Name: Plasmidstabilitätsanalyse mit Open-Source-Tröpfchen-Mikrofluidik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Lernen Sie eine offene Mikrofluidik-Methode zur Analyse der Plasmidstabilität in Bakterien mit Fluoreszenzmikroskopie. Diese Technik ermöglicht Hochdurchsatz-Analysen einzelner Zellen in Gel-Mikrotropfen.

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<ol><li>Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+plasmid+stability+under+non-selective+conditions+maintains+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Emergence of plasmid stability under non-selective conditions maintains antibiotic resistance.</a> Nat Commun. 10 (1), 2595(2019).</li>
<li>Rodríguez-Beltrán, J., DelaFuente, J., León-Sampedro, R., MacLean, R. C., Millán, ÁS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+horizontal+gene+transfer%3A+The+role+of+plasmids+in+bacterial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beyond horizontal gene transfer: The role of plasmids in bacterial evolution.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (6), 347(2021).</li>
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<li>Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmid+system+with+tunable+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A plasmid system with tunable copy number.</a> Nat Commun. 13 (1), 3908(2022).</li>
<li>Silva, F., Queiroz, J. A., Domingues, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+metabolic+stress+and+plasmid+stability+in+plasmid+DNA+production+by+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Evaluating metabolic stress and plasmid stability in plasmid DNA production by Escherichia coli.</a> Biotechnol Adv. 30 (3), 691-708 (2012).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+novel+pJRD215-derived+plasmids+using+chloramphenicol+acetyltransferase+%28cat%29+gene+as+a+selection+marker+for+Acidithiobacillus+caldus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Construction of novel pJRD215-derived plasmids using chloramphenicol acetyltransferase (cat) gene as a selection marker for Acidithiobacillus caldus.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0183307(2017).</li>
<li>Moragues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidics.</a> Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 32(2023).</li>
<li>Vitalis, C., Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+interactions+in+microfluidic+droplets+for+enhanced+biotechnology+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Leveraging interactions in microfluidic droplets for enhanced biotechnology screens.</a> Current Opinion in Biotechnology. 82, 102966(2023).</li>
<li>Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipette-tip+based+method+for+seeding+cells+to+droplet+microfluidic+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A pipette-tip based method for seeding cells to droplet microfluidic platforms.</a> J Vis Exp. (144), e57848(2019).</li>
<li>Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+hardware%3A+From+DIY+trend+to+global+transformation+in+access+to+laboratory+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">Open hardware: From DIY trend to global transformation in access to laboratory equipment.</a> PLOS Biol. 21 (1), e3001931(2023).</li>
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<li>Shin, J. H., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+and+do-it-yourself+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Open-source and do-it-yourself microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 347, 130624(2021).</li>
<li>Pryszlak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+gut+microbiome+strains+for+cultivation-free+genome+sequencing+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Enrichment of gut microbiome strains for cultivation-free genome sequencing using droplet microfluidics.</a> Cell Rep Methods. 2 (1), 100137(2021).</li>
<li>Pollak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+loop+assembly%3A+open%2C+efficient+and+cross-kingdom+DNA+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Universal loop assembly: open, efficient and cross-kingdom DNA fabrication.</a> Biology. 5 (1), (2020).</li>
<li>Volkmer, B., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-dependent+cell+volume+and+concentration+of+Escherichia+coli+to+facilitate+data+conversion+for+systems+biology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Condition-dependent cell volume and concentration of Escherichia coli to facilitate data conversion for systems biology modeling.</a> PLoS ONE. 6 (7), e23126(2011).</li>
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<li>Abate, A. R., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+multiple+emulsification+with+drop+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Faster multiple emulsification with drop splitting.</a> Lab Chip. 11 (11), 1911-1915 (2011).</li>
<li>Lau, B. T. C., Malkus, P., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+quantitative+methods+for+measuring+plasmid+loss+rates+reveal+unexpected+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">New quantitative methods for measuring plasmid loss rates reveal unexpected stability.</a> Plasmid. 70 (3), 353-361 (2013).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluor-1-octanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533-25G</td><td>Zum Aufbrechen von Emulsion</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>Für die Zellpermeabilisierung</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Winkler</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie-Stanze</td><td></td><td></td><td>0,75 mm und 1,8 mm</td></tr><tr><td>Blau LED-Transilluminator</td><td>IO Rodeo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kulturröhrchen</td><td></td><td></td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Exsikkator</td><td></td><td></td><td>mit Vakuumpumpe</td></tr><tr><td>Einwegbecher</td><td></td><td></td><td>Zum Mischen von PDMS</td></tr><tr><td>Einweggabel</td><td></td><td></td><td>Zum Mischen von PDMS</td></tr><tr><td>E. coli TOP10 Stamm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoPi Mikroskop</td><td>https://github.com/wenzel-lab/FluoPi</td><td></td><td>Grünes Fluoreszenz-Bildgebungssystem zur Analyse von Platten</td></tr><tr><td>Fluoriertes Öl</td><td>3M</td><td></td><td>Novec 7500</td></tr><tr><td>Glas-Diaheizung</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>Zur Regelung der Temperatur bei 40 & Grad; C des Mikrofluidik-Chips</td></tr><tr><td>Glas-Objektträger</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizplatten-Mechaniker</td><td></td><td>Zum Verdampfen Aquapel</td><td></td></tr><tr><td>Bildanalyse-Software</td><td>Fiji/ImageJ</td><td></td><td>2.14.0/1.54f</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Mundo Lab</td><td></td><td>MLAB Scientific / Für die Inkubation von Platten und Mikrogelen&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td></td><td>Zur Reinigung von Objektträgern</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td></td><td></td><td>100 μg/ml Konzentration</td></tr><tr><td>L-förmiger Spreader</td><td></td><td></td><td>Zum Verteilen von Bakterien auf Agarplatten</td></tr><tr><td>Master Mold</td><td></td><td></td><td>Chip-Design auf Silikon- oder Glaswafern</td></tr><tr><td>Mikroröhrchen</td><td></td><td></td><td>2 mL</td></tr><tr><td>NaCl-Lösung</td><td></td><td></td><td>Natrium Chlorid 0,9 % w/v</td></tr><tr><td>Open-Source-Hardware mit Stroboskop-verstärktem Mikroskopietisch</td><td>https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platform</td><td></td><td>Für die Hellfeldmikroskopie</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Citotest</td><td>2303-1090</td><td>90 x 15 mm</td></tr><tr><td>Pipettenspitzenheizung</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>Zur Regelung der Temperatur bei 40 °; C der Pipettenspitze</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Diener Electronic</td><td>117056</td><td>Zum Verkleben von PDMS mit einem Objektträger</td></tr><tr><td>Plasmid pCA_Odd1</td><td></td><td></td><td>kodiert sfGFP- und Kanamycin-Beständigkeit</td></tr><tr><td>Polytetrafluorethylen (PTFE)-Schlauch</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorgemischtes Luria Bertoni Medium</td><td>US Biological Life Science</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Idid (PI)</td><td></td><td></td><td>Zum Färben</td></tr><tr><td>Ein auf Raspberry Pi basierendes Druck- und Durchflussregelsystem</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller</td><td></td><td>Zur Steuerung von Druck und Durchflussraten</td></tr><tr><td>Silikonelastomer-Basis</td><td>Sylgard</td><td></td><td>PDMS-Kit - 184 Silikonelastomer-Kit</td></tr><tr><td>Silikonelastomer-Härter</td><td>Sylgard</td><td></td><td>PDMS-Kit - 184 Silikon-Elastomer-Kit</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td></td><td></td><td>Zur Messung</td></tr><tr><td>der Absorption SQUID-Mikroskop</td><td>https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform</td><td></td><td>Multi-Fluoreszenz-Bildgebungssystem zur Analyse gefärbter Zellen</td></tr><tr><td>Sterile Schleife</td><td></td><td></td><td>Zum Entnehmen einer Kolonie und zum Streifenplattieren</td></tr><tr><td>Tensidkugel</td><td>Fluidik</td><td></td><td>Pico-Surf</td></tr><tr><td>Spritzen</td><td>NIPRO</td><td></td><td>Mit Filtern und</td></tr><tr><td>Schläuchen Temperaturgesteuerter Schüttler</td><td>Mundo Lab</td><td></td><td>DLAB HCM100-Pro</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose mit extrem niedriger Geliertemperatur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td>Zur Erzeugung von Hydrogelkügelchen</td></tr><tr><td>Wasserabweisende Lösung (Fluoralkylsilan)</td><td>Aquapel</td><td></td><td>Zur Behandlung Mikrokanäle des PDMS-Geräts</td></tr></tbody></table>

plasmidstabilitätsanalyse mit open-source-tröpfchen-mikrofluidik

Plasmid Stability Analysis with Open-Source Droplet Microfluidics

Validierung der Zellverkapselung und Mikrokoloniebildung
Die Zellverkapselung kann visuell bestätigt werden, indem eine Hellfeldmikroskopie an den Gel-Mikrotröpfchen durchgeführt wird, bevor die Emulsion gebrochen und die Mikrogele gewaschen werden. Ein repräsentatives Ergebnis der Emulsion in diesem Schritt ist in Abbildung 4 dargestellt.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Ausschnitt aus einem Fluoreszenzmikroskopie-Overlay-Bild. Nach der Inkubation über Nacht wurden repräsentative Mikrokolonien von sfGFP-exprimierenden E. coli-Kolonien in Gel-Mikrotröpfchen gebildet. Zum Einsatz kam ein Mikroskopobjektiv mit 10-facher Vergrößerung und einem 0,30 NA. Maßstab: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergebnisse der Bildanalyse
Sobald Mikrogele gefärbt und das Hellfeld sowie die Fluoreszenzkanäle an mehreren Positionen aufgenommen wurden, können die Kolonien, die in den Originalbildern als negativ identifiziert wurden, sichtbar gemacht werden (siehe Abbildung 5A). Daten, die aus allen Bildern eines Experiments extrahiert wurden, können grafisch dargestellt werden, um das Fluoreszenzverhältnis verschiedener Kolonien zu zeigen, wobei diejenigen hervorgehoben werden, die die Plasmid-kodierte Fluoreszenz verloren haben (siehe Abbildung 5B). Die Ergebnisse zeigen, dass 100 Kolonien von insgesamt 2785 analysierten Mikrokolonien ihr Plasmid oder ihre Plasmidfunktionalität verloren haben, was 3,6% entspricht.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Quantifizierung negativer Mikrokolonien. (A) Ausschnitt aus einem Fluoreszenzmikroskopie-Overlay-Bild. Nach der Ölentfernung und -färbung zeigten repräsentative Kolonien in Mikrogelen, die sfGFP exprimieren, und zwei negative Kolonien die rote Fluoreszenz der DNA-Färbung (schwarz eingekreist). Maßstabsbalken: 100 μm. (B) Streudiagramm der Fluoreszenzwerte einzelner Mikrokolonien, extrahiert aus 16 Mehrkanal-Mikroskopiebildern. Kolonien ohne grüne Fluoreszenz wurden als negativ gezählt, wie in der Grafik rot dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Quantifizierung von Agarplatten
Bilder der dreifachen Platten sind in Abbildung 6 dargestellt, wobei die nicht fluoreszierenden Kolonien durch weiße Pfeile gekennzeichnet sind. Die erste Platte (Abbildung 6A) zeigte insgesamt 213 Kolonien, von denen 1 nicht fluoreszierend war. Die zweite Platte (Abbildung 6B) hatte insgesamt 49 Kolonien, ohne nicht-fluoreszierende Kolonien. Die dritte Platte (Abbildung 6C) zeigte insgesamt 252 Kolonien, von denen 6 nicht fluoreszierend waren. Diese Ergebnisse entsprechen einer mittleren Kolonieplasmidverlustrate von 2,3 % mit einer großen Standardabweichung von 3,2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig6.jpg"> 
Abbildung 6: Identifizierung negativer Kolonien auf Platten. (A–C) Fluoreszierende und nicht-fluoreszierende E. coli-Kolonien auf LB-Agarplatten (Durchmesser: 90 mm, Höhe: 15 mm). Das Inokulum, das aus E. coli mit sfGFP aus einem Stamm von -80 °C gewonnen wurde, wurde an Tag 1 gestreift, an Tag 2 mit einem Antibiotikum kultiviert und von Tag 3 bis 6 täglich 1:100 verdünnt, um einen Plasmidverlust zu ermöglichen. Die Kolonien wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und in einer FluoPi-Kammer abgebildet. Nicht fluoreszierende Kolonien wurden mit GIMP verbessert und mit weißen Pfeilen gekennzeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Plasmidstabilitätsanalyse mit Open-Source-Tröpfchen-Mikrofluidik

Plasmids play a vital role in synthetic biology by enabling the introduction and expression of foreign genes in various organisms, thereby facilitating ...

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Research

Forschung

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Plasmidstabilitätsanalyse mit Open-Source-Tröpfchen-Mikrofluidik

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