Äquibiaxiales Stretching-Gerät für die konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit lebenden Zellen mit hoher Vergrößerung

Wir untersuchen, wie Zellen im physiologischen und pathologischen Kontext auf mechanische Reize reagieren und sich daran anpassen. Dazu verwenden wir das Dehnungsgerät, um äußere Kräfte, in diesem Fall eine Dehnung, auf Zellen auszuüben.

Wir haben herausgefunden, wie Zellen und Zellgewebe auf bestimmte mechanische Reize reagieren und wie sie mechanisch auf andere biologische Reize reagieren.

Unser Dehnungsgerät ist im Vergleich zu anderen sehr vielseitig, da es die Möglichkeit bietet, Zellen, die auf Polyacrylamid-Gelen unterschiedlicher Steifigkeit kultiviert wurden, zu dehnen oder Kompressionsexperimente durchzuführen.

[Erzähler] Legen Sie zunächst die PMMA-Ringe auf ein Blatt weißes Bankpapier. Gehen Sie vorsichtig mit einer Klinge um den Rand der PDMS-beschichteten Platte herum, um einen sauberen Schnitt über den gesamten Umfang zu gewährleisten. Hebe die Membran an einer Kante mit einer Pinzette an und schäle sie dann vorsichtig mit dem Daumen, um die Hälfte der Membran gleichmäßig von der Platte zu lösen. Verteilen Sie mit den Fingern 96 % Ethanol gleichmäßig auf der gesamten Oberseite des PMMA-Rings. Entfernen Sie die PDMS-Membran vorsichtig von der Platte, indem Sie sie von der zuvor angehobenen Kante abheben. Legen Sie es dann symmetrisch auf den mit Ethanol überzogenen PMMA-Ring, um sicherzustellen, dass keine Falten entstehen und gleichzeitig eine Dehnung vermieden wird. Nehmen Sie dann einen weiteren leeren PMMA-Ring und setzen Sie ihn auf den Montagering. Verwenden Sie Metallklammern, um sie miteinander abzudichten, und klemmen Sie die PDMS-Membran zwischen die beiden Ringe. Positionieren Sie die untere Hälfte des Spannrings auf der Montagestütze. Setzen Sie den PDMS-Ring auf den Dehnungsring und drücken Sie ihn fest nach unten, bis er vollständig sitzt, um sicherzustellen, dass die Dichtung richtig positioniert ist. Legen Sie die kreisförmigen Messinggewichte auf die Probe. Lege dann die obere Hälfte des Metall-Stretchrings darauf und richte die Schraubenlöcher aus. Setzen Sie alle Schrauben ein und ziehen Sie sie fest. Schneiden Sie das PDMS vorsichtig mit einer Klinge um den Ring herum. Decken Sie die Baugruppe mit einer Petrischale ab, um die Membran vor Staub zu schützen. Bereiten Sie eine 250.000er Verdünnung von 0,2 Mikrometer fluoreszierenden Kügelchen in PBS durch serielle Verdünnung vor. Und geben Sie einen Tropfen der Bead-Lösung von 10 bis 30 Mikrolitern in die Mitte des PDMS. Lassen Sie es bei einer Temperatur von nicht mehr als 40 Grad Celsius trocknen, um Verwirrungen nach dem Aushärten zu vermeiden. Montieren Sie nun die Streckvorrichtung auf die Mikroskoptischhalterung und befestigen Sie den Reckpfosten am Mikroskop. Tragen Sie großzügig Gleitmittel auf die kreisförmige Fläche des Pfostens auf. Montieren Sie den vorbereiteten Spannring auf den Spannpfosten und schrauben Sie die obere Kappe fest, um die Montage abzudichten. Verbinden Sie dann die Rückseite des Vakuumsteuerkastens mit der Vakuumquelle, gefolgt von der Vorderseite des Kastens mit dem Stretchpfosten. Um die Dehnungskalibrierung durchzuführen, wählen Sie ein Interessengebiet mit einer hohen Raupendichte und für den Benutzer erkennbaren Raupenklumpen. Erfassen Sie ein Bild in Ruhe des ausgewählten Sichtfelds und speichern Sie die Position. Wenden Sie die Dehnung bei einem niedrigen Vakuum von minus 20 Millibar an, was zu Bewegungen in alle Richtungen führt. Fokussieren Sie nun in der Z-Ebene neu und bewegen Sie den Tisch in XY-Richtung, um denselben Interessenbereich zu lokalisieren und ein Bild im gestreckten Zustand aufzunehmen. Lassen Sie dann die Dehnung los und wiederholen Sie die Schritte mit einem höheren Vakuumniveau. Speichern Sie die aufgenommenen Bilder in einem Ordner, der nach Stichproben geordnet ist. Name, das Referenzperlenbild, das ohne Dehnung als reference_str1 aufgenommen wurde, und die Bilder, die bei zunehmendem Vakuum als stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 usw. gedehnt wurden. Um den Stamm zu quantifizieren, öffnen Sie MATLAB und laden Sie den Gel-Stammcode. Definieren Sie nach dem Festlegen der Parameter das übergeordnete Element sowie die Pfade des Experimentordners, und führen Sie den Code aus. Öffnen Sie dann stretched_str1, wie vom Code angefordert, gefolgt von der reference_str1. Berechnen Sie nun die mediane Dehnungsmatrix für jedes Vakuumniveau. Nachdem Sie diesen Vorgang für mindestens drei Proben wiederholt haben, zeichnen Sie die mediane Dehnungsmatrix in Abhängigkeit vom Vakuumpegel auf, um die Kalibrierkurve zu erhalten. Um den PDMS-Ring zu beschichten, sterilisieren Sie ihn 15 Minuten lang unter ultraviolettem Licht. Spülen Sie die Platte unter der Haube unter einer Biosicherheitswerkbank mit sterilem PBS ab. Nach dem Ansaugen des gesamten PBS, das zum Spülen der Platte verwendet wird. Geben Sie einen Tropfen der Lösung von 100 bis 200 Mikrolitern in die Mitte des Rings. Zeichnen Sie den Umfang des Tropfens mit einem Permanentmarker von der Unterseite der PDMS-Membran und inkubieren Sie ihn. Waschen Sie am Tag des Experiments das Adhäsionsprotein mit PBS. Nachdem Sie die Zellen trypsinisiert haben, fahren Sie mit der Zellzählung fort. Eine angemessene Anzahl von Zellen in einem kleinen Volumen von etwa 20 bis 50 Mikrolitern wird mit Standard-Zellmedien besiedelt, um die Anheftung zu fördern, und in einem Kohlendioxid-Inkubator mit Feuchtigkeitskontrolle inkubiert. Geben Sie nach 20 bis 30 Minuten vorsichtig 500 Mikroliter Medium auf die Zellen und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator, um eine weitere Zellausbreitung zu ermöglichen. Für einen einzigen Streckfreigabezyklus und eine Bildgebung montieren Sie den Streckring auf dem Mikroskoptisch, wie zuvor gezeigt. Nachdem Sie eine interessierende Zelle lokalisiert haben, notieren Sie deren Position und nehmen Sie ein Bild der vorgedehnten Zelle auf. Wenden Sie das gewünschte Vakuumniveau an, das der erforderlichen Substratdehnung entspricht, basierend auf der Kalibrierkurve, um die Zelle zu dehnen. Um die Streckzelle zu lokalisieren, fokussieren Sie zunächst in der Z-Ebene neu. Bewegen Sie sich dann in die XY-Richtung, um die Zelle im Sichtfeld zu zentrieren. Nehmen Sie Bilder während der gewünschten Dauer auf. Navigieren Sie zur ursprünglichen Position der Zelle und aktivieren Sie den Aufnahmemodus des Mikroskops, um sicherzustellen, dass die Bildaufnahme sofort nach der Neufokussierung beginnt. Lassen Sie die Dehnung los und fokussieren Sie schnell manuell in der Z-Ebene. Nehmen Sie Bilder der freigegebenen Zelle für die erforderliche Zeit auf und passen Sie den Fokus während der gesamten Aufnahme manuell an. Öffnen Sie für die Nachbearbeitung Fidschi und laden Sie die Bilder, die im Ruhezustand und während der Belastung aufgenommen wurden. Verwenden Sie den Fiji-Plug-in-Vorlagenabgleich, um einen Bereich der Zelle für die Ausrichtung auszuwählen. Die Kalibrierung gewährleistete die Reproduzierbarkeit und Kontrolle über die angelegte Dehnung und bestätigte eine nahezu lineare Beziehung zwischen Vakuum und Dehnung von bis zu 20 %. Die radiale Verschiebungsanalyse zeigte die Isotropie und Homogenität der Dehnung über der PDMS-Membran. Die Fluoreszenzbildgebung von Fibroblastenzellen unter Lebendzelldehnung zeigte Membraneinstülpungen bei der Dehnungsfreisetzung, die innerhalb von drei bis fünf Minuten resorbiert wurden. Die Restreckung fixierter Zellen ermöglichte die Bildgebung in einem gestreckten Zustand und verhinderte künstliche Faltungsartefakte. Die PDMS-Membran mit einem strukturierten Gitter erleichterte die multimodale Bildgebung und ermöglichte die Lokalisierung derselben Zellen in der Fluoreszenz- und Rasterelektronenmikroskopie. Zellen, die auf weichen, mit Fibronektin beschichteten PAA-Gelen saßen, bildeten nur dann fokale Adhäsionen, wenn sie im Vergleich zu nicht gedehnten Zellen spezifischen zyklischen Dehnungszyklen unterzogen wurden.