Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen

Unsere Forschungsgruppe verwendet Polyvinylalkohol, PVA und Poly-Epsilon-Caprolacton, PCL, nanofaserige Membranen, um ein 3D-Kokultursystem zu entwickeln. Ziel ist es, zu beantworten, wie die Membranen Epithel- und Fibroblastenzellen unterstützen, Gewebeumgebungen nachahmen und die Untersuchung von Mustersignalen und zellulären Interaktionen erleichtern. Wir werden zeigen, dass poröse elektrogesponnene nanofaserige Membranen es Epithelzellen ermöglichen, Epithelgewebe zu bilden, wodurch mehrere Schichten und Fibroblasten in jeder zusätzlichen Matrix wachsen können.

Die Methoden zeigen, wie ein erweitertes 3D-System wachsendem Gewebe im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kulturen bessere Umgebungen bieten kann. Wir bieten ein Kokultursystem mit differenzierten Epithelzellen an. Die Organisation mit Hilfe von Stammzellen erfordert ein komplexes Differenzierungsverfahren, aber unser Modell hat Vorteile in Bezug auf Einfachheit und Zeitersparnis bei der Entwicklung eines 3D-Kokultursystems.

Wir konzentrieren uns darauf, die Einschränkungen von nanofaserigen Gerüsten zu überwinden, indem wir nanofaserige Membranen mit Überschicht-Hydrogelen in den Kokulturen kombinieren. Geben Sie zunächst 0,02 Gramm Polyacrylsäure und ein Gramm PVA in eine saubere Glasflasche, die einen Magnetstab enthält. Geben Sie 7,8 Milliliter destilliertes Wasser in die Flasche und stellen Sie die Flasche dann auf einen Tellerrührer.

Sobald die Flasche auf Raumtemperatur abgekühlt ist, fügen Sie 0,2 Milliliter Glutaraldehyd hinzu und stellen Sie sie wieder für 30 Minuten bei Raumtemperatur bei 500 U/min auf den Tellerrührer. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze zum Elektrospinnen. Trennen Sie die Kolben von den Kolben und reinigen Sie kleine Plastikreste in den Läufen und den Spitzen der Kolben.

Verwenden Sie anschließend Nadeln, um den Flüssigkeitsfluss zu blockieren, und gießen Sie die PVA-Lösung in jeden Spritzenzylinder. Setze die Kolben in die Zylinder ein und entferne die Nadeln. Nachdem Sie eine neue 27-Gauge-Metallnadel zusammengebaut haben, setzen Sie sie in die Elektrospinnmaschine ein.

Wickeln Sie den Sammler fest mit Alufolie ein. Sobald die Injektorblende in ihre ursprüngliche Position zurückkehrt, stellen Sie die Elektrospinnmaschine auf ein Einspritzvolumen von zwei Millilitern, eine Einspritzrate von sechs Mikrolitern pro Minute, eine Walzendrehzahl von 100 U/min und einen Abstand von 14 Zentimetern zwischen der Spitze und dem Kollektor ein. Überprüfen Sie den Flüssigkeitsfluss für jede Pumpe und lassen Sie dann die Elektrospinnmaschine mit einem elektrischen Potential von ca. 12 Kilovolt laufen.

Nachdem der Elektrospinnvorgang abgeschlossen ist, lösen Sie die Folie mit der Fasermatte vom Kollektor. Lagern Sie die Nanofasermatte in einem Trockenmittel unter Vakuum. Geben Sie 1,5 Gramm PCL und 8,5 Milliliter Chloroform in eine saubere Glasflasche.

Stellen Sie die Flasche auf einen Tellerrührer und lösen Sie das PCL 12 Stunden lang bei Raumtemperatur in Chloroform auf. Schneiden Sie ein kleines Stück der Nanofasermembran ab und beschichten Sie die Stücke fünf Minuten lang mit einer dünnen Goldschicht im Auto-Sputter-Verfahren. Schneiden Sie zunächst die hergestellte PVA-Nanofasermatte in Stücke der gewünschten Größe für den Transwell-Einsatz.

Bereiten Sie eine kleine Schüssel mit 1,5 Millilitern reiner Salzsäure vor. Stellen Sie die Schale mit der Salzsäure und den Nanofaserstücken in eine Vakuumkammer und schließen Sie den Deckel. Öffnen Sie dann das an die Vakuumpumpe angeschlossene Ventil und warten Sie 10 Sekunden, bis Salzsäuredämpfe aufsteigen.

Schließen Sie das Ventil und behandeln Sie die Membranen zwei Minuten lang mit Salzsäuredämpfen. Nach der Salzsäurebehandlung Tropfen destilliertes Wasser auf die Membranen geben. Legen Sie die Membranen auf einen Objektträger und lösen Sie sie von der Folie.

Verwenden Sie einen Auto-Sputter-Coater, um die Membranen auf dem Carbonband mit einer dünnen Goldschicht zu beschichten. Anschließend waschen Sie die mit Salzsäure vernetzten PVA-Nanomembranen dreimal mit PBS und weichen sie in den Nährmedien ein. Überprüfen Sie nach dem Einweichen den pH-Wert, um sicherzustellen, dass keine Salzsäure vorhanden ist.

Schneiden Sie zunächst die Nanofasermatten in runde Stücke mit einem Durchmesser von 10 Millimetern für PVA-Nanomembranen und 13 Millimetern für PCL-Nanomembranen. Mischen Sie die Base SYLGARD 184 und das Härtungsmittel im Verhältnis 10 zu eins in einem Kunststoffbecher. Verwenden Sie einen sauberen Objektträger, um die Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Lösung zwei bis drei Minuten lang kräftig zu mischen, bis sich Blasen bilden.

Verteilen Sie das PDMS gleichmäßig auf einem Objektträger. Tauchen Sie die Unterkante der Wendeschneidplatte gut gut in das PDMS ein. Legen Sie die Einlage dann gut kopfüber für 10 bis 15 Minuten auf den Diawärmer, bis das PDMS aushärtet.

Überprüfen Sie das PDMS mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um sicherzustellen, dass es nicht mehr klebrig ist. Drücken Sie nun die Einlage gut auf das PVA-Nanomembranstück, so dass die Unterseite der Einlage zur Nanofaserseite der Membran zeigt. Geben Sie einen Tropfen destilliertes Wasser in die Mitte der Vertiefung und entfernen Sie die Folie vorsichtig mit einer Pinzette.

Legen Sie dann die Einsatzvertiefung in eine neue 24-Well-Platte und lassen Sie die Membran trocknen. Tauchen Sie beim Anbringen des Nanomembranstücks eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze in die PDMS-Mischung und punktieren Sie sie genau an den vier Ecken und in der Mitte der Vertiefung. Legen Sie die Platte auf den Objektträgerwärmer und lassen Sie das PDMS fünf bis sieben Minuten lang aushärten.

Platzieren Sie als Nächstes das PCL-Nanomembranstück in der PDMS-Vertiefung, wobei die Nanofaserseite mit dem PDMS verbunden ist. Drücken Sie mit einer kleinen, sauberen Bürste leicht auf die Folienseite der Membran, um sie vollständig zu befestigen. Geben Sie dann 0,2 Milliliter 70%iges Ethanol in die Vertiefung, um das Entfernen der Folie zu erleichtern.

Sterilisieren Sie den Einsatz und den Boden im Transwell-Setup unter ultraviolettem Licht über Nacht. Waschen Sie am nächsten Tag die Einlage und den Boden gut, indem Sie 200 Mikroliter PBS in die Einlage und 500 Mikroliter in die untere Vertiefung für drei Zyklen von jeweils 10 Minuten geben. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht haben, waschen Sie sie mit 10 Millilitern PBS und fügen Sie zwei Milliliter 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu, um sie zu trypsinisieren.

Klopfen Sie vorsichtig auf die Schale, um die Zellen vom Boden zu lösen. Fügen Sie acht Milliliter des kompletten Nährmediums hinzu, um das Trypsin-Enzym zu neutralisieren, und geben Sie dann die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 400 g.

Nach dem Verwerfen des supra natanten wird das Zellpellet in fünf Millilitern vollständigem DMEM mit F12-Medium wieder suspendiert. Füllen Sie dann die untere Vertiefung mit 500 Mikrolitern komplettem DMEM F12 Medium. Übertragen Sie den an der PVA-Nanofasermembran befestigten Einsatz in den Transwell und fügen Sie 50 Mikroliter MLE-12-Zellsuspension hinzu.

Füllen Sie anschließend die an der unteren Seite befestigte PCL-Nanofasermembran mit 500 Mikrolitern NIH3T3-Zellsuspension. Nach zweistündiger Inkubation der Zellen wird die MLE-12-Zelle mit dem Insert und die NIH3T3-Zelle mit der Bodenvertiefung im Transwell-Aufbau zusammengebaut. Die räumliche Verteilung der NIH3T3-Zellen und MLE-12-Zellen im Kokultursystem war deutlich unterscheidbar, wobei grüne NIH3T3-Zellen in unterschiedlichen Tiefen dispergiert waren und rote MLE-12-Zellen Schichten bildeten. NIH3T3-Zellen infiltrieren die PCL-Nanofasermembran und erstrecken sich entlang der Nanofaserachsen, während MLE-12-Zellen an der Oberfläche der PDA-Nanofasermembran haften und eine Aggregation aufweisen.