Name: Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Erfahren Sie eine optimierte Fluoreszenzmarkierungsmethode zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine in Zebrafischlarven. Dieses Protokoll vereinfacht den Donor-Konstruktionsprozess und ermöglicht effiziente Proteinlokalisierung in vivo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszierende Proteinmarkierung in Zebrafischlarven mittels CRISPR/Cas9-Knock-in

<ol><li>Brittijn, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+regeneration%3A+new+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+imaging+reveals+hidden+oncogenic-normal+cell+communication+during+primary+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis.</a> Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).</li>
<li>Gomes, M. C., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+modeling+human+infection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The case for modeling human infection in zebrafish.</a> Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li>
<li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transparent+zebrafish%3A+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Sci Rep. 6, 29490(2016).</li>
<li>He, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ligase+3-dependent+microhomology-mediated+end+joining+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos.</a> Mutat Res. 780, 86-96 (2015).</li>
<li>Hisano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+in-frame+integration+of+exogenous+DNA+mediated+by+CRISPR%2FCas9+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish.</a> Sci Rep. 5, 8841(2015).</li>
<li>Luo, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+of+zebrafish+using+a+seamless+integration+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy.</a> FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> Elife. 9, e53968(2020).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+tagging+strategies+for+illuminating+expression+profiles+of+genes+with+different+abundance+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish.</a> Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).</li>
<li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li>
<li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR+based+protocol+for+detecting+indel+mutations+induced+by+TALENs+and+CRISPR%2FCas9+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish.</a> PLoS One. 9 (6), e98282(2014).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+39.9+protein+is+necessary+for+coordinated+activation+of+slow-twitch+muscle+and+normal+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish.</a> J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).</li>
<li>Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+expression+analysis%2C+and+functional+characterization+of+connexin44.1%3A+a+zebrafish+lens+gap+junction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein.</a> Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).</li>
<li>Urushibata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+developmental+speed+in+zebrafish+embryos+using+different+incubation+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures.</a> Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+digestion+and+ligation-mediated+PCR+used+for+flanking+sequence+walking%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking.</a> Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1000 &Mikro; L&nbsp; Tipps</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für alle Manipulationen</td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für die Lagerung und Zentrifugation verschiedener Lösungen</td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen (RNase-frei)</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für die Lagerung und Zentrifugation von RNase-freien Lösungen</td></tr><tr><td>10 & Mikro; L Spitzen</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für alle Manipulationen</td></tr><tr><td>10 & Mikro; L-Spitzen (RNase-frei)</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für RNase-freie Manipulationen</td></tr><tr><td>1000 & Mikro; L&nbsp; Spitzen (RNase-frei)</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für RNase-freie Manipulationen</td></tr><tr><td>1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>Zur Hemmung der Melanogenese und zur Transparenz der Larven</td></tr><tr><td>200 & Mikro; L Spitzen</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für alle Manipulationen</td></tr><tr><td>200 & Mikro; L-Spitzen (RNase-frei)Jede</td> <td>Marke</td><td>N/A</td><td>Für RNase-freie Manipulationen</td></tr><tr><td>2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)</td><td>Vazyme</td><td>P213-03</td><td>PCR für sgRNA-Effizienztests</td></tr><tr><td>35-mm-Schalen</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Für die Bildgebung</td></tr><tr><td>von 6-Well-Platten</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für die individuelle und vorübergehende Aufzucht von Zebrafischen</td></tr><tr><td>Acc65I</td><td>NEB</td><td>R0599S</td><td>Für enzymatischer Aufschluss</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td>Für die Herstellung von TAE-Puffern</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Biofroxx</td><td>8211GR500</td><td>Für LB-Platten</td></tr><tr><td>Ampicillin, Natriumsalz</td><td>Sangon</td><td>A610028</td><td>Für LB-Platten</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>Für die Vorbereitung von Embryopuffern</td></tr><tr><td>Kapillarröhrchen</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0016</td><td>Für Geneating-Nadeln für Injektionskanülen</td></tr><tr><td>Kapillarröhrchen</td><td>Beliebige</td><td>Markenkennung (Innendurchmesser) = 0,1 mm</td><td>Zur Quantifizierung eines 1-nL-Tröpfchens</td></tr><tr><td>CRISPRscan</td><td>CRISPRscan</td><td>&nbsp; http://www.crisprscan.org/</td> <td>Für das sgRNA-Design</td></tr><tr><td>DH5&alpha;</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td>Für die Transformation</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Für die Vorbereitung von Lysepuffer und TAE-Puffern</td></tr><tr><td>Ensembl Ensembl</td><td></td>&<td>nbsp; https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index</td><td>Um Geninformationen zu finden</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>HUSHI</td><td>64-17-5</td><td>Für die DNA-Reinigung und -Extraktion</td></tr><tr><td>Exonuklease III</td><td>Takara</td><td>2170A</td><td>LIC</td></tr><tr><td>Gasbetriebener Mikroinjektor</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td>Für Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Gelelektrophoresesystem</td><td>WIX</td><td>WIX-EP3000</td><td>Für Gel Elektrophorese</td></tr><tr><td>Handschuhe</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für alle Manipulationen</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>sgdbio</td><td>10010518</td><td>Für LB-Platten</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sangon</td><td>A501745</td><td>Für LB-Platten</td></tr><tr><td>gRNA-pMD19-T</td><td>China Zebrafish Resource Center (CZRC)</td><td>CZP3</td><td>sgRNA-Plasmid mit sgRNA-Gerüst</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Für Embryo Puffervorbereitung</td></tr><tr><td>Lithiumchlorid-Fällungslösung</td><td>Thermofisher</td><td>AM9480</td><td>Fällung von sgRNAs, RNase-frei</td></tr><tr><td>Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt</td><td>Sangon</td><td>A600015</td><td>Zur Herstellung von 4% Agarose-Gelen</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>sgdbio</td><td>20025118</td><td>Für LB-Platten</td></tr><tr><td>Metallbad</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für Inkubation bei konstanter Temperatur</td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Für die Vorbereitung von Embryopuffern</td></tr><tr><td>Mikroinektionsform</td><td>Hausgemacht</td><td>N / A</td><td>Zum Generieren von Rillen zum Halten von Embryonen während der Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Microloader, Spitze zum Befüllen von Femtotips und anderen Glasmikrokapillaren, steril, 0,5 &ndash; 20 & Mikro; L, 100 mm, hellgrau, 192 Stk. (2 Körbe & mal; 96 Stk.)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Zum Laden der Mikroinjektionslösung in die Injektionsnadel, RNasefreier</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Zum Erzeugen von Injektionsnadeln</td></tr><tr><td>Mikropipetten</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Für alle Manipulationen</td></tr><tr><td>Mikrowelle</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Zum Gießen von Injektionsplatten und Agarosegelen</td></tr><tr><td>MinElute PCR Aufreinigungskit (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28004</td><td>Zur Aufreinigung von PCR-Produkten und Aufschlussprodukten, RNase-freie</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Transkriptionskit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1348</td><td>In-vitro-Transkription von Cas9 mRNA, RNase-frei</td></tr><tr><td>N2</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für Mikroinjektion</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Für die Vorbereitung von Embryopuffer und Lysepuffern</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Für die Vorbereitung von Embryopuffern</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sangon</td><td>A100173</td><td>Für die Vorbereitung von TAE-Puffern</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Thermofisher</td><td>R0581</td><td>RNA-bezogene Manipulationen, RNase-freies</td></tr><tr><td>PciI</td><td>NEB</td><td>R0655S</td><td>Für enzymatische Aufschluss-PCR-Maschinen</td></tr><tr><td></td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>PCR-Amplifikation</td></tr><tr><td>PCR-Streifenröhrchen</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für PCR</td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen</td><td>FEITONGKANG</td><td>blp-200</td><td>Für PCR</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für die Aufzucht von Zebrafischlarven usw.</td></tr><tr><td>Phenolrot</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Für Mikroinjektionen, RNasefreier</td></tr><tr><td>Pipettenhalter</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-PH1</td><td>Für Mikroinjektionen</td></tr><tr><td>PrimeStar (Premix)</td><td>Takara</td><td>DR040A</td><td>Für die molekulare Klonierung</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Merck</td><td>539480</td><td>Für die Extraktion genomischer DNA</td></tr><tr><td>pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)</td><td>China Zebrafish Resource Center (CZRC)</td><td>CZP11</td><td>Cas9 Plasmid-Template</td></tr><tr><td>Gekühlte Zentrifuge</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für RNA-bezogene Zentrifugation</td></tr><tr><td>Waage</td><td>Sartorius</td><td>BCE124-1CCN</td><td>Zum Gießen von Injektionsplatten und Agarose-Gelen</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Zum Scheren von adulten Fischschwänzen</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sangon A600485</td><td></td><td>Zur Vorbereitung</td></tr> <tr><td>von LysepuffernKleine Bürsten</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für sanft bewegte Embryonen auf Mikroinjektionsplatten</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Thermofisher</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Für DNA/RNA-Konzentrationsmessungen</td></tr><tr><td>Tischmikrometer</td><td>Jede Marke</td><td>DIV (Division) = 0,01 mm</td><td>Für die Quantifizierung eines 1-nL-Tröpfchens</td></tr><tr><td>Stereo-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Für die Beobachtung der Genexpression</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Für Beobachtung und Mikroinjektion</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>In-vitro-Transkription von sgRNAs, RNase-frei</td></tr><tr><td>Temperaturgesteuerter Inkubator</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für die Inkubation von Embryonen</td></tr><tr><td>TIDE</td><td>TIDE https://tide.nki.nl/</td> Für die Analyse der <td>sgRNA-Effizienz</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tricain-Methansulfonat</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Für die Zubereitung von Tricain-Lösungen</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon</td><td>A600194</td><td>Für Tricain-Lösung, Lysepuffer und TAE-Puffer-Zubereitung</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td>Für LB-Platten</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Zum Schneiden von Injektionsnadeln</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td>Für enzymatische Aufschluss</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td>Für LB-Platten</td></tr><tr><td>Zebrafisch-Aquariensystem</td><td></td><td>ESEN ESEN-AW-S1</td><td>Für die Aufzucht von erwachsenen Fischen</td></tr><tr><td>Zebrafisch-Paarungsbecken (mit Trennwand)</td><td>Jede Marke</td><td>N/A</td><td>Für die Verpaarung der</td></tr><tr><td>Fische Zeiss LSM 900+Airyscan2</td><td>ZEISS</td><td>Zeiss LSM900</td><td>Für die konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Fischen und die Datenanalyse</td></tr><tr><td>ZFIN-Website</td><td>ZFIN</td><td>http://zfin.org/</td> <td>Um Geninformationen zu finden</td></tr></tbody></table>

fluoreszenzmarkierung zur visualisierung niedrig exprimierter proteine im zebrafisch

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

Gap Junctions, die aus polymeren Proteinen, den Connexinen, bestehen, sind essentiell für den Austausch von niedermolekularen Metaboliten und Ionen zwischen Kontaktzellen. Die oben beschriebene Methode zur Fluoreszenz-Proteinmarkierung wurde zur Markierung von Connexin 39.9 (Abbildung 5A) bzw. Connexin 44.1 (Abbildung 5B) verwendet. Die korrekte KI wurde durch Junction-PCRs verifiziert (Abbildung 6). In Übereinstim...

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

fluorescence-labeling-to-visualize-low-expressed-proteins-in-zebrafish

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Entwicklungsbiologie. Hier präsentieren wir ein hochauflösendes Doppel-Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll zur Analyse der genauen Expressionsmuster eines einzelnen Gens und zur Bestimmung der Überlappung der Ausdruck Domains von zwei Genen. Wir gehören eine Propidiumiodid nukleare Gegenfärbung des Gewebes Organisation hervorzuheben.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Dieses Protokoll zeichnet ein Weg, um Etiketten und Spurenelemente das Schicksal der kleinen Gruppen von Zellen Zebrafischembryonen mit UV-Uncaging der Käfig Fluorescein, durch whole mount Immunomarkierung, um das Signal aus dem uncaged Fluoreszein verstärken gefolgt.

Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Sterbenden Zellen werden extrudiert aus epithelialen Geweben durch konzertierte Kontraktion der benachbarten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir Methoden zu induzieren und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis auf zellulärer Auflösung.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Eine Methode ist beschrieben, um einzelne Zellen mit einem Käfig fluoreszierenden Proteins mit Zwei-Photonen-Absorption aus einer Ti photoaktivieren: Sapphire Femtosekunden-Laser-Oszillator. Um das Schicksal der Karte photoaktivierte Zelle, ist die Immunhistochemie verwendet. Diese Technik kann auf jeden Zelltyp angewendet werden.

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Die Zebrafischembryo ist ein hervorragendes Modell für Entwicklungsbiologie Forschung. Während der Embryogenese entwickeln Zebrafisch mit einem Dottermasse, die dreidimensionale Herausforderungen für die Proben Beobachtung und Analyse präsentiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zweidimensionale Flachmontage Zubereitungen der ganze Berg in situ (WISH) gefärbt Zebrafischembryo Proben erstellen.

Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Protein-Spiegel in Zellen und Geweben werden oft dicht durch das Gleichgewicht der Proteinproduktion und Freigabe geregelt. Verwendung Fluoreszenzabklingzeit Nach Photokonversion (FDAP) können die Clearance-Kinetik von Proteinen experimentell in vivo gemessen werden.

Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Gezielte Manipulationen, um gezielten Stress oder Tod in einzelnen Zellen zu verursachen, waren relativ schwierig zu bewerkstelligen. Hier wird ein Ablationsansatz mit Einzelzellauflösung beschrieben, um einzelne Zellen in Zellkulturen und lebenden Tieren selektiv zu stressen und abzutöten, basierend auf einem konfokalen Standard-UV-Laser.

Das Auslösen Zellstress und Tod unter Verwendung von herkömmlichen UV-Laser konfokale Mikroskopie

Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

Erfahren Sie eine optimierte Fluoreszenzmarkierungsmethode zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine in Zebrafischlarven. Dieses Protokoll vereinfacht den Donor-Konstruktionsprozess und ermöglicht effiziente Proteinlokalisierung in vivo.

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

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