LED-basiertes In-vitro-Screening zur Beurteilung photoaktivierbarer Moleküle bei bakterieller photodynamischer Inaktivierung

Meine Forschung konzentriert sich auf die Erforschung verschiedener Moleküle aus der Familie der natürlichen und synthetischen Flavyliumverbindungen mit einem Hauptinteresse an der Untersuchung ihrer Bioaktivität im Zusammenhang mit dem UV-Lichtschutz und der Bewertung ihres Potenzials als Photosensibilisatoren für photodynamische Therapieanwendungen. Die jüngsten Erkenntnisse in unserer Arbeitsgruppe zeigten die lichtaktivierten Eigenschaften von Amino-basierten Flavyliumfarbstoffen und etablierten sie als vielversprechende neue Klasse von Photosensibilisatoren. Diese Verbindungen weisen ein erhebliches Potenzial für weitere Forschungen auf und ebnen den Weg für innovative Anwendungen in diesem Bereich.

Mit dem 96-Well-Mikroplatten- und Light-Panel-System können wir ein Hochdurchsatz-Screening von Photosensibilisatoren in einer kontrollierten Umgebung erhalten, was die Identifizierung und den Vergleich zwischen verschiedenen Kandidaten für die photodynamische Therapie vereinfacht. Zu Beginn führen Sie die Staphylococcus aureus-Bakterien auf einer Mueller-Hinton-Agarplatte aus der Stoppkultur ein. Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um eine frische Kultur zu erhalten.

Sammeln Sie zwei bis drei frische Kolonien von der Agarplatte und verdünnen Sie sie in sechs Millilitern vorgewärmtem, steril filtriertem PBS bei pH 7,4. Das Inokulum wird bei 1.200 Umdrehungen pro Minute für drei bis vier Zyklen vortext, um die Probe zu homogenisieren, und drei Milliliter des homogenisierten Inokulums in eine Einwegküvette entnommen. Nachdem Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern gemessen haben, verdünnen Sie die Probe mit PBS auf die optische Dichte von 0,1.

Bereiten Sie eine Stammlösung der photosensibilisierenden Verbindung in einem geeigneten Lösungsmittel wie DMSO oder PBS vor. Verdünnen Sie die Stammlösung in PBS, um die Arbeitslösung herzustellen, und stellen Sie sicher, dass die Komponenten des Bakterienkulturmediums die Lichtabsorption nicht beeinträchtigen. Wirbeln Sie die Arbeitslösung vor, um eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten.

Bereiten Sie zunächst die Staphylococcus aureus-Suspension und die Arbeitslösung für die Photosensibilisatorverbindung vor. Bereiten Sie zwei separate 96-Well-Platten vor, eine für die Lichtbestrahlung und eine für die Dunkelkontrolle. Geben Sie in jede Platte je 100 Mikroliter der Photosensibilisatorlösung und der Bakteriensuspension.

Mischen Sie die Lösungen 5 bis 10 Mal mit der Pipette. Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit der Photosensibilisator mit den Bakterienzellen interagieren kann. Nehmen Sie nach der Inkubation die Platten aus dem Inkubator.

Halten Sie eine der Platten vor Lichteinwirkung geschützt, da die Dunkelsteuerung aktiviert ist. Platzieren Sie die andere 96-Well-Platte über dem rechteckigen 50-Watt-LED-Panel. Markieren Sie die Ränder der Platte auf der LED-Oberfläche, um eine konsistente Platzierung über alle Protokollwiederholungen hinweg zu gewährleisten.

Setzen Sie die Platte ca. 15 Minuten lang LED-Licht aus. Verwenden Sie eine weitere 96-Well-Platte, um serielle Verdünnungen der Proben vorzubereiten, einschließlich Kontrollen, unbestrahlter und bestrahlter Wells. Geben Sie 180 Mikroliter PBS in jede Vertiefung, entsprechend der Anzahl der Proben.

Aliquotieren Sie 20 Mikroliter aus jeder Vertiefung in den bestrahlten und nicht bestrahlten Platten in die erste Säule der PBS-gefüllten Platte. Führen Sie mit einer Mehrkanal-Mikropipette eine einfache serielle Verdünnung von Vertiefung 1 bis 6 durch. Teilen Sie eine Agarplatte in sechs gleiche Abschnitte, wobei jeder Abschnitt einer der Verdünnungen entspricht.

Aliquotieren Sie 10 Mikroliter aus jeder Vertiefung auf den entsprechenden Abschnitt der Agarplatte. Inkubieren Sie die Platte 18 bis 20 Stunden lang. Nehmen Sie die Agarplatte aus dem Inkubator und identifizieren Sie Bereiche, die für die Koloniezählung geeignet sind.

Zählen Sie in jedem Abschnitt der Schneckenplatte die Anzahl der koloniebildenden Einheiten. Das Spektrum des sichtbaren Lichtbereichs zeigte drei unterschiedliche Peaks zwischen 400 und 700 Nanometern. Unter dunklen Bedingungen zeigte keine der getesteten Flavyliumverbindungen zytotoxische Wirkungen.

Im Gegensatz dazu führten die getesteten Verbindungen nach Lichtexposition zu einer dosisabhängigen Abnahme der Lebensfähigkeit von Staphylococcus aureus, wobei signifikante Effekte bei 6 und 12 mikromolaren Konzentrationen beobachtet wurden.