Analyse der Aktivität humaner T-Zellen in einer allogenen Co-Kultur von vorbehandelten Tumorzellen

Tumorzellen verändern den Immunphänotyp während der Therapie, was sich auf das Ergebnis auswirken kann, und daher ist es das Ziel unserer Forschung, die Interaktion zwischen T-Zellen und Tumorzellen zu untersuchen, um ein besseres Verständnis dieser Wechselwirkungen zu schaffen.

Verbesserung der Strahlenempfindlichkeit, insbesondere bei strahlenresistenten Tumoren durch Kombination von Strahlentherapie mit Kinase-Inhibitoren. Die gezielte Reaktion auf DNA-Schäden ist derzeit ein zentraler Bestandteil der jüngsten Entwicklungen. Im Bereich der Strahlenbiologie sind derzeit dreidimensionale Zellkulturmodelle und Co-Kulturmodelle etabliert, um die Vergleichbarkeit zwischen in vitro und in vivo Daten zu erhöhen.

[Erzähler] Zu Beginn erhalten Sie HSC4-Tumorzellen in einem geeigneten Volumen von D10-Medium. Säen Sie mindestens drei Vertiefungen pro Bedingung aus, die jeweils 15.000 Zellen in 200 Mikrolitern Medium in 96-Well-Platten enthalten. Bestimmen Sie eine Platte für die Probenbehandlung, einschließlich Vertiefungen nur für Tumorzellen und nur für die T-Zell-Kontrolle sowie Vertiefungen für die Zellzählung für jede Behandlung am Tag der Co-Kultur. Behandeln Sie die Tumorzellen am zweiten Tag mit Kinase-Inhibitoren in den erforderlichen Konzentrationen. Bestrahlen Sie eine Platte nach drei bis vier Stunden und dieselbe nach 24 Stunden Inkubation mit fünf Grau für die hypofraktionierte Bestrahlung. Für mononukleäre Zellen des peripheren Blutes oder die PBMC-Isolierung übertragen Sie das von einem gesunden Spender entnommene EDTA-Mischblut in zwei 50-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen. Füllen Sie beide Zentrifugationsröhrchen bis zu 50 Milliliter mit PBS und 2% FBS. Bereiten Sie anschließend sechs Zentrifugationsröhrchen mit Kunststoffeinlagen für die PBMC-Trennung vor. Füllen Sie jeweils 15 Milliliter Kältegradientenmedium. Überlagern Sie das Dichtegradientenmedium vorsichtig mit 12 bis 15 Millilitern des verdünnten Blutes. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1.200 g 10 Minuten lang ohne Verzögerung. Nach der Zentrifugation wird der Überstand in vier neue 50-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen überführt. Entsorgen Sie die gebrauchten Röhren. Füllen Sie die neuen Zentrifugationsröhrchen bis zu 50 Milliliter mit PBS und 2% FBS und zentrifugieren Sie bei 120 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter PBS mit 2 % FBS und kombinieren Sie die beiden Pellets zu einem Falkenröhrchen. Füllen Sie das Zentrifugationsröhrchen wieder auf 50 Milliliter mit PBS mit 2 % FBS. Zentrifugieren Sie die PBMCs bei 300 g für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 80 Mikrolitern MACS plus Puffer pro 10 bis zur Potenz von sieben Zellen. Fügen Sie 20 Mikroliter CD8-Mikrokügelchen pro 10 hoch sieben Zellen hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren. 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation mit zwei Millilitern MACS plus Puffer pro 10 Zellen hoch sieben Zellen. Das Röhrchen wird bei 300 g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Überstands werden die Zellen in 1000 Mikrolitern MACS plus Puffer resuspendiert. Setzen Sie zwei MS-Säulen in den Magneten ein und platzieren Sie zwei 15-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen darunter. Äquilibrieren Sie die Säulen mit 500 Mikrolitern MACS plus Puffer. Laden Sie dann ein gleiches Volumen der Zellsuspension in die vorbereitete MS-Säule. Spülen Sie die Säulen dreimal mit 500 Mikrolitern MACS plus Puffer. Markieren Sie die fertig entnommenen Zellen als Durchfluss- oder CD8-negativ und kombinieren Sie sie in einem einzigen Zentrifugationsröhrchen. Nehmen Sie dann ein neues 15-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen mit CD8-positiven T-Zellen. Beide Säulen mit magnetisch markierten CD8-positiven T-Zellen werden mit jeweils 1000 Mikrolitern MACS plus Puffer gespült. Bevor Sie die T-Zellen färben, zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300 g. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1000 Mikrolitern PBS. Die Suspension wird erneut fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Zellpellet in 2000 Mikrolitern einer mikromolaren CFSE-Färbelösung. 20 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zentrifugieren Sie anschließend die gefärbten Zellen fünf Minuten lang bei 300 g. Nachdem Sie die Zellen mit PBS gewaschen haben, resuspendieren Sie sie in T-Zell-Medium. Die Zellen in die CD3- und CD28-beschichtete Sechs-Well-Platte aussäen und inkubieren. Ernten Sie am vierten Tag die T-Zellen und resuspendieren Sie sie in ihrem jeweiligen Medium. Geben Sie die gewünschte Anzahl von T-Zellen in einem Verhältnis von eins zu eins in die Tumorzellvertiefungen, nachdem Sie die vorgesehenen Vertiefungen gezählt haben. Nehmen Sie am siebten Tag die Kulturplatte aus dem Inkubator, um die T-Zellproliferation zu quantifizieren. Nach dem Waschen der Zellen färben Sie sie mit den gewünschten Antikörpern und führen eine Durchflusszytometrie durch, um die T-Zellen zu beurteilen. Schließen Sie die Dublett-Population basierend auf der Vorwärts-Streufläche im Vergleich zur Vorwärts-Streuungshöhe aus, um Singuletts zu erhalten. Plotten Sie die Einzelzellen, um T-Zellen basierend auf der Vorwärts-Streufläche im Vergleich zur Seitenstreufläche zu identifizieren. Plotten Sie die CD3-Expression gegen den seitlichen Streubereich, um T-Zellen zu unterscheiden. Identifizieren Sie außerdem CD8-positive T-Zellen, nachdem Sie das CD8-Signal gegen den seitlichen Streubereich aufgetragen haben. Alle T-Zellen sollten CD3 und CD8 exprimieren. Plotten Sie das CFSE-Signal aller CD8-positiven T-Zellen als Histogramm. Nachdem Sie die Gating-Schritte abgeschlossen haben, wählen Sie CD8-positive T-Zellen als Eingabe aus und analysieren Sie deren CD25- oder HLA-DR-Isotypexpression, indem Sie die jeweilige Oberflächenmarker-Fluoreszenz gegen den seitlichen Streubereich auftragen. Der Anteil proliferativer T-Zellen stieg an, wenn sie mit bestrahlten HSC4-Tumorzellen co-kultiviert wurden. Die Strahlentherapie oder RT und RT plus Hemmung von ATR erhöhten die T-Zellproliferation signifikant im Vergleich zu RT plus ATM-Hemmung. Unter den hochproliferativen T-Zellen war die Hemmung von RT plus ATR am wirksamsten bei der Stimulierung der Proliferation. Die Expression von CD25 auf T-Zellen war nach Co-Kultur mit RT-behandelten HSC4-Tumorzellen herunterreguliert. Die Vorbehandlung von Tumorzellen mit einem ATM-Inhibitor allein verringerte die CD25-Expression im Vergleich zu einem ATR-Inhibitor signifikant. Die Kombination von RT und ATM-Inhibitor führte zu einer erhöhten CD25-Expression im Vergleich zu RT plus ATR-Inhibitor. Die HLA-DR-Expression auf T-Zellen wurde im Allgemeinen durch RT hochreguliert. Die Kokultur mit HSC4-Zellen, die mit RT plus ATR-Inhibitor vorbehandelt waren, erhöhte die HLA-DR-Expression im Vergleich zu RT allein oder RT plus ATM-Inhibitor weiter.