Plasmidstabilitätsanalyse mit Open-Source-Tröpfchen-Mikrofluidik
December 27th, 2024
Es wird ein zugänglicher, quelloffener mikrofluidischer Workflow für die parallelisierte Analyse der Plasmidretention in Bakterien vorgestellt. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie zur Quantifizierung des Plasmidvorhandenseins in einzelligen Mikrokolonien in Gel-Mikrotröpfchen bietet diese Methode eine präzise, zugängliche und skalierbare Alternative zur herkömmlichen Plattenzählung.
Wir entwickeln mikrophile Hochdurchsatz-IC-Methoden, um die Diversität von Zellpopulationen und Zell-Zell-Interaktionen zu untersuchen. In diesem Zusammenhang ermöglichen uns Gel-Mikrotröpfchen die Durchführung nützlicher Protokollschritte, wie z. B. die Lysefärbung von DNA-Manipulationen und die Mikroskopie in stark gelähmten Zellen in gefangenen Zellen. Tröpfchenmikrophile Arbeitsabläufe sind bekannt für ihren extrem hohen Durchsatz und ihre Vielseitigkeit, aber die Akzeptanz wird oft durch den Bedarf an High-End-Instrumenten und spezialisiertem Fachwissen eingeschränkt.
Unser Protokoll verbessert traditionelle Techniken durch Einzelzellanalyse mit hohem Durchsatz und Fluoreszenzfärbung und einen zugänglichen Open-Source-Mikroskopie-Workflow. Es verkapselt Zellen in Gel-Mikrotröpfchen mittels Mikrofluidik, um Minizellen und Mikrokolonien gleichzeitig zu analysieren. Während es bei Bulk- und Plattenkulturen an Spezifität und Auflösung mangelt, liefert diese Methode präzise und repräsentative Statistiken verschiedener Phänomene.
Unsere Protokolle kombinieren Tröpfchenmikrofluidik, Fluoreszenzmikroskopie und Open-Source-Hardware in einer markierungsbasierten Methode. Dieser Ansatz macht die Einzelzellanalyse flexibler und erschwinglicher und ermöglicht es der wissenschaftlichen Gemeinschaft, komplexe wissenschaftliche Fragestellungen zu mikrobiellen Gemeinschaften zu beantworten. Erhitzen Sie zunächst Agarose mit extrem niedriger Geliertemperatur in einer Konzentration von 2 % bis 90 Grad Celsius in Luria Bertani oder LB-Brühe.
Schütteln Sie die Mischung 10 Minuten lang in einem temperaturgesteuerten Shaker und reduzieren Sie dann die Temperatur des Thermoshakers auf 39 Grad Celsius, um die Agaroselösung abzukühlen. Legen Sie das Escherichia coli Suspensionsröhrchen für vier Minuten in den Thermoschüttler, um es auf 39 Grad Celsius zu erwärmen. Mischen Sie die Bakteriensuspension und die Agaroselösung im Verhältnis eins zu eins, um eine Agarosekonzentration von 1% mit einer Zellsuspension von 3,1 mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter zu erreichen.
Bereiten Sie die Negativkontrolllösung für die Kontaminationsüberwachung mit LB und Agarosesuspension im Eins-zu-Eins-Verhältnis vor. Beziehen Sie die vollständige Open-Source-Durchflussplattform, einschließlich Gasdrucktreibern und Durchflusssensoren. Fügen Sie einen Glasobjektträger und Pipettenspitzenheizungen in das Setup ein, um die Temperatur der Agarosezellprobe beim Eintritt in den Chip zu steuern.
Positionieren Sie als Nächstes den mikrofluidischen Chip auf dem stroboskopverstärkten Mikroskopietisch und stellen Sie sicher, dass der Übergang zur Tröpfchenerzeugung sichtbar ist. Stellen Sie die Pipettenspitzenheizung und die Glasschiebeheizung über die Steuerungssoftwareschnittstelle auf 40 Grad Celsius ein. Laden Sie mit einer Spritze mit Schlauch und einem PDMS-Stopfen 1 %Agarose-Zellsuspensionsmischung in eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze.
Setzen Sie die Spitze in die Spitzenheizung ein und platzieren Sie sie auf dem Einlass der wässrigen Phase im Mikrofluidik-Chip. Tauschen Sie die PDMS-Dichtung der Spitze gegen die Dichtung aus, die an den Schlauch des Durchflusskontrollsystems angeschlossen ist. Führen Sie dann den Ölschlauch in den zweiten Einlass und das Ende des Auslassschlauchs in einen Abflussschlauch ein.
Stellen Sie dann den Druck auf der Benutzeroberfläche auf 80 Millibar für die Duldungs- und Ölphase ein und starten Sie die Infusion der Zellsuspension und des Öls. Die Ölphase ist auf 320 Millibar und die Duldungsphase auf 180 Millibar einzustellen. Warten Sie eine Minute für die Stabilisierung der Tröpfchenbildung.
Sobald sich die Tröpfchenerzeugung stabilisiert hat, übertragen Sie den Auslassschlauch vom Abflussrohr in das Auffangrohr. Sammeln Sie weiter Tröpfchen auf dem Eis, bis das Probenreservoir leer ist. Legen Sie die Röhrchen nach dem Sammeln eine Stunde lang bei vier Grad Celsius, damit die Agarose in den Tröpfchen gelieren kann.
Inkubieren Sie die Gel-Mikrotröpfchen mit Bakterien und die negativen Kontrolltröpfchen bei 37 Grad Celsius für vier Stunden oder über Nacht für das Koloniewachstum. Verwenden Sie nach der Inkubation eine Drei-Milliliter-Spritze mit einer 21-Gauge-Nadel, um vorsichtig so viel Öl wie möglich von der Basis der Gel-Mikrotröpfchenemulsion zu entfernen. Übertragen Sie 50 Mikroliter der Gel-Mikrotröpfchen in ein neues Mikroröhrchen und lagern Sie es bei vier Grad Celsius für die weitere Tröpfchenanalyse, fügen Sie eine Eins-zu-Eins-Mischung aus fluoriertem Öl und PFO in einem Volumen hinzu, das der verbleibenden Emulsion entspricht.
Als nächstes fügen Sie etwa 200 Mikroliter 0,9%igen Natriumchloridpuffer auf die Emulsion hinzu. Wirbeln Sie die Mischung und schleudern Sie sie kurz in einer Zentrifuge mit fester Drehzahl herunter. Entfernen Sie vorsichtig die Ölphase von der Unterseite der Flüssigkeitsschnittstelle und entsorgen Sie 100 Mikroliter Natriumchloridlösung von der Oberseite.
Übertragen Sie zwei Mikroliter Gel-Mikrotröpfchen in einen Objektträger der Bildgebungskammer und fügen Sie fünf Mikroliter fluoriertes Öl hinzu, um eine Monoschicht aus Tröpfchen für eine optimale Bildgebung zu bilden. Aktivieren Sie am Mikroskop die weiße LED-Matrixbeleuchtung von oben für die Hellfeld-Bildgebung. Montieren Sie die vorbereitete Rutsche.
Fokussieren Sie sich auf die Probe, um eine Monoschicht aus Tröpfchen zu lokalisieren und ein Hellfeldbild aufzunehmen. Passen Sie als Nächstes das Filterrad so an, dass es mit dem grünen Wellenlängenfilter übereinstimmt. Schalten Sie zur Anregung auf die 470-Nanometer-LED um und nehmen Sie ein Fluoreszenzbild der Kolonien auf, ohne die Probe zu bewegen.
Übertragen Sie zwei Mikroliter der mit Propidiumiodid gefärbten Mikrogele in einen Chip der Bildgebungskammer und fügen Sie fünf Mikroliter 0,9%ige Natriumchloridlösung hinzu, um eine Monoschicht aus Mikrogelen zu bilden. Versiegeln Sie den Ein- und Auslass des Chips, um eine Verdunstung während der Bildgebung zu verhindern. Passen Sie den Filter für das rote Wellenlängenintervall für die Propidiumiodid-Bildgebung an und nehmen Sie die Hellfeld- und Fluoreszenzbilder auf.
Die Zellverkapselung in Gel-Mikrotröpfchen wurde durch Hellfeldmikroskopie bestätigt, die einheitliche Tröpfchen mit unterschiedlichen verkapselten Zellen zeigt. Kolonien, die Plasmid-kodierte Fluoreszenz verloren hatten, wurden mittels Fluoreszenzverhältnisanalyse identifiziert. Von 2.785 analysierten Kolonien verloren 100 Völker Fluoreszenz, was auf eine Plasmidverlustrate von 3,6 % hinweist
Übersicht
Diese Studie präsentiert einen Open-Source-Mikrofluidik-Workflow zur Analyse der Plasmid-Retention in Bakterien mittels Fluoreszenzmikroskopie. Die Methode ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Plasmid-Präsenz in einzelnen Mikrokolonien, die in Gel-Mikrotröpfchen eingekapselt sind, und bietet eine skalierbare Alternative zur traditionellen Plattenzählung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrofluidik
- Zellbiologie
- Fluoreszenzmikroskopie
Hintergrund
- Mikrofluidische Techniken ermöglichen eine Hochdurchsatz-Analyse von Zellpopulationen.
- Traditionelle Methoden mangelt es oft an Spezifität und Auflösung.
- Gel-Mikrotröpfchen bieten eine vielseitige Plattform für Einzelzellanalysen.
- Open-Source-Ansätze können den Zugang zu fortschrittlichen Methoden demokratisieren.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Hochdurchsatz-Methode zum Studium der Plasmid-Retention in Bakterien.
- Verbesserung der Zugänglichkeit und Erschwinglichkeit von Einzelzellanalysetechniken.
- Bereitstellung einer skalierbaren Alternative zu traditionellen Kulturmethoden.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Agarose-Gel-Mikrotröpfchen mit Bakterienzellen.
- Verwendung von Mikrofluidik für die Tröpfchenerzeugung und -manipulation.
- Fluoreszenzmikroskopie für die Bildgebung und Quantifizierung der Plasmid-Retention.
- Analyse der Koloniefluoreszenz zur Bestimmung der Plasmid-Verlustrate.
Hauptergebnisse
- Bestätigung der Einkapselung von Zellen in Gel-Mikrotröpfchen mittels Brightfield-Mikroskopie.
- Identifizierung einer Plasmid-Verlustrate von 3,6% unter den analysierten Kolonien.
- Nachweis der Effektivität des Open-Source-Workflows für Hochdurchsatz-Analysen.
- Bereitstellung präziser Statistiken zur Plasmid-Retention in verschiedenen Bakterienpopulationen.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode verbessert das Studium mikrobieller Gemeinschaften.
- Sie bietet einen flexiblen und erschwinglichen Ansatz für Einzelzellanalysen.
- Dieser Workflow kann von Forschern mit unterschiedlichen Erfahrungsstufen übernommen werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Plasmid stability is a critical parameter in synthetic biology and microbial engineering, directly impacting the reliability of engineered strains in biopharma R&D. High-throughput, quantitative analysis of plasmid retention without antibiotic selection enables robust target validation and de-risks early discovery workflows. Open-source droplet microfluidics democratizes access to advanced single-cell analytics, supporting scalable portfolio decisions and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of plasmid stability in engineered microbial populations.
- Supports functional validation of genetic constructs under selection-free conditions.
- Provides high-resolution data for mechanistic de-risking of synthetic circuits.
- Facilitates predictive confidence in strain performance for downstream applications.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microbial systems for high-throughput screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for assay standardization.
- Enables parallel analysis of thousands of microcolonies, increasing statistical power.
- Supports scalable and reusable assay platforms for diverse genetic constructs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial system stability with translational biomarker strategies when relevant.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by quantifying genetic retention.
- Reduces risk of late-stage failure due to plasmid instability in engineered strains.
- Provides mechanistic insights for predictive de-risking in translational workflows.
Pipeline & Workflow Integration
This open-source microfluidic workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling robust single-cell analytics from early target validation through assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying plasmid retention at single-cell resolution.
- Screening: Delivers reproducible, high-throughput assay outputs for reliable compound or construct evaluation.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based measurements to compare genetic stability across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by ensuring engineered strain fidelity.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, open-source platform adaptable to various genetic and microbial systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in engineered strain validation.
- Operational Value: Standardizes and scales single-cell analysis with accessible instrumentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust genetic stability data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial engineering projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence microscopy, and microbial genetics.
- Needs open-source hardware for precise flow and temperature control.
- Demands cross-team standardization for reproducible data integration.
- Adaptable to various microbial models and genetic constructs with minimal modification.
- Limited by the need for fluorescence-based readouts and compatible imaging infrastructure.
