Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern mittels HeLa-Zellen und Immunzytochemie mit Lichtmikroskopie

Wir bieten eine Schritt-für-Schritt-Methode der Immunzytochemie (ICC) zum Nachweis von Anti-MDA5 an. Dieser Ansatz umfasst Zellfixierung, Permeabilisierung, Antikörperinkubation und bildgebende Verfahren, die den genauen Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern ermöglichen und die Diagnose einer schnell fortschreitenden interstitiellen Lungenerkrankung bei Myositis-Patienten unterstützen.

Der Hauptzweck des folgenden Experiments besteht darin, mit Hilfe der Immunzytochemie nach Anti-MDA5-Antikörpern zu suchen. Dies geschieht unter Verwendung der HeLa-Zellen und anschließender Transfizierung der HeLa-Zelle mit MDA5-Konstrukt. Auf diese Weise produzieren die HeLa-Zellen MDA5-Proteine, die durch MDA5-Antikörper gebunden werden können.

Nach dem Einschluss der HeLa-Zelle mit dem MDA5-Konstrukt wird das Triton-Reagenz verwendet, um die Membran der HeLa-Zellen zu permeabilisieren, wodurch die Anti-MDA5-Antikörper passieren können. Danach wird das Patientenserum hinzugefügt, das die Anti-MDA5-Antikörper enthält. Die Anti-MDA5-Antikörper würden dann an die MDA5-Proteine in den HeLa-Zellen binden.

Danach werden Sekundärantikörper, an die Meerrettichperoxidase gebunden ist, in die Zellen eingebracht, die Sekundärantikörper würden dann an die Anti-MDA5-Antikörper binden. Schließlich wird das Chromogen den Zellen zugesetzt und in Gegenwart von Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern oxidiert, wodurch unter einem optischen Mikroskop eine sichtbare Farbe entsteht. Ein positives Standergebnis würde etwa so aussehen wie das Bild oben.

In der heutigen Videodemonstration tauchen wir in einen kritischen Bereich der medizinischen Forschung ein, den Nachweis von Anti-Melanom-Differenzierungs-assoziierten Gen-5-Antikörpern, auch Anti-MDA5-Antikörper genannt. Diese Autoantikörper spielen eine entscheidende Rolle als einfacher diagnostischer Indikator für Patienten mit interstitieller Lungenerkrankung, insbesondere für Patienten mit schnell fortschreitenden Lungenerkrankungen. Die Bedeutung dieser Forschung liegt in ihrem potenziellen Einfluss auf die Patientenergebnisse. Der frühzeitige und genaue Nachweis von MDA5-Autoantikörpern ist für die effektive Behandlung dieser schweren Autoimmunerkrankung von entscheidender Bedeutung.

Der Hauptvorteil der von uns demonstrierten Methode gegenüber der goldenen Methode des Screenings von Anti-MDA5-Autoantikörpern besteht darin, dass sie schneller durchgeführt werden kann und im Vergleich zum herkömmlichen radiomarkierten Immunvisitationsassay Zeit und Mühe spart. Diese Effizienzsteigerung ermöglicht es uns, mehr Proben zu verarbeiten und schnell Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass unsere Methode im Vergleich zum Übergangs-Immunpräzipitationsassay nicht nur eine überlegene Effizienz, sondern auch eine überlegene Sicherheit und Kosteneffizienz bietet.

Schauen wir uns nun an, wie es gemacht wird. Mein Forschungsassistent, Teo Kai Fa, wird das Verfahren leiten. Pflegen Sie HeLa-Zellen mit Dulbecco's Modified Eagle's Medium mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % antibiotischem Antimykotikum bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2.

Durchgang der Zellen alle zwei bis drei Tage oder wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 bis 100 % erreichen. Setzen Sie 70.000 HeLa-Zellen auf jede Vertiefung von einer 24-Well-Platte. 24 Stunden vor der Transfektion, und netzen die Zellen, die etwa 90% Konfluenz aufweisen.

500 Nanogramm Plasmin und 1,5 Mikroliter Transfektionsreagenz werden in je 25 Mikroliter reduziertem Serummedium verdünnt. Fügen Sie verdünnte DNA hinzu und führen Sie ein verdünntes Transfektionsreagenz im Verhältnis eins zu eins durch. Gut mischen und fünf Minuten inkubieren.

Geben Sie die Mischung in die Zellen, die einen Tag zuvor gesessen wurden, und rühren Sie, um den DNA-Lipidkomplex sofort zu mischen. Vergewissern Sie sich, dass die Zellen zu 80 bis 90 % konfluent sind. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten 5%CO2-Hemisphäre 40 bis vier Stunden und fahren Sie mit der Immunzytochemie fort.

Wir verwenden einen handelsüblichen Faktor. Weitere Informationen finden Sie in der Werkstofftabelle. Ihre Transfektionswirksamkeit beträgt 50 %Der Erfolg der Transfektion und der Expression des Zielproteins kann bestimmt werden, indem die Zellen mit gefrorenem Protein transfiziert werden, das Plasmid exprimiert und westliches Blut leitet, um die Expression des Zielproteins zu visualisieren. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um alle verbleibenden Medien zu entfernen.

Das Waschen kann durch Schütteln der Platte oder eines Orbitalschüttlers erfolgen. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS Vorsicht. Paraformaldehyd ist giftig.

Verwenden Sie geeignete Handhabungsrichtlinien. Lassen Sie die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Entsorgen Sie anschließend das Fixierreagenz.

Verwenden Sie PBS, um die Zelle zweimal zu waschen. Tragen Sie das Triton-Reagenz auf und lassen Sie die Zellen dann 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Wir haben Triton X 400 in PBS in einer Konzentration von 0,3 % verwendet. Entsorgen Sie das Triton-Reagenz.

Fügen Sie PBS hinzu, um die Zellen einmal zu waschen. Führen Sie im nächsten Schritt eine Blockierung mit 10% fötalem Rinderserum in PBS durch und lassen Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Blockierungsreagenz. Fügen Sie dann PBS hinzu, um die Zellen einmal zu waschen.

Geben Sie das verdünnte Patientenplasma in die Zellen. Stellen Sie sicher, dass Sie das Patientenplasma vor der Anwendung in einem Verhältnis von eins zu 5.000 Verdünnung in PBS verdünnen. Passen Sie die Verdünnung an, um das Signal zu verstärken, oder reduzieren Sie den Hintergrund, um unverzerrte Ergebnisse zu gewährleisten.

Das Personal führte den Test durch, hatte keine Kenntnis davon, welche Proben zu Patienten und welche zu gesunden Personen gehörten. Inkubieren Sie eine Probe 12 bis 16 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Entnehmen Sie nach der Inkubationszeit die Probe des Patienten und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.

Behandeln Sie die Zellen mit verdünntem Meerrettichperoxidase-konjugierter Ziege, Anti-Human-IgG in einem Verhältnis von eins zu 250 Verdünnung in PBS. Lassen Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Eine Stunde später entsorgen Sie den Sekundärantikörper.

Dreimal mit PBS spülen. Färben Sie die Zellen nach dem Waschen der Zellen mit 300 Mikrolitern DAB-Arbeitslösung pro Well. Die DAB-Arbeitslösung wird durch fehlendes DAB-Werbekonzentrat und DAB-Verdünnungsmittel gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt.

Nachdem Sie die Zelle fünf Minuten lang gefärbt haben, entfernen Sie den Farbstoff. Nach dem Entfernen des Farbstoffs mit dem ionisierten destillierten Wasser abspülen und fünf Minuten lang schütteln. Den Zellkern mit verdünntem Hämatoxin gegenfärben.

Wir verwenden Hemotoxin in einer 10-fachen Verdünnungsfalte. Warten Sie fünf Minuten, bis der Färbevorgang abgeschlossen ist. Entsorgen Sie nach fünf Minuten das Hämotoxin und waschen Sie es dann zweimal für jeweils fünf Minuten mit dem analysierten destillierten Wasser.

Betrachten Sie im letzten Schritt die Färbeergebnisse unter einem optischen Mikroskop. Lassen Sie uns unsere immunzytochemischen Assay-Ergebnisse für Anti-MDA5-Autoantikörper interpretieren. Ein positives Ergebnis.

Ein True Positive zeigt eine starke braune Färbung innerhalb von HeLa, die MDA5 exprimiert. Dies bestätigt Anti-MDA5-Autoantikörper in der Probe des Patienten. Ein negatives Ergebnis.

Ein negatives Ergebnis zeigt HeLa-Zellen ohne braune Färbung, was auf keine Anti-MDA5-Autoantikörper hinweist. Ein falsch positives Ergebnis. Kritisch ist, dass ein falsch positives Ergebnis eine ausgedehnte Braunfärbung in allen Zellen zeigt, unabhängig von der MDA5s-Expression.

Diese unspezifische Färbung, die bei Autoimmunerkrankungen auftritt, muss von einer richtig positiven Färbung unterschieden werden, um Fehldiagnosen zu vermeiden. Unsere Methode bietet eine schnellere, sicherere und kostengünstigere Möglichkeit, Anti-MDA5-Organantikörper nachzuweisen. Dies hat das Potenzial, die Patientenergebnisse bei der Behandlung von interstitiellen Lungenerkrankungen erheblich zu beeinflussen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie gelernt, wie Sie das immunzytochemische Verfahren durchführen und wie Sie klinische Relevanz in den Testergebnissen identifizieren können.