Name: Analyse der Aktivität humaner T-Zellen in einer allogenen Co-Kultur von vorbehandelten Tumorzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Analyse humaner T-Zell-Aktivität in allogener Co-Kultur mit vorbehandelten Tumorzellen. Diese Methode untersucht Immunantworten durch Durchflusszytometrie und kombinierte Radiotherapie.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>15 mL Cellstar Röhrchen</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cellstar Röhrchen</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6 Well Zellkulturplatte steril, mit Deckel</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Zellkulturplatte steril, F-Boden, mit Deckel</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>AZD0156</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S8375</td><td></td></tr><tr><td>Berzosertib (VE-822)</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S7102</td><td></td></tr><tr><td>CASYcups</td><td>OMNI Life Science GmbH & Co KG&nbsp;</td><td></td><td></td>5651794</tr><tr><td>CASYton</td><td>OMNI Life Science GmbH & Co KG&nbsp;</td><td></td><td></td>5651808</tr><tr><td>CD25a, PE-Dazzle594, Maus IgG1</td><td>Biolegend</td><td>356126</td><td></td></tr><tr><td>CD28-UNLB</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>IM1376</td><td></td></tr><tr><td>CD3a, Krome Orange, Maus IgG1</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>B00068</td><td></td></tr><tr><td>CD3e Monoklonaler Antikörper</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>MA1-10176</td><td></td></tr><tr><td>CD4, APC, Maus Anti-Human-Maus IgG1</td><td>BD Pharmingen</td><td>555349</td><td></td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CD8a, PerCP-Cy5.5, Maus IgG1</td><td>Biolegend</td><td>300924</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Tiefroter Farbstoff</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&akut; s Modifizierter Adler&akut; s Medium)</td><td>PAN-Biotech GmbH</td><td>P04-02500</td><td></td></tr><tr><td>DxFlex Durchflusszytometer (mit Auto Loader)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>C44326, C02846</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumsalz-Dihydrat</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior&nbsp;</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>S0615-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior&nbsp;</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)&nbsp;</td><td>S0615-100ML</td><td>Zur Herstellung von hitzeinaktiviertem FBS. 30 min bei 56 °C erhitzen; C mit Mischen zur Inaktivierung von Komplementproteinen.</td></tr><tr><td>Graph Pad Prism (Versionsnummer 9)</td><td>GraphPad</td> <td>Software-HLA-DR</td><td></td></tr><tr><td>, DP, DQ Antikörper, Anti-Mensch, APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-123-550</td><td></td></tr><tr><td>Kaluza (Versionsnummer 2.1)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysin-monohydrochlorid</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>L5626-100G</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stammlösung</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MS-Säulen</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer-verbesserte Zählkammer</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG&nbsp;</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>D8537-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>1514-122</td><td></td></tr><tr><td>ROTISep 1077</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>R1790</td><td></td></tr><tr><td>SepMate 50mL Röhrchen</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>T6146-25G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td>15400054</tr></tbody></table>

analyse der aktivität humaner t-zellen in einer allogenen co-kultur von vorbehandelten tumorzellen

Analysis of Human T Cell Activity in an Allogeneic Co-Culture Setting of Pre-Treated Tumor Cells

HSC4-Tumorzellen, die von einem HNSCC abgeleitet wurden, wurden über Nacht ausgesät und inkubiert. Nach 24 h wurden die Zellen mit einem Kinase-Inhibitor behandelt. Nach 3 Stunden wurden die ersten beiden Dosen von 5 Gy pro Fraktion verabreicht. Nach 24 Stunden wurde die zweite Dosis verabreicht und die Zellen wurden erneut über Nacht inkubiert. Parallel dazu wurden 48 h vor Beginn der Co-Kultur T-Zellen aus dem Blut eines gesunden Spenders isoliert. Zunächst wurden PBMCs mit Hilfe von Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen und einem sterilen Trennmedium isoliert. PBMCs wurden mit einer Zellzählkammer gezählt, und CD8+ T-Zellen wurden mit dem CD8+ T-Zell-Isolationskit isoliert. Isolierte CD8+ T-Zellen wurden dann mit CFSE (1 μM) gefärbt und anschließend gezählt. T-Zellen wurden in CD3/CD28-vorbeschichtete Well-Platten mit einer Dichte von 1,5 x 106 Zellen/3 ml ausgesät. Nach 48 Stunden Stimulation wurden die T-Zellen geerntet, gezählt und in einer Dichte von 10.000 Zellen/10 μl resuspendiert. Zusätzlich wurden repräsentative Wells der ausgesäten Tumorzellen geerntet und gezählt, und das Medium wurde gegen alle verbleibenden Wells ausgetauscht. T-Zellen wurden den Tumorzellen im Verhältnis 1:1 zugesetzt. Die Co-Kultur wurde nach 96 h geerntet, der Überstand bei -20 °C gelagert und die Zellen wurden gefärbt und mittels Durchflusszytometrie gemessen (Abbildung 1).
T-Zellen wurden durch Größenausschluss und CD3/CD8-Positivität identifiziert. Das CFSE-Signal von CD3+/CD8+ positiven Zellen zeigte die Verteilung von nicht-proliferativen T-Zellen (hohes CFSE-Signal) und ausgeprägten Subpopulationen von proliferierenden T-Zellen (Verlust der CFSE-Signalintensität). Der Anteil proliferierender T-Zellen wurde exemplarisch für die HSC4 HNSCC-Zelllinie gemessen (Abbildung 4A). Alle T-Zellen, die mindestens eine Teilung zeigten, wurden als "proliferativ" definiert. T-Zellen, die mehr als 3 Teilungen zeigten, wurden als "hochgradig proliferativ" definiert (Abbildung 4B). Für die HPV-negative Zelllinie HSC4 wurde ein leichter Anstieg der Proliferationsrate festgestellt, wenn T-Zellen mit bestrahlten Tumorzellen kokultiviert wurden. RT und RT plus Hemmung von ATR führten zu einer signifikant erhöhten konsekutiven T-Zell-Proliferation im Vergleich zu Co-Kulturen von RT plus ATM-Hemmung behandelten HSC4-Zellen mit T-Zellen. In Bezug auf die "hochproliferative" Fraktion der T-Zellen war die Vorbehandlung von HSC4-Zellen mit RT plus Hemmung von ATR am effektivsten bei der Stimulierung der T-Zellproliferation (Abbildung 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig04v2.jpg"> 
Abbildung 4: Proliferation von CFSE-gefärbten T-Zellen zur Analyse von HSC4-behandlungsabhängigen Veränderungen der T-Zellproliferation. (A) Anteil proliferierender T-Zellen nach 96 Stunden Co-Kultur mit vorbehandelten HPV-negativen HSC4-Tumorzellen. Die T-Zellproliferation war nach der Co-Kultur mit RT+ATMi-behandelten HSC4-Tumorzellen im Vergleich zu RT oder RT plus ATRi-Behandlung signifikant geringer. (B) Die RT von HSC4-Tumorzellen induzierte einen höheren Anteil an stark proliferierenden T-Zellen (mehr als drei Zellteilungen. Nach Co-Kultur von RT+ATRi vorbehandelten HSC4-Tumorzellen mit T-Zellen war der Anteil an hochproliferativen T-Zellen am höchsten. Die Balken zeigen Daten aus vier unabhängigen Experimenten mit den T-Zellen von vier unabhängigen, gesunden Spendern (n = 4; Mittelwert ± SD). (*p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001, ****p≤ 0,0001; statistische Signifikanz getestet durch Vergleich aller experimentellen Bedingungen unter Verwendung von zweiseitigem Mann-Whitney-U für nicht normalverteilte Daten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig04largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Der proliferationsbasierte CFSE-Verlust kann zur Quantifizierung der T-Zell-Proliferationsrate verwendet werden. Darüber hinaus werden mehrere Zelloberflächenmarker beschrieben, die mit der T-Zell-Aktivität assoziiert sind, wie z. B. CD25 und HLADR. Daher wurde die Analyse von CD25 und HLA-DR auf der Oberfläche aller CD3+ und CD8+ T-Zellen mittels Durchflusszytometrie durchgeführt (Abbildung 5). Die Expression kann quantifiziert werden, wennunterschiedliche CD25-hohe- oder HLA-DR-hohe Subpopulationen nachweisbar sind und durch Gating dieser hochpositiven Zellen unterschieden werden können (Abbildung 3B). Wenn keine eindeutigen Subpopulationen nachweisbar sind, kann die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der gesamten Population gemessen und zustandsbasierte Verschiebungen des MFI quantifiziert werden (Abbildung 3C).
Exemplarisch wurde die durch den MFI identifizierte Expression von CD25 und HLA-DR nach 96 h Co-Kultur mit vorbehandelten HSC4-Tumorzellen analysiert (Abbildung 5). Nach Co-Kultur von T-Zellen mit RT-behandelten HSC4-Tumorzellen war die Expression von CD25 auf den T-Zellen stark herunterreguliert. Bemerkenswert ist, dass die Vorbehandlung der Tumorzellen mit nur ATMi zu einer signifikant verringerten Expression von CD25 im Vergleich zur ATRi-Vorbehandlung führte. Obwohl die RT in der kombinierten Umgebung mit RT zu einer verminderten Expression von CD25 auf T-Zellen führte, führte die Kombination von RT mit ATMi zu einer erhöhten Expression von CD25 im Vergleich zu RT plus ATRi (Abbildung 5A). In Bezug auf die Expression von HLA-DR auf T-Zellen führte die RT im Allgemeinen zu einer Hochregulation von HLA-DR, aber auch hier wurde in Kombination mit ATMi oder ATRi ein anderes Verhalten beobachtet (Abbildung 5B). T-Zellen, die mit HSC4-Zellen kokultiviert wurden, die mit einer Kombination von RT+ATRi vorbehandelt wurden, erhöhten die Expression von HLA-DR im Vergleich zu RT allein oder RT+ATMi.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig05v2.jpg"> 
Abbildung 5: Expression der Aktivierungsmarker CD25 und HLA-DR auf der Oberfläche von T-Zellen nach 96 h Co-Kultur mit vorbehandelten HSC4-Tumorzellen. Die Expression von CD25 und HLA-DR wurde anhand der Verschiebung des MFI der gesamten T-Zell-Population analysiert. Die RT von HSC4 führte zu einer verminderten Expression von CD25 auf T-Zellen und einer erhöhten Expression von HLA-DR. Die Kombination von RT mit ATMi führte zu signifikant unterschiedlichen Expressionsmustern im Vergleich zu RT plus ATRi. Die Boxplots zeigen Daten aus vier unabhängigen Experimenten mit den T-Zellen von vier unabhängigen, gesunden Spendern (n = 4; Mittelwert ± SD). Die Daten wurden analysiert, indem alle experimentellen Bedingungen mit einem zweiseitigen Mann-Whitney-U-Test für nicht normalverteilte Daten verglichen wurden (*p≤ 0,050). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig05largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Diese Daten deuten exemplarisch darauf hin, dass die Behandlung von Tumorzellen, in diesem Fall von HSC4 HNSCC-Zellen, die Immunogenität der Tumorzellen beeinflusst. Dies kann durch die Co-Kultivierung der Tumorzellen mit prästimulierten T-Zellen überwacht werden, was zu einem vielfältigen Proliferationsverhalten und der Expression von Aktivierungsmarkern auf humanen T-Zellen führt, basierend auf dem angewandten Tumorzellbehandlungsregime.

Analyse der Aktivität humaner T-Zellen in einer allogenen Co-Kultur von vorbehandelten Tumorzellen

Cytotoxic T cells play a key role in the elimination of tumor cells and are, therefore, intensively studied in cancer immunology. The frequency and ...

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