In vitro Thrombosetest für Herzunterstützungssysteme

Unser Ziel ist es, ein praktisches und zugängliches Tischprotokoll zu entwickeln, um potenzielle thrombogene Hotspots in ventrikulären Unterstützungssystemen zu identifizieren und die kritische Lücke zwischen frühem Prototyping und Tierversuchen zu schließen. Tierversuche sind nach wie vor die primäre Methode zur Beurteilung von Thrombosen bei ventrikulären Unterstützungssystemen. Obwohl die numerische Strömungsmechanik zu einem unschätzbaren Werkzeug für die Designverifizierung geworden ist, kann sie die In-vitro- und In-vivo-Validierung noch nicht ersetzen.

Die komplexe Natur des Vorhandenseins von Blutgerinnungsorganen und zahlreiche Störfaktoren, die es schwierig machen, zwischen tatsächlicher Thrombogenität des Geräts und experimentellen Artefakten zu unterscheiden. In-vitro-Methoden zur Beurteilung von Thrombosen bei VADs werden nach wie vor zu wenig genutzt, und es gibt bisher keine standardisierte Methode. Durch das Angebot eines umfassenden Protokolls und eines Videoleitfadens hoffen wir, eine breitere Einführung von Tischmethoden zu erleichtern.

Diese Methode adressiert sowohl eine technische als auch eine ethische Herausforderung in der Entwicklung von Medizinprodukten, indem sie die Abhängigkeit von Tierversuchen verringert und gleichzeitig die Fähigkeit verbessert, Thromboserisiken frühzeitig im Entwicklungsprozess zu erkennen. Füllen Sie zunächst die Testschleife mit 150 Millilitern Blut. Beseitigen Sie alle in der Schleife eingeschlossenen Luft.

Wenn Sie eine Blutpumpe mit axialer Strömung verwenden, drehen Sie sie in eine vertikale Position, um Luft durch Auftrieb abzulassen. Wenn Sie eine Kreiselpumpe verwenden, drehen Sie sie auf den Kopf und drehen Sie sie, um sicherzustellen, dass keine Luft in den sekundären Strömungswegen eingeschlossen wird. Klopfen Sie vorsichtig auf die Oberflächen der Schläuche und des Behälters und drücken Sie alle Luftblasen zusammen, um sie zu entfernen.

Überprüfen Sie horizontale Abschnitte von Schläuchen und die Verbindungsstellen zwischen Schläuchen und Anschlüssen genau, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Drücken Sie den intravenösen Beutel zusammen, um den Flüssigkeitsstand in die Nähe des schmalen oberen Teils zu bringen. Klemmen Sie dann den Beutel mit einem Blutstiller über die Flüssigkeitsleitung, um die Flüssigkeits-Luft-Grenzfläche zu beseitigen, und schließen Sie den Absperrhahn der Entlüftung.

Schließen Sie anschließend den Absperrhahn am Ende der Druckleitungen. Entfernen Sie den Manometerschlauch und bringen Sie eine Drei-Milliliter-Spritze an. Öffnen Sie den Absperrhahn und ziehen Sie ein bis zwei Milliliter Flüssigkeit in die Verlängerungslinie, etwa vier Zentimeter.

Schließen Sie den Absperrhahn, nehmen Sie die Spritze ab und schließen Sie den Manometerschlauch wieder an. Öffnen Sie den Absperrhahn, um die Druckmessung zu aktivieren. Entlüften Sie abschließend die Probenahmeöffnung mit einer Spritze.

Schneiden oder reißen Sie anschließend ein fusselfreies Tuch in drei gleich große Fragmente. Drehen Sie die Ecke eines Fragments zu einer Spitze und führen Sie sie in die Injektionsöffnung ein, um das restliche Blut aufzunehmen. Verdrehe das zweite Fragment.

Befeuchten Sie es mit Kochsalzlösung und führen Sie die feuchte Spitze in den Port ein, um das restliche Blut zu entfernen. Verwenden Sie das dritte Fragment, um die im Port befindliche Kochsalzlösung zu absorbieren. Starten Sie nun das ventrikuläre Unterstützungssystem (VAD) mit niedriger Geschwindigkeit und betätigen Sie es etwa fünf Sekunden lang, um eingeschlossene Luftblasen in der Pumpe zu entfernen.

Stoppen Sie die Pumpe. Wenn Blasen im Beutel auftreten, wiederholen Sie das Entlüften. Starten Sie die Pumpe mit niedriger Geschwindigkeit neu, um das Blut in der Schleife zirkulieren zu lassen.

Übertragen Sie einen Milliliter Heparin-Natrium, zwei Milliliter der vorbereiteten Calciumchloridlösung und 1,5 Milliliter EDTA in separate Röhrchen. Um Heparin zum Blut in der Schleife hinzuzufügen, aspirieren Sie 75 Einheiten Heparin in eine Mikropipette und geben Sie es in eine Drei-Milliliter-Spritze ab, indem Sie gleichzeitig die Pipette abgeben und den Spritzenkolben ziehen, ohne zu verschütten. Verwenden Sie die Queröffnung des Dreiwegehahns, um mit einer Spritze Substanzen in die Schlaufe zu verabreichen.

Drehen Sie die männliche Ködersperre am Absperrhahn so, dass die Injektionsöffnung nach oben zeigt, um Luftblasen oben einzufangen. Befestigen Sie nun die Spritze über den Köderverschluss an der Injektionsöffnung, wobei die Öffnung nach oben zeigt und die Spritze senkrecht nach unten zeigt. Ziehen Sie den Spritzenkolben, um ihn mit Blut zu füllen, und mischen Sie das Heparin mit dem Blut, während Sie Luft in die Spritze einsaugen.

Lassen Sie die Luftblasen an die Oberseite der Spritze aufsteigen. Injizieren Sie dann die Mischung in den Kreislauf und stellen Sie sicher, dass keine Luft eindringt. Transportieren Sie das Blut vier- bis fünfmal in die Spritze hinein und wieder heraus, um sicherzustellen, dass das heparinisierte Blut nicht in dem Raum im Port bleibt.

Um die aktivierte Gerinnungszeit (ACT) von Blut in der Schleife zu titrieren, fügen Sie zunächst 750 Mikroliter einmolare Calciumchloridlösung zu 150 Millilitern Blut in der Schleife hinzu. Um eine Blutgerinnung zu verhindern, injizieren Sie die Flüssigkeit schnell, nachdem Sie die Restluft entfernt haben. Alternativ können Sie das Calciumchlorid in der Spritze mit einem Milliliter trisgepufferter Kochsalzlösung verdünnen, um eine vorzeitige Gerinnung zu reduzieren.

Nachdem Sie das injizierte Calciumchlorid mindestens zwei Minuten lang zirkulieren ließen, setzen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze auf die Probenahmeöffnung. Entnehmen und entsorgen Sie 0,5 Milliliter Abfallblut, um stagnierendes Blut aus dem Port zu entfernen. Setzen Sie anschließend eine neue Ein-Milliliter-Spritze auf die Probenahmeöffnung und entnehmen Sie 0,5 Milliliter Blut für die Analyse.

Messen Sie die aktivierte Gerinnungszeit mit einem Point-of-Care-Vollblutgerinnungssystem. Reinigen Sie den Probenahmeanschluss mit fusselfreien Tüchern, wie zuvor gezeigt. Beziehen Sie sich auf die Titrationswerte, um die Zielcalciumchloridkonzentration zu ermitteln.

Erhöhen Sie die Kalziumkonzentration schrittweise, um eine aktivierte Gerinnungszeit von 300 Sekunden zu erreichen. Beginnen Sie mit dem In-vitro-Thrombosetest, sobald der ACT von 300 Sekunden in der Schleife erreicht ist. Stellen Sie die Pumpe auf die gewünschte Fördermenge und den gewünschten Druck ein, indem Sie die Rotordrehzahl ändern und den Widerstand mit der Hoffman-Klemme regulieren.

Messen Sie den ACT alle 15 Minuten, indem Sie eine Blutprobe aus der Schlaufe entnehmen und einen Tropfen Blut in das ACT-Gerät geben, wie zuvor gezeigt. Wenn der ACT unter 200 Sekunden fällt, injizieren Sie weitere 25 Einheiten Heparin-Natrium in die Schleife. Nach einer Stunde injizieren Sie 1,5 Milliliter 0,5-molares EDTA in die Schleife, um die weitere Gerinnung zu hemmen.

Lassen Sie das EDTA zwei Minuten lang zirkulieren und mischen und stoppen Sie dann die Pumpe. Klemmen Sie mit Hilfe von Hämostaten die Schläuche, die mit dem Einlass und Auslass der Pumpe verbunden sind, und positionieren Sie die Klemmen drei bis vier Zentimeter von den Einlass- und Auslasswiderhaken entfernt. Trennen Sie vorsichtig den Schlauch, um die Pumpe zu lösen.

Lassen Sie dann das Blut aus der Pumpe und dem Fließkreislauf in einen Behälter ab. Pipettieren Sie abschließend Kochsalzlösung durch den Einlass und Auslass der Pumpe, um das restliche Blut zu waschen. Die Thrombozytenablagerung wurde in den Pumpenprototypen konsistent entlang der Wurzeln der Schaufeln beobachtet.

Durch das Elektropolieren der Titanbauteile wurde die Thrombusbildung an diesen Stellen beseitigt. Der Prototyp hatte auch eine unvollkommene Kooptation in der vorderen und hinteren Verbindung der Gehäusekomponenten, was zu einem Spalt führte, in den Blut einsickerte und koagulierte. Durch Läppen und Polieren wurde die Passung der Bauteile verbessert und die Thrombusbildung reduziert.

Verfahrensfehler und unvollständiges De-Airing der Schleife können zu Artefakten führen. In diesem Fall löste ein experimenteller Fehler während der Calciumchlorid-Injektion eine lokale Gerinnung aus, und der resultierende Thrombus gelangte in die Magnetschwebebahn-Kreiselpumpe und versperrte den Strömungsweg. Kugelförmige, locker anhaftende Gerinnsel, die auf Oberflächen beobachtet werden, sind oft das Ergebnis von Luftblasen, die in Gerinnseln eingeschlossen sind.

Fremdkörper und Ablagerungen, die in der Schleife zirkulierten, wurden ebenfalls in Thromben eingekapselt und an den Pumpenoberflächen haftet. Ringthrombi an den Verbindungsstellen der Schlauchstecker waren während des Tests ein Hinweis auf eine optimale ACT-Reichweite.