Effiziente retrovirale Transduktion und kompetitives Homing zur Untersuchung der GPCR-vermittelten T-Zell-Lokalisierung in verschiedenen Gewebemikroumgebungen

Unsere Forschung untersucht, wie GPCRs den Transport und die Positionierung von Immunzellen in verschiedenen Gewebemikroumgebungen beeinflussen. Unter Verwendung dieses Protokolls und anderer komplementärer Protokolle hat unser Labor eine organspezifische Chemolockstoffachse im nicht-intestinalen Schleimhautgewebe identifiziert. Jetzt haben wir herausgefunden, wie Lymphozyten, die Heimat des Magens, der Lunge, der Luftröhre und des GU-Trakts sind. Ich stelle eine effiziente und verbesserte Methode vor, um zu testen, wie einzelne GPCRs die Bewegung von T-Zellen in vivo beeinflussen. Wir haben eine zuverlässige Methode entwickelt, um diese Rezeptoren in T-Zellen einzuführen, die nun einen direkten Vergleich in kompetitiven Homing-Assays ermöglichen. Jetzt, da wir wissen, wie GPCRs T-Zellen in vivo steuern, können Forscher die Rezeptorexpression besser mit der Immunfunktion in Verbindung bringen. Dies würde sowohl Forschern in der Grundlagenimmunologie als auch in der therapeutischen Forschung helfen. Mit diesem Ansatz können wir nun fragen, wie weniger bekannte oder uncharakterisierte GPCRs daran beteiligt sind, T-Zellen zu bestimmten Geweben zu leiten. Wir können lernen, wie die GPCR-Signalgebung fein abgestimmt werden könnte, um Krebs oder Autoimmunität zu behandeln. Wir können den T-Zellen helfen, zur richtigen Zeit an den richtigen Ort zu gelangen, um therapeutische Ansätze zu ermöglichen.

[Erzähler] Beschichten Sie am ersten Tag 10 Zentimeter große Gewebekulturplatten mit fünf Millilitern Poly-D-Lysin-Lösung, die in sterilem Wasser hergestellt wurde. Inkubieren Sie die Platten 45 Minuten lang bei Raumtemperatur und waschen Sie die Platten dann zweimal mit sterilem PBS ohne Kalzium und Magnesium, um sicherzustellen, dass keine Rückstände zurückbleiben. Als nächstes lösen Sie Plat-E-Zellen mit zwei Millilitern 0,05 % Trypsin und 0,5 Millimolar EDTA bei 37 Grad Celsius für drei Minuten. Um die Lebensfähigkeit der Zellen mit dem Trypanblau-Ausschlussassay sicherzustellen, mischen Sie ein gleiches Volumen der Zellsuspension mit Trypanblaulösung. Anschließend säen Sie 3 Millionen lebende Zellen in einer 10 Zentimeter großen Petrischale in Gewebekultur mit antibiotikafreiem Plat-E-Medium aus. Ersetzen Sie am zweiten Tag das Medium auf Plat-E-Zellkulturen durch 6,5 Milliliter Medium mit reduziertem Serum. Bereiten Sie die Transfektionsmischung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Mischen Sie für jede Platte 45 Mikroliter Lipofectamine 2000 mit 210 Mikrolitern reduziertem Serummedium in einem Röhrchen und 15 Mikrogramm DNA mit 235 Mikrolitern reduziertem Serummedium in einem anderen Röhrchen. Kombinieren Sie den Inhalt der Röhrchen durch drei- bis viermaliges Pipettieren und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Komplexbildung zu erleichtern. Nun die Mischung tropfenweise auf die Platten geben und 16 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Beschichten Sie anschließend 24-Well-Platten für die T-Zell-Aktivierung mit Anti-Maus-CD28 und CD3 in 375 Mikrolitern PBS pro Well. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei vier Grad Celsius oder drei bis vier Stunden in einem auf vier Grad Celsius eingestellten Inkubator. Verwenden Sie am dritten Tag einen Spritzenkolben, um die isolierte Milz der Mäuse vorsichtig auf einem 100-Mikrometer-Nylonnetz-Zellsieb zu zerdrücken, das in einer Sechs-Well-Platte mit RPMI-Medium platziert ist. Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb aus Nylonnetz in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 450 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Waschen Sie dann die Zellen mit PBS ohne Kalzium und Magnesium. Führen Sie anschließend eine magnetische Negativauswahl mit dem T-Zell-CD4-Isolationskit der Maus gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Zählen Sie die isolierte T-Zelle mit einem Zellzähler. Plattieren Sie die T-Zellen in den beschichteten T-Zell-Aktivierungswells mit einer Dichte von einem bis 1,5 Millionen Zellen pro Vertiefung in einem Milliliter RPMI 10 Medium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator für 24 bis 48 Stunden. Sammeln Sie am vierten Tag etwa 12 Milliliter Virusüberstand von den 10-Zentimeter-Platten in ein konisches Röhrchen. Ersetzen Sie das Medium in den Plat-E-Kulturplatten durch 10 Milliliter antibiotikafreies Plat-E-Medium, um mehr Virusüberstand für eine zweite Transduktion am nächsten Tag zu erzeugen. Um den gesammelten Virusüberstand zu filtrieren, führen Sie ihn durch einen 0,45-Mikrometer-Spritzenfilter. Dem gefilterten Überstand werden acht Mikrogramm Polybren pro Milliliter und eine Verdünnung von 1 bis 100 HEPES-Puffer zugesetzt. Drehen Sie die 24-Well-T-Cell-Platte sieben Minuten lang bei 950 g. Sammeln Sie dann den Überstand vorsichtig und bewahren Sie ihn auf, ohne die T-Zellen zu entfernen. Um eine Desinfektion durchzuführen, geben Sie einen Milliliter Virusüberstand in jede Vertiefung. Verschließe die Teller mit Frischhaltefolie und schleudere die Teller bei 1.150g für vier Stunden bei 32 Grad Celsius. Ersetzen Sie nach der Desinfektion das Medium in jeder Vertiefung vorsichtig durch den zuvor gespeicherten T-Zell-Überstand. Sammeln Sie am sechsten Tag T-Zellen von der Platte in ein konisches Röhrchen und zentrifugieren Sie. Waschen Sie das Pellet mit PBS, das Kalzium und Magnesium enthält. Übertragen Sie die Zellen auf eine neue Kulturplatte, die 130 Einheiten pro Milliliter Maus-Interleukin-2 und 10 Nanogramm pro Milliliter Maus-Interleukin-7 enthält. Inkubieren Sie die Zellen mindestens zwei Tage lang oder bis sie den gewünschten Expansionsgrad erreichen, basierend auf der Anzahl der für die Injektion benötigten Zellen. Am achten Tag zentrifugieren Sie bei 450 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren. Geben Sie fünf Milliliter Histopaque-1077 in eine 15-Milliliter-Tube. Resuspendieren Sie das T-Zell-Pellet in fünf Millilitern PBS, das Kalzium und Magnesium enthält. Schichten Sie die Zellsuspension vorsichtig auf fünf Milliliter Histopaque-1077 im Zentrifugenröhrchen. Die Probe wird bei 400 bis 500 g 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert, wobei darauf zu achten ist, dass die Zentrifugenunterbrechung oder -beschleunigung auf 0 eingestellt ist. Beobachten Sie nach der Zentrifugation die Bildung unterschiedlicher Zellschichten. Entnehmen Sie die Grenzschicht mit den gewünschten Zellen vorsichtig mit einer Pipette und vermeiden Sie eine Kontamination mit anderen Schichten. GPR25-transduzierte T-Zellen zeigten eine erhöhte Migration zu hCXCL17 und mCXCL17 im Vergleich zu Stuffer-transduzierten Kontrollen, was die funktionelle Rezeptorexpression validierte. GPR25-transduzierte Zellen, die bevorzugt in nicht-intestinalen Schleimhautgeweben wie dem Urogenitaltrakt, dem Magen und der Luftröhre lokalisiert waren, wobei eine signifikante Anreicherung nach sieben Wochen, aber nicht eine Woche nach der Injektion beobachtet wurde. Kurzzeit-Homing-Assays zeigten, dass GPR25 T-Zellen transduzierte, die bevorzugt an Cxcl17-reiche Organe wie Luftröhre, Magen, Zunge, Gallenblase und Uterusschleimhaut angesiedelt waren, während es bei Mäusen mit Cxcl17-Mangel nicht zu einer Akkumulation kam. GPR25 transduzierte Zellen, die überwiegend in den Bronchien lokalisiert waren, während Kontrollzellen häufiger in der Nähe von Venen zu finden waren.