Name: Eine effiziente Ein-Personen-Technik für die Milchprobenahme von Labormäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Lernen Sie eine effiziente Ein-Personen-Technik zur Milchprobenahme bei Labormäusen mittels Vakuumgerät. Diese Methode ermöglicht die Sammlung von 0,1–0,5 mL Milch in unter 10 Minuten und minimiert Probenverluste für die Laktationsforschung.

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Alle Tierpflege- und Versuchsverfahren folgten den Richtlinien des Bundes und erhielten die Genehmigung des Rutgers University Institutional Animal Care and Use Committee. Weibliche Mäuse (C57BL/6 Hintergrund) wurden im Alter von 8 Wochen verpaart. Sie wurden mit einem Standard-Brutfutter ad libitum gefüttert und unter einem regulären Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 Uhr gehalten. Der Tag der Lieferung wurde als Tag nach der Lieferung 1 (PD1) gezählt. An PD2 (Frühlaktation) und PD10 (Spitzenlaktation) wurde die Milch wie unten beschrieben beprobt.
1. Montage einer Melkvorrichtung 
<ol>
	<li>Befestigen Sie ein Ende des Schlauchs aus Polyvinylchlorid (PVC) mit einem Innendurchmesser (ID) von 5/32 Zoll an der Vakuumpumpe und befestigen Sie die Befestigung mit Klebeband (in Abbildung 1A mit a gekennzeichnet). HINWEIS: Die Vakuumpumpe kann durch eine geeignete Pumpe oder ein im Labor verfügbares Zentralvakuum (manchmal auch als "Hausvakuum" bezeichnet) ersetzt werden.</li>
	<li>Befestigen Sie das andere Ende des 5/32'' ID PVC-Schlauchs über einen geraden Stecker mit Widerhaken an den 1/8'' ID PVC-Schlauch.</li>
	<li>Befestigen Sie das andere Ende des PVC-Schlauchs mit 1/8-Zoll-ID über einen Stecker an einer 18G-Injektionsnadel (in Abbildung 1A mit b gekennzeichnet).</li>
	<li>Schneiden Sie das Ende einer P200 Pipettenspitze ~0,2 cm ab, um eine größere Öffnung zu schaffen. Führen Sie die Pipettenspitze P200 so durch die Öffnung des Septumverschlusses, dass die Spitze nach oben zeigt (Abbildung 1B). HINWEIS: Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen den Tieren.</li>
	<li>Befestigen Sie den Septumstopfen an einem sterilen Auffangröhrchen. Machen Sie mit der 18 G Injektionsnadel eine Punktion durch den Septumstopfen.</li>
	<li>Überprüfen Sie den Saugdruck, indem Sie die Vakuumpumpe einschalten und einen Finger (mit einem Laborhandschuh bedeckt) gegen die Öffnung der Pipettenspitze legen. HINWEIS: Sie sollten einen sanften Sog spüren, wenn er richtig montiert ist. Das Sammelröhrchen, die 18-G-Injektionsnadel und die P200-Pipettenspitzen sollten steril sein.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67669/67669fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Die Melkvorrichtung. (A) Melkvorrichtung mit einer Vakuumpumpe, die über einen PVC-Schlauch an einer 18-G-Injektionsnadel befestigt ist. Die Nadel geht durch einen Septumstopfen, der an einem Auffangröhrchen der Mikrozentrifuge befestigt ist. Eine umgekehrte Pipettenspitze P-200, mit der Milch aus einem Sauger entnommen wird, wird durch eine Öffnung des Septumverschlusses eingeführt. (B) Schnittdiagramm der Melkvorrichtung. (C) Ein Muttertier, das nach der beschriebenen Methode gemolken wird. (D) Ein repräsentatives Aliquot (0,3 ml) Milch, die von einem Muttertier während der höchsten Laktation entnommen wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67669/67669fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
2. Trennung des Muttertiers von den Jungtieren
<ol>
	<li>Trennen Sie am Tag des Melkens die Hündin von ihren Jungen, damit sich die Milch in den Drüsen ansammeln kann.</li>
	<li>Halten Sie die Welpen in einem Nest warm.</li>
	<li>Warten Sie eine Trennung von 2 Stunden, wenn die Milch während der frühen Laktation gesammelt wird (z. B. PD2 in dieser Studie).</li>
	<li>Warten Sie 30–45 Minuten Trennung, wenn die Milch während der Spitzenlaktation gesammelt wird (z. B. PD10 in dieser Studie).</li>
</ol>
3. Anästhesie des Damms
<ol>
	<li>Wenn das Muttertier bereit zum Melken ist, verabreichen Sie eine Injektion von Ketamin/Xylazin-Lösung (intraperitoneal, i.p.) in eine Seite der Bauchhöhle zwischen dem 4. und 5. Zitzenpaar. HINWEIS: Die Menge der zu verabreichenden Anästhesielösung wird anhand des Gewichts des Muttertiers berechnet (80–100 mg/kg Ketamin, 5–12 mg/kg Xylazin, gemäß dem IACUC-Protokoll der Rutgers University). Diese Dosis sediert eine Maus für 45–60 Minuten und bietet ausreichend Zeit für die Milchaufnahme.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie einen Fuß fest, aber ohne ihn zu verletzen, drücken, um die Wahrnehmung von Empfindung und Schmerz durch das Tier zu testen. Eine adäquate Anästhesie ist durch keinerlei Bewegung angezeigt.</li>
	<li>Tragen Sie veterinärmedizinische Augensalbe auf die Augen des Muttertiers auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.</li>
</ol>
4. Sammeln von Milch
<ol>
	<li>Legen Sie die betäubte Mutterdame auf den Rücken auf eine feste Arbeitsfläche. Wischen Sie ihren Brustbereich vorsichtig mit einem sterilen Alkoholvorbereitungstuch ab, um den Bereich vor dem Melken zu reinigen.</li>
	<li>Verabreichen Sie 1–2 Einheiten Oxytocin (i.p.) zwischen dem 4. und 5. Saugerpaar auf der Seite der Bauchhöhle, die keine Injektion erhalten hat. HINWEIS: Oxytocin ist ein kleines Molekül, das schnell absorbiert werden kann und eine kurze Halbwertszeit hat 14,15. Das Melken sollte innerhalb einer Minute nach der Injektion beginnen.</li>
	<li>Halte den Damm, indem du ihren Halsbereich vorsichtig mit der nicht dominanten Hand abstreichelst.</li>
	<li>Drücken Sie die Milch manuell aus einem Sauger ab, indem Sie das Brustgewebe von der Basis bis zur Spitze des Saugers zusammendrücken, bis eine Milchperle sichtbar ist.</li>
	<li>Schalten Sie das Staubsaugergerät ein, indem Sie den Netzschalter einschalten.</li>
	<li>Beginnen Sie mit dem Melken, indem Sie die umgekehrte Pipettenspitze P200 vorsichtig auf einen Sauger legen. Verwenden Sie eine sanfte Zugbewegung, um die Milch herauszuziehen (Abbildung 1C).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.4–4.6 an allen Zitzen, bis eine ausreichende Milchmenge aufgefangen ist. HINWEIS: Während des Melkens kann versehentlich Milch in die 18-G-Injektionsnadel oder den PVC-Schlauch der Vakuumleitung gezogen werden. Dies kann leicht behoben werden, indem die Nadel oder der PVC-Schlauch gewechselt wird, bevor das nächste Tier gemolken wird.</li>
</ol>
5. Bergung des Muttertiers nach der Milchgewinnung
<ol>
	<li>Bringen Sie die betäubte Hündin mit ihren Welpen in den Käfig zurück und halten Sie sie warm. Beobachte das Tier, bis es wieder zu Bewusstsein kommt. HINWEIS: Die Hündin kann sich weigern, erneut zu säugen, wenn sie alleine in einem separaten Käfig aufwachen darf, bevor sie zu ihren Welpen zurückkehrt. Dies ist häufiger der Fall, wenn die Milchsammlung während der Frühlaktation (PD2) stattfindet.</li>
	<li>Lassen Sie die Muttertiere sich von ihren Welpen entfernen, um sich vollständig zu erholen, wenn sie aufwacht. Dies ist ein normales Verhalten. HINWEIS: Wir beobachten, dass Muttertiere regelmäßig zu ihren Jungen zurückkehren und nach einigen Stunden wieder vollständig säugen.</li>
</ol>
6. Milch-Analyse
<ol>
	<li>Verwenden Sie ein handelsübliches Laktose-Assay-Kit (siehe Materialtabelle), um die Milchlaktose zu messen. Verdünnen Sie die Milch 75x mit sterilem Wasser und führen Sie den Assay gemäß dem Kit-Protokoll durch.</li>
	<li>Messen Sie das Milchfett mit der Creamatokrit-Methode, die in anderen Veröffentlichungen gezeigt wurde16,17.</li>
	<li>Schätzen Sie das Milchprotein, indem der Bradford-Protein-Assay18 mit Rinderserumalbumin als Standard19 durchgeführt wird. Vor der Durchführung des Assays wird die Milch bei 4.000 × g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert. Extrahieren Sie das Infranatant durch Pipettieren und verdünnen Sie es vor dem Assay auf 1:10 mit sterilem Wasser.</li>
	<li>Durchführung einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE); Trennen Sie 10 μg Protein auf einem vorgefertigten 4%–12%igen Bis-Tris-Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers. Übertragen Sie die Proteine auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen und färben Sie sie mit Coomassie Blue R-250.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Optimierte Ein-Personen-Methode zur Milchentnahme in Laktationsstudien an Mäusen

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</ol>

<table><tbody><tr><td>1 mL kryogene Fläschchen</td><td>Corning</td><td>430658</td><td>Bevorzugt für die frühe Milchentnahme</td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>Exel</td><td>26048</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Mikrozentrifugen-Auffangröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-344</td><td>Bevorzugt für die Peak- und Spätmilchentnahme</td></tr><tr><td>18 G Injektionsnadel</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>27 G Injektionsnadel</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Alkoholvorbereitungstuch</td><td>Honeywell</td><td>154818</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Farbstoffreagenzkonzentrat</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon -P PVDF Membran</td><td>Immobilon</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Dechra</td><td>1000001250</td><td>Gekauft über das Tierarztamt&nbsp;</td></tr><tr><td>Labor-Beschriftungsband</td><td>VWR International</td><td>89097</td><td></td></tr><tr><td>Laktose-Assay-Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK487</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Widerhaken-Polypropylen-Fittings</td><td>Cole-Parmer Instrument Company</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Diät</td><td>Labordiät</td><td>5015</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Mini-Protein-Gele, 4&ndash; 12%</td><td>Invitrogen</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Optixcare Augenschmiermittel</td><td>Aventix</td><td>N/A</td><td>über Tierarztpraxis gekauft&nbsp;</td></tr><tr><td>Oxytocin</td><td>Bimeda</td><td>1OXY015</td><td>gekauft über die Tierarztpraxis&nbsp;</td></tr><tr><td>P200 Pipettenspitzen</td><td>Gilson</td><td>F1733001 PVC-Schlauch</td><td></td></tr><tr><td>: 1/8'' ID</td><td>VWR International</td><td>MFLX07407-75&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PVC-Schlauch: 5/32'' ID</td><td>VWR International</td><td>MFLX07407-77</td><td></td></tr><tr><td>Septumstopfen</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-3022-91</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-103635</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Akorn Animal Health</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Gekauft über das Tierarztamt&nbsp;</td></tr></tbody></table>

eine effiziente ein-personen-technik für die milchprobenahme von labormäusen

An Efficient Single-Person Technique for Milk Sampling from Laboratory Mice

Mit dieser Technik haben wir während einer 21-tägigen Laktation erfolgreich ausreichend Milch zu verschiedenen Zeitpunkten probiert. Wir betrachten den Tag der Entbindung als Tag 1 nach der Entbindung (PD1), und in dieser Arbeit haben wir Milchproben auf PD2 (Frühlaktation) und PD10 (Spitzenlaktation) genommen, jeweils n = 4. Wir erhielten bequem 0,1–0,5 ml Milch von jedem Muttertier (Abbildung 1D). Um diese Methode zu validieren, haben wir die Brutto-Makronährstoffzusammensetzung dieser Milchproben gemessen und die Unterschiede zwischen der Milch, die in der Frühlaktation und der Hochlaktation entnommen wurde, mit dem Student-t-Test verglichen.
Wir fanden heraus, dass die Laktosekonzentration in der Milch durchschnittlich 12,3 ± 0,6 g/l auf PD2 und 12,0 ± 0,9 g/l auf PD10 betrug (Tabelle 1). Der Milchfettanteil betrug 26,0 ± 1,0 % bzw. 33,4 ± 2,5 % bei PD2 bzw. PD10. Die Fettkonzentration betrug 174,4 ± 7,1 g/L auf PD2 und signifikant höher auf 224,4 ± 17,1 g/L auf PD10 (Tabelle 1). Die durchschnittlichen Proteingehalte betrugen 70,1 ± 5,2 g/l auf PD2 und 75,1 ± 2,6 g/l auf PD10 (Tabelle 1). Obwohl sich der Gesamtgehalt an Milchprotein zwischen PD2 und PD10 nicht unterschied, unterschied sich die relative Häufigkeit des einzelnen Milchproteins. Insbesondere waren αS1-Kasein und saures Molkenprotein in PD10-Milch höher als in PD2-Milch (p &lt; 0,05), während β-Kasein (p &lt; 0,05) eine höhere Häufigkeit in PD2 als in PD10 aufwies (Abbildung 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67669/67669fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Milchproteinanalyse. (A) Coomassie Blue-gefärbte PAGE-Analyse von Milch, die an PD2 und PD10 gesammelt wurde. Die Proteinidentifizierung erfolgte wie zuvor beschrieben14. (B) Einzelne Proteinsignale wurden in ImageJ analysiert und auf das gefärbte Gesamtprotein normiert. Die Ergebnisse wurden als Durchschnitt mit Standardfehlerbalken und einzelnen Datenpunkten als Punkte ausgedrückt. Die durchschnittliche Häufigkeit jedes Proteins auf PD2 und PD10 wurde mit einem zweiseitigen Student's t-Test verglichen. *p &lt; 0,05, n = 4. Abkürzungen: PAGE = Polyacrylamid-Gelelektrophorese; PDn = Tag nach der Lieferung n. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67669/67669fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
			<td>Durchschnitt</td>
			<td>SEM</td>
			<td>p-Wert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Milchzucker (g/L)</td>
			<td>PD2</td>
			<td>12.3</td>
			<td>0.6</td>
			<td rowspan="2">0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD10</td>
			<td>12.0</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Fett (g/L)</td>
			<td>PD2</td>
			<td>174.4</td>
			<td>7.1</td>
			<td rowspan="2">0.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD10</td>
			<td>224.4</td>
			<td>17.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Protein (g/L)</td>
			<td>PD2</td>
			<td>70.1</td>
			<td>5.2</td>
			<td rowspan="2">0.42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD10</td>
			<td>75.1</td>
			<td>2.6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Makronährstoffzusammensetzung von Milch, die bei PD2 und PD10 gesammelt wurde. Die Ergebnisse, ausgedrückt als durchschnittlicher und Standardfehler des Mittelwerts (SEM), wurden analysiert, um die Auswirkungen des Laktationstages auf die Milchzusammensetzung mit einem zweiseitigen Student's t-Test zu untersuchen, n = 4.

Eine effiziente Ein-Personen-Technik für die Milchprobenahme von Labormäusen

Rodent models have been widely used in biology since the early 20th century to study basic physiology and biochemical mechanisms. In lactation and ...

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Forschung

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Eine effiziente Ein-Personen-Technik für die Milchprobenahme von Labormäusen

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