wie die Menge und Verteilung der Eisenablagerung im Gehirn eines AD-Mausmodells zu beurteilen ist. In diesem Protokoll wurden 8 Monate alte 5×FAD (C57BL/6J) transgene Mäuse als AD-Mausmodell verwendet und mit Wildtyp-Mäusen gleichen Alters verglichen. Einzelheiten zu den Verfahren zur Herstellung des chemischen Reagenzes, zum Schneiden des Gehirns, zur Durchführung der Perls/DAB-Färbung und zur Analyse von Bildern, die nach der Färbung aufgenommen wurden, werden hier vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>0,1 M PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL601A</td><td>Fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, um eine Lösung herzustellen</td></tr><tr><td>4% PFA&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>P0099</td><td>Wiederherstellen bei 4 > C für den Einsatz</td></tr><tr><td>20X DAB-Lösung</td><td>Bioss</td><td>C-0003</td><td>Mix 10 &mu; l Lösung A, 10 &mu; l Lösung B und 180 &mu; l PBS</td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>Supelco</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>7647-01-0</td><td>Destilliertes Wasser zu 50 ml</td></tr><tr><td>Ketamin hinzufügen&nbsp;</td><td>China National Medicines</td><td>H20193336</td><td>100 mg/kg für die Anästhesiemikroskop</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CX43</td><td></td></tr><tr><td>Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferrocynidlösung</td><td>Sigma</td><td>14038-43-8</td><td>Fügen Sie destilliertes Wasser zu 50 ml</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin hinzu & nbsp;</td><td>Y-S Biotechnologie</td><td>YS-(BC)-2842</td><td>15 mg/kg zur Betäubung</td></tr><tr><td>von Xylolen</td><td>Sigma</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

beurteilung der eisenablagerung im gehirn von 5xfad-mäusen durch perls'/dab-färbung

Assessing Iron Deposition in the Brains of 5xFAD Mice by Perls'/DAB Staining

Um die Verteilung und Akkumulation von Eisen in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zu untersuchen, führten wir eine Perls/DAB-Färbung in sagittalen Schnitten von 8 Monate alten 5xFAD-Mäusen durch. Wie in Abbildung 3 gezeigt, wurden Perls/DAB-Färbesignale bei 8 Monate alten 5xFAD- und Wildtyp-Mäusen sowie bei 2 Monate alten Wildtyp-Mäusen beobachtet. In 5xFAD-Mäusen wurden hohe Perls'/DAB-Färbesignale im Hippocampus und im Kortex beobachtet, insbesondere im Subiculum des Hippocampus. Wi...

Beurteilung der Eisenablagerung im Gehirn von 5xFAD-Mäusen durch Perls'/DAB-Färbung

Alzheimer's disease (AD), a common neurodegenerative disease, is the leading cause of dementia in the elderly. Iron deposition is closely linked to the ...

assessing-iron-deposition-brains-5xfad-mice-perls-dab

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Einer der pathologischen Merkmale von AD ist die Bildung von Amyloid β Protein positive neuritischen Plaques. In diesem Protokoll beschreiben wir zwei Methoden, um neuritischen Plaques in transgenen AD-Modell-Mäusen zu erkennen: immunhistochemischen Nachweis über die ABC-und DAB-Methode und Fluoreszenzdetektion mit Thioflavin S-Färbung.

Nachweis von neuritischen Plaques bei Alzheimer-Maus-Modell

Quelle: Mukherjee, K., et. al. Analyse von Hirnmitochondrien mittels serieller Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie. J. Vis. exp. (2016)Dieses Video zeigt die Vorbereitung,  Bildgebung und Analyse von Hirngewebe von Mäusen mit einem seriellen Block-Face-Rasterelektronenmikroskop (SBFSEM) zur Visualisierung der mitochondrialen Ultrastruktur, die eine präzise Kartierung ihrer Morphologie und räumlichen Verteilung in axonalen und dendritischen neuronalen Kompartimenten ermöglicht.

 Bildgebung neuronaler Mitochondrien mit einem seriellen Block-Face-Rasterelektronenmikroskop

Mit Längs Zwei-Photonen - Mikroskopie Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren , um den Umbau des cerebrovasculature während Amyloid - Plaque - Akkumulation in vivo zu verfolgen. Ein ausgedünnten Schädel Vorbereitung ermöglicht die Visualisierung von Fluoreszenzfarbstoffen, das Fortschreiten von zerebrovaskulären Schädigung in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zu bewerten.

in Längsrichtung<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging des Cerebrovasculature: Bedeutung für ZNS-Erkrankungen

Quantitativ Metalle in Gewebe durch Laserablation Kartierung - induktiv gekoppelter Plasma - Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) ist eine empfindliche analytische Technik, die in neue Erkenntnisse liefern kann, wie Metalle in normaler Funktion und Krankheitsprozessen teilzunehmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Metalle in dünnen Schnitten von Mausgewebe neurologischen Bildgebung.

Imaging Metals im Hirngewebe durch Laserablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

In dieser Studie stellen wir eine einfache und effiziente Verfahren zur Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke unter neurodegenerativen Erkrankungen. Um unser Ziel zu erreichen, wir infundiert hochmolekularen Fluorescein Herstellung gekennzeichnet (FITC)-Albumin in Maus Jugular Ader und die Leckage in der Anwesenheit von Fluoreszenz-Mikroskopie bewertet.

Beurteilung der Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke durch intravenöse Infusion von FITC-markierte Albumin in einem Mausmodell der Neurodegenerative Erkrankung

Dieses Protokoll beschreibt einen effizienten und reproduzierbaren Ansatz für histologische Studien des Mausgehirns, einschließlich Perfusion, Hirnschnitt, frei schwebende Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung.

Frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirnen

Dieser Artikel zeigt, wie transferringebundenes nichtradioaktives Isotopeneisen für Studien zum Eisentransport in der Mausschwangerschaft vorbereitet und verabreicht wird. Der Ansatz zur Quantifizierung von isotopischem Eisen in fetoplazentaren Kompartimenten wird ebenfalls beschrieben.

Quantifizierung des Eisentransports über die Mausplazenta in vivo unter Verwendung nichtradioaktiver Eisenisotope

Hier wird ein Protokoll zur Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in tierischen Geweben bereitgestellt, wobei ein einfacher, gut etablierter kolorimetrischer Assay verwendet wird, der in den meisten Labors leicht implementiert werden kann.

Messung des Gewebe-Nicht-Häm-Eisengehalts mit einem Bathophenanthrolin-basierten kolorimetrischen Assay

Das vorliegende Protokoll beschreibt und vergleicht das Verfahren zur Durchführung einer Analyse der gesamten Region oder Subregion von Interesse an sagittalen Hirnschnitten der Maus zur Quantifizierung der Amyloid-Beta-Belastung im transgenen APP/PS1-Mausmodell der Alzheimer-Krankheit.

Voll- versus subregionale Quantifizierung der Amyloid-Beta-Belastung von Hirnschnitten der Maus

Frühgeburten (Entbindung &lt; 37. Woche) sind ein dringendes globales Gesundheitsproblem mit suboptimalen Präventions- und Behandlungsmöglichkeiten. Wir stellen ein Mausmodell der aufsteigenden vaginalen bakteriellen Infektion induzierten Frühgeburt vor und skizzieren, wie die daraus resultierende neonatale Morbidität und Mortalität analysiert werden kann.

Modellierung von aufsteigenden vaginalen Infektionen, Frühgeburten und neonataler Morbidität bei Mäusen

Lernen Sie die Perls/DAB-Färbung zur Bewertung von Eisenablagerungen im Gehirn von 5xFAD-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die sensitive Detektion von Eisen in Hippocampus und Cortex für Alzheimer-Forschung.

Beurteilung der Eisenablagerung im Gehirn von 5xFAD-Mäusen durch Perls'/DAB-Färbung

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