Name: Quantifizierung der dreidimensionalen Zellmigration innerhalb und in granuläre Hydrogel-Biomaterialien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie quantitative 3D-Zellmigration in granulären Hydrogel-Biomaterialien mittels konfokaler Mikroskopie und Imaris-Software. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellbewegung in Geweberegeneration und Wundheilung.

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<ol><li>Jerka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+endothelial+cell+migration%3A+Insights+into+fundamental+forces%2C+inflammation%2C+biomaterial+applications%2C+and+tissue+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Unraveling endothelial cell migration: Insights into fundamental forces, inflammation, biomaterial applications, and tissue regeneration strategies.</a> ACS Appl Bio Mater. 7 (4), 2054-2069 (2024).</li>
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<li>Nandi, S., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+cell+migration+within+three-dimensional+in+vitro+wound+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments.</a> J Vis Exp. 126, e56099(2017).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Adv Mater. 34 (12), 2109194(2022).</li>
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<li>Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+characterize+granular+hydrogel+rheological+properties%2C+porosity%2C+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion.</a> ACS Biomater Sci Eng. 8 (4), 1427-1442 (2022).</li>
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<li>Puiggalí-Jou, A., Asadikorayem, M., Maniura-Weber, K., Zenobi-Wong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor-loaded+sulfated+microislands+in+granular+hydrogels+promote+hMSCs+migration+and+chondrogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Growth factor-loaded sulfated microislands in granular hydrogels promote hMSCs migration and chondrogenic differentiation.</a> Acta Biomater. 166, 69-84 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>ThermoFisher</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>VWR International</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Grün CMFDS Farbstoff, 1 mg</td><td>ThermoFisher</td><td>C2925</td><td>20 x 50 ug Einheiten, 492/517 nm</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td>75016085</td><td>ST Plus Serie</td></tr><tr><td>Klare 96-Well-Platte</td><td>MilliPore Sigma</td><td>CLS3997-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25950CQC</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Fibroblasten-Basalmedium</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-030</td><td>480 mL, phenolrotfreies</td></tr><tr><td>Fibroblasten-Wachstumskit - Low Serum</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-041</td><td>7,5 mM L-Schwemme, 5 ng/mL rh FGF basisch, 5 ug/mL rh Insulin, 1 μg/mL Hydrocortison, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 2% FBS</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Public humane</td></tr><tr><td>dermale Fibroblasten</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>adulte humane dermale Fibroblasten</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro Confocal</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Konfokales Spinning-Disc-Mikroskop mit 4-facher, 10-facher Vergrößerung</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>3/4D Imaged Visualisierungs- und Analysesoftware, proprietärer</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>ThermoFisher</td><td>Finnpipette F2 Pipetten mit variablem Volumen</td><td>HeraCell Vios 160i CO2-Inkubator, 165L</td></tr><tr><td>M-20 Mikrotiterplatten-Schwingschaufelrotor</td><td>ThermoFisher</td><td>75003624</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Fisher Scientific</td><td>9004-67-5</td> Mikrozentrifugenröhrchen in <td>Laborqualität, Pulverform</td></tr><tr><td>Fisherbrand</td><td></td><td>05-408-129</td><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (4%)</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ19943K2</td><td>Zur Befestigung&nbsp;</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Corning</td><td>08-757-100A</td><td>Bakteriologische Petrischalen mit Deckel 35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>ThermoFisher</td><td>4642080</td><td>Finnpipette F2 Pipetten mit variablem Volumen</td></tr><tr><td>Steril PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Fisher Scientific</td><td>327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung der dreidimensionalen zellmigration innerhalb und in granuläre hydrogel-biomaterialien

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Dieses Protokoll zielt darauf ab, die notwendigen Schritte für zwei neuartige granulare Gerüstmigrationsassays zu beschreiben. Die MAMA-Methode kann verwendet werden, um die zelluläre Infiltration an einer Gewebegrenzfläche zu bewerten. Granulierte Hydrogele sind ein komplexeres System als Bulk-Hydrogele und daher von Natur aus komplexer zu verarbeiten für die Migration 9,20. Es ist wichtig, den in Abbildung 1 beschriebenen schrittweisen Prozess zu verstehen. Jeder Schritt baut auf dem nächsten auf und wurde in diesem Protokoll optimiert. Das Aussäen von HDFs bei einer Dichte von 120.000 Zellen/cm2 führt über Nacht zu einer Konfluenz von mindestens 80 % (Abbildung 1A), und diese nicht fluoreszierenden Zellen werden am besten am Tag des Experiments mit einem Zellverfolgungsfarbstoff markiert, um das Bildgebungspotenzial zu maximieren (Abbildung 1B). Dieses Protokoll entspricht der geringeren Zentrifugalkraft, die bei der HDF-Passage verwendet wird, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Aufgrund des Winkels, der für einen einzigen Zentrifugationsschritt erzeugt wird, ist es notwendig, die Platte um 180° zu drehen, um sicherzustellen, dass sich das Gel verschiebt und die Bodenfläche der Wells vollständig bedeckt (Abbildung 1C). Wenn sich die Zellen nach dem Glühen 30 Minuten lang im Inkubator erholen können (Abbildung 1D), bleibt die Lebensfähigkeit der Zellen erhalten und führt zu einer optimalen Migration (Abbildung 1E). Ein großer Bereich einer 96-Well-Platte kann mit einem 4-fach-Objektiv abgebildet und von einem Zeitpunkt von 0 bis 24 Uhr angepasst werden (Abbildung 2A,B), um das Zellverhalten umfassend zu beurteilen. Die Verarbeitung der resultierenden Z-Stack-Bilder in der Analysesoftware bietet erweiterte Analysen für mehrere große Datensätze in einer benutzerfreundlichen Oberfläche. Dieses Protokoll fasst die Schritte zum Erstellen von Datensätzen für die Zellenhöhe oder Position Z zu jedem Zeitpunkt zusammen, der mit den repräsentativen Bildern in Abbildung 2B, C visualisiert wird. Die Analyse der verarbeiteten Daten ist in Abbildung 3A dargestellt, visualisiert mit dem Mittelwert der Medianhöhen und ihrer Standardabweichung für jeden Zeitpunkt, und die Faltenänderungshöhe von nicht migrierenden Zellen bei t = 0 h ist in Abbildung 3B dargestellt. Die dieser Methode zugrunde liegenden Daten sind in der Regel nicht normalverteilt, so dass Mediane robustere Vergleichsmaße sind und daher zur Zusammenfassung der Daten verwendet werden.
Ebenso kann die PLOSMA-Methode verwendet werden, um die Motilität von abgegebenen Zellen innerhalb eines 3D-körnigen Hydrogel-Gerüsts zu bewerten. Abbildung 4A zeigt die Schritte zur PLOSMA-Methode, und es ist besonders wichtig, das Sphäroid in der Mitte des Wells zu säen. Es wird empfohlen, das Sphäroid im Sichtfeld zu zentrieren, hängt aber von den Fähigkeiten des Mikroskops ab. Abbildung 4B zeigt repräsentative Bilder der Sphäroidausbreitung für t = 0 h und t = 24 h, aufgenommen bei 10-facher Vergrößerung im FITC-Kanal (488 nm). In der Software kann ein Ursprungsreferenzrahmen erstellt und an jeden Z-Stapel angepasst werden (Abbildung 5A, B). Die Software kann den radialen Abstand von diesem Ursprungsreferenzrahmen verfolgen und als gewünschten Datensatz exportieren (Abbildung 5C). Abbildung 6A zeigt ein repräsentatives Bild des 3D-Renderings des Sphäroids t = 24 h, während Abbildung 6B die Spots-Funktion der Software zeigt. Ein Beispiel für die verarbeiteten Daten ist in Abbildung 7 dargestellt. Abbildung 7A zeigt die durchschnittliche Entfernung, die vom Zentrum zurückgelegt wurde, normiert auf die Entfernungen von Tag 0. Abbildung 7B isoliert die zurückgelegten Entfernungen nur in der Z-Ebene, da dies die Richtung ist, die die PLOSMA-Methode untersuchen soll.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Monolayer-basierter Ascending Migration Assay, Zellkultur und Bildgebung. Schematische Darstellung der wichtigsten Schritte in der Zell- und Gelverarbeitung für MAMA. (A) Die Zellen werden über Nacht zur Konfluenz gezüchtet, und (B) der Zellverfolgungsfarbstoff wird kurz vor der Zugabe des körnigen Gels hinzugefügt. Das Gerüst wird mittels (C)-Plattenzentrifugation zusammengebaut und mit (D)-Fotovernetzung stabilisiert. Die Bildgebung zu mehreren Zeitpunkten ermöglicht (E) die Visualisierung der Zellmigration nach oben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig02.jpg"> 
Abbildung 2: MAMA-Bildverarbeitung. Repräsentative Bilder der Bildverarbeitung. Vergleich von konfokalen Rohbildern in der Draufsicht und Seitenansicht bei (A) t = 0 und (B) t = 24 h im FITC-Kanal bei 4-facher Vergrößerung. (B) Vergleich der Draufsicht und Seitenansicht der prozessierten Zellenposition Z Höhen bei (C) t = 0 und (D) t = 24 h. Die Verarbeitung für 24 h umfasst die Subtraktion von medianen, nicht migrierenden Z-Höhen. Maßstabsleisten = 500 μm. Abkürzungen: MAMA = Monolayer-based Ascending Migration Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig03v2.jpg"> 
Abbildung 3: MAMA-Zellmigrations-Output-Analyse. (A) Mediane Position Z und Standardabweichung der Zellhöhen in jedem Replikat (n = 6) zu den Zeitpunkten t = 0 (27,0 μm ± 1,4 μm) und t = 24 h (46,6 μm ± 10,8 μm). (B) Migration der Zellen nach 24 h normalisiert auf 0 h und berichtet als Faltenänderung (1,8 ± 0,4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig03largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Zellkultur und Bildgebung des Parallel Layer Outward Spheroid Migration Assay (PLOSMA). (A) Schematische Darstellung der Schritte der Gerüstschichtierung. (B) Projektionen der maximalen Intensität des Sphäroids, die bei 0 und 24 h aufgenommen wurden. Die Bilder wurden mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie im FITC-Kanal (488 nm) bei 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Maßstabsleisten = 200 μm. Abkürzungen: PLOSMA = Parallel Layer Outward Spheroid Migration Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Erstellen eines neuen Ursprungsreferenzrahmens. (A) Die Schaltfläche für den neuen Ursprungsreferenzrahmen, die mit einem roten Feld umrandet ist. (B) Der neue Ursprung wird so eingestellt, dass er sich in allen drei Dimensionen in der Mitte des Sphäroids befindet. (C) Bei den angezeigten Ausgabemetriken handelt es sich um die Abstände der Zellenoberflächen vom Ursprungsbezugssystem, das beschreibt, wie weit sich die Zellen vom Mittelpunkt entfernt haben. Maßstabsleiste = 120 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig06.jpg"> 
Abbildung 6: 3D-Renderings des eingebetteten Sphäroids nach 24 Stunden. (A) Verarbeitetes Sphäroid im 3D-Raum. (B) Das Zentrum desselben Sphäroids wurde mit der Herkunftsbezugsrahmenfunktion in IMARIS bestimmt, und die Zellausbreitung wird durch die Entfernung vom Ursprung farbcodiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig07.jpg"> 
Abbildung 7: Beispielausgaben für PLOSMA. (A) Beispiel für PLOSMA-Ergebnisse, die die zurückgelegte Strecke in μm anzeigen. Die durchschnittlich zurückgelegte Strecke betrug 240,8 μm ± 36,87 μm. (B) Faltenänderung der Z-Höhe (tf/t 0) des Sphäroideskeimens. Die durchschnittliche Fold-Veränderung betrug 3,82 ± 1,495. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Quantifizierung der dreidimensionalen Zellmigration innerhalb und in granuläre Hydrogel-Biomaterialien

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...

quantifying-three-dimensional-cell-migration-within-into-granular

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Die Zellmigration ist ein biologisches Phänomen, das in einer Vielzahl von physiologischen beteiligt ist, wie der Wundheilung und Immunreaktionen und pathophysiologischen Prozessen, wie Krebs. Die 3D-Kollagen-Matrix Migrationstest ist ein vielseitiges Werkzeug, um die Migrationseigenschaften der verschiedenen Zelltypen innerhalb in einer 3D-physiologischen Umgebung wie zu analysieren.

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Die mechanischen Eigenschaften und die Mikrostruktur der extrazellulären Matrix stark beeinflussen 3D Migration von Zellen. In vitro-Verfahren, um die Raumzeit-Zellmigrationsverhalten in biophysikalisch variable Umgebungen sowohl Bevölkerung und einzelnen Zellebenen zu studieren, wird beschrieben.

Concentric Gel-System, um die biophysikalische Rolle der Matrix Mikromilieu auf 3D-Zellmigration Studieren

Zellmigration ist ein wichtiger Teil der menschlichen Entwicklung und des Lebens. Um die Mechanismen zu verstehen, die die Zellmigration verändern können, stellen wir ein planares Gradientendiffusionssystem zur Untersuchung der Chemotaxis in einer 3D-Kollagenmatrix vor, das es ermöglicht, die Einschränkungen moderner Diffusionskammern bestehender Assays zu überwinden.

Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Pro und anti migratory Faktoren auf Zellwanderung innerhalb einer dreidimensionalen Fibrin-Matrix bewerten.

Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen

Hier präsentieren wir ein ex-vivo gemischtes monolayer Kultursystem zur Erforschung der Migration menschlicher Gliomzellen (hGC) in Echtzeit. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, Wechselwirkungen zwischen hGCs und myelinierten und nicht myelinierten Axonen innerhalb einer abgeteilten Kammer zu beobachten.

Echtzeit-Überwachung der Migration menschlicher Gliom-Zell auf Dorsalwurzel Ganglion Axon-Oligodendrozyten-Ko-Kulturen

Mechanische Kräfte sind wichtig für die Steuerung der Zellmigration. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von elastischen Hydrogelen, die mit einer Glasmikropipette und einem Mikromanipulator verformt werden können, um Zellen mit einem lokalen Steifigkeitsgradienten zu stimulieren, um Veränderungen in der Zellstruktur und Migration hervorzurufen.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Kollektive Zellmigration in Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung wird oft von den Gradienten von Wachstumsfaktoren oder Signalmolekülen geleitet. Hier wird ein experimentelles System beschrieben, das Traktionsmikroskopie mit einem mikrofluidischen System kombiniert und demonstriert, wie die Mechanik der kollektiven Migration unter biochemischen Gradienten quantifiziert werden kann.

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Erfahren Sie quantitative 3D-Zellmigration in granulären Hydrogel-Biomaterialien mittels konfokaler Mikroskopie und Imaris-Software. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellbewegung in Geweberegeneration und Wundheilung.

Quantifizierung der dreidimensionalen Zellmigration innerhalb und in granuläre Hydrogel-Biomaterialien

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