Name: Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines 3D-Kokultursystems für Epithelzellen und Fibroblasten unter Verwendung nanofaseriger PVA- und PCL-Membranen. Diese Methode ermöglicht verbesserte zelluläre Interaktionen und Gewebeformation im Vergleich zu traditionellen 2D-Kulturen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Fortschrittliches zweischichtiges 3D-Co-Kultursystem für Epithel- und Fibroblastenzellen

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsin/EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicilin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>20x PBS</td><td>LPS-Lösung</td><td>CBP007A</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Biosesang</td><td>PC2031-050-00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 konjugierter ZO-1 Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>339194</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper Verdünnungsmittel OP Quanto</td><td>Epredia</td><td>10129-576</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 Assay Kit</td><td>Donginbio</td><td>CCK-3000</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale (150x20)</td><td>SPL</td><td>20151</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Grün CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Rot CMTPX</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Samchun</td><td>C0584</td><td></td></tr><tr><td>Konisches Rohr</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Corning</td><td>CLS2980245</td><td></td></tr><tr><td>DMEM hoher Glukosegehalt</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Welgene</td><td>LM 002-05</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Exsikkatorsockel mit Planflansch, Schraubgewinde</td><td>DWK Life Sciences</td><td>7.022 260</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Exsikkatordeckel & Exsikkator aus Glas Absperrhahn</td><td>Daihan Science</td><td>SM.2444061</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Absperrhahn, mit PTFE-Spindel</td><td>DWK Life Sciences&nbsp;</td><td></td><td></td>10322671</tr><tr><td>Elektrospinnmaschine</td><td>NanoNC</td><td>ESR200RD</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol, Pure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TMS-013-BKR&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Fluoreszenz-Laser-Scanner-Modul K1-fluo</td><td>Nanoskop-Systeme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel/Mount</td><td>Biomeda&nbsp;Corp.</td><td>M01</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehydlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Metalldüse 27G</td><td>NanoNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>Natur Republik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFlour 488</td><td>abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff Syringe_Lure Schloss (10 mL)</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>AL10</td><td></td></tr><tr><td>Poly(acrylsäure)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>323667</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinylalkohol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>Polycaprolacton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744</td><td></td></tr><tr><td>rein HCL</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskopie</td><td>SEC</td><td>SNE-4500M</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerglas</td><td>Marienfeld Superior</td><td>K15663717</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 set</td><td>omniscience</td><td>OMNI.05255</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Multimode Reader</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

etablierung eines dreidimensionalen kokulturmoduls von epithelzellen unter verwendung nanofaseriger membranen

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Dieses Protokoll beschreibt die kritischen Schritte für die Kokultivierung von MLE-12-Lungenepithelzellen und NIH3T3-Fibroblasten durch die Konstruktion eines auf Nanofasermembranen basierenden Zweischichtmodells (Abbildung 1). Dieses Modell eignet sich für die Bildgebung lebender Zellen, die Immunhistochemie und die quantitative Endpunktanalyse von kokultivierten Zellen. Andere Zelltypen können ebenfalls genutzt werden, indem die Zelldichte und die Wachstumsbedingungen optimiert werden.
REM zeigt die gleichmäßige Verteilung von hergestellten PVA-Nanofasern ohne jegliche Kügelchenbildung (Abbildung 2A). Der Durchmesser der PVA-Nanofasern reichte von 150 nm bis 230 nm (180 ± 25 nm, mittlere ± Standardabweichung (SD)). Die Nanofasern in elektrogesponnenen PCL-NMs waren zufällig orientiert und ähnelten strukturell Kollagen (Abbildung 2B). Die meisten Fasern in PCL-NMs hatten einen Durchmesser zwischen 300 nm und 7 μm (3,8 ± 2,5 μm). Somit hatte die nanofaserige PVA-Membran kleinere Porengrößen als die nanofaserige PCL-Membran.
Vor der Aussaat wurden MLE-12- und NIH3T3-Zellen mit Cell-Tracker rot bzw. grün gefärbt und während des gesamten Kokulturprozesses überwacht. Wie in Abbildung 3 gezeigt, konnte die räumliche Verteilung von MLE-12-Zellen in der Insertkammer und NIH3T3-Zellen in der unteren Kammer deutlich beobachtet werden. Die Focus-Stacking-Analyse zeigte, dass NIH3T3-Zellen in unterschiedlichen Tiefen (102 ± 20 μm) dispergiert und detektiert wurden, während MLE-12-Zellen Schichten mit einer Dicke von 80 ± 10 μm bildeten. NIH3T3-Zellen infiltrieren die PCL-Nanofasermembran und erstrecken sich entlang der Nanofaserachsen, während MLE-12-Zellen an der Oberfläche der PVA-Nanofasermembran haften und eine Aggregation aufweisen (Abbildung 4). Als nächstes untersuchten wir die Zytoskelettorganisation von NIH3T3-Zellen und MLE-12-Zellen durch Aktinfärbung. NIH3T3-Zellen, die auf einer nanofaserigen PCL-Membran kultiviert wurden, zeigen eine Projektilverteilung von Aktinfilamenten, die Zellen im Gewebe ähneln, und die Aktinfärbung in MLE-12-Zellen, die auf einer nanofaserigen PVA-Membran kultiviert wurden, zeigt runde Aggregate ohne zelluläre Ausbreitung (Abbildung 5).
Die Verteilung und das Wachstumsmuster von MLE-12-Zellen in Monokulturen und Kokulturen wurden verglichen. Cell-Tracker rot gefärbte Zellen in Monokultur auf den PVA-NMs bildeten Aggregate, aber die Zellen im Kokulturzustand behielten eine gleichmäßige Verteilung auf der Membran bei (Abbildung 6A). In einer 3D-Analyse von konfokalen Mikroskopiebildern zeigt das Wachstumsmuster von kokultivierten MLE-12-Zellen auf den PVA-NMs eine geschichtete Adhäsion von kultivierten Zellen an der Membran mit einer höheren konfluenten Zelldichte im Vergleich zu Zellen, die in Abwesenheit von Fibroblasten kultiviert wurden (Abbildung 6B). Darüber hinaus waren die Zell-zu-Zell-Adhäsion und die Expression von zonalem Occludin (ZO)-1 auf den Zelloberflächen (Pfeil angedeutet), nicht aber von Zellaggregaten, in der Kokultur deutlicher als in der Kultur ohne Fibroblasten (Abbildung 6C).
Die Proliferation von Zellen auf den Membranen wurde mit dem CCK-8-Assay gemessen. Die Proliferation von NIH3T3- und MLE-12-Zellen nahm mit der Zeit zu (Abbildung 7). Allerdings wurden auf den Membranen geringere Wachstumsraten der Zellen beobachtet als auf einer Kulturplatte (Daten nicht gezeigt). Kokultivierte NIH3T3- und MLE-12-Zellen auf NMs zeigen eine stabile Wachstumsrate im Vergleich zu den monokultivierten Zellen in einer Kulturplatte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung der NIH3T3-Fibroblasten- und MLE-12-Epithelzell-Co-Kulturmethode im Gerüst-basierten Zweischichtsystem. Abkürzungen: PVA = Polyvinylalkohol; PCL = Poly(ε-Caprolacton). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Struktur von PVA- und PCL-Nanofasern. (A) PVA- und (B) PCL-Nanofasermembranen wurden durch Elektrospinnen hergestellt. Die Struktur und der Durchmesser der Nanofasern werden mittels REM der Membranoberflächen gemessen. Maßstabsleisten = 1 μm (A), 10 μm (B). Abkürzungen: PVA = Polyvinylalkohol; PCL = Poly(ε-Caprolacton). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig03.jpg"> 
Abbildung 3: In einem Kokultursystem die räumliche Verteilung von NIH3T3-Zellen auf der nanofaserigen PCL-Membran und von MLE-12-Zellen auf der nanofaserigen PVA-Membran. NIH3T3-Zellen (4 × 105) wurden mit Cell-Tracker Green und MLE-12-Zellen (3 × 105) mit Cell-Tracker Red gefärbt. Die ausgesäten Zellen wurden 24 Stunden lang kultiviert und mit einem Z-Stacking-Bild eines konfokalen Mikroskops betrachtet. Die Zahlen werden in μm angegeben; Pfeile zeigen Abmessungen mit x (Breite), Y (Länge), Z (Tiefe) an. Abkürzungen: PVA = Polyvinylalkohol; PCL = Poly(ε-Caprolacton). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Adhäsion und Morphologie von NIH3T3-Zellen auf PCL-Nanofasermembran und MLE-12-Zellen auf PVA-Nanofasermembran. Die Zellen wurden 24 Stunden lang auf den Membranen kultiviert und mit REM bei 2.000-facher Vergrößerung beobachtet. Maßstabsleisten = 15 μm. Abkürzungen: PVA = Polyvinylalkohol; PCL = Poly(ε-Caprolacton). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Aktin-Stressfasern in NIH3T3-Zellen auf PCL-Nanofasermembran und MLE-12-Zellen auf PVA-Nanofasermembran. NIH3T3-Zellen (4 × 105) und MLE-12-Zellen (3 × 105 Zellen) wurden auf den nanofaserigen PCL- bzw. PVA-Membranen ausgesät. Nach 48-stündiger Kultur wurden die Zellen mit Phalloidin-iFlour 488 gefärbt und mit konfokaler Mikroskopie beobachtet. Maßstabsleisten = 50 μm. Abkürzungen: PVA = Polyvinylalkohol; PCL = Poly(ε-Caprolacton); FITC = Fluorescein-Isothiocyanat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig06.jpg"> 
Abbildung 6: Wachstumsmuster von kokultivierten MLE-12-Zellen auf einer nanofaserigen PVA-Membran. (A) Cell-Tracker-rot gefärbte MLE-12-Zellen (3 × 10,5 Zellen) wurden auf die PVA-Nanofasermembran ausgesät und allein (-NIH3T3-Zellen) und mit NIH3T3-Zellen in einem Zweischichtsystem (+NIH3T3-Zellen) für 48 h kultiviert. (B) Monokulturelle und kokultivierte MLE-12-Zellen für 48 Stunden wurden mit Hoechst 33342 (blau) und Phalloidin-iFlour 488 gefärbt und unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops beobachtet. Die 3D-Bilder werden mit der Oberflächenfunktion der Imaris Software angezeigt. (C) MLE-12-Zellen wurden 48 h lang kultiviert und mit Phalloidin-iFlour 488 und Anti-ZO-1-Antikörper (rot) fluoreszenzmarkiert. Maßstabsleisten = 50 μm. Abkürzungen: PVA = Polyvinylalkohol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig07.jpg"> 
Abbildung 7: Wachstumsrate der Zellen in einem zweischichtigen Kokultursystem. NIH3T3-Zellen (4 × 105) und MLE-12-Zellen (3 × 105) werden für die angegebene Zeit kokultiviert. Das Zellwachstum im Insert und im Bottom Well wird mit dem CCK-8-Assay gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Eine einfache Methode ist für die Analyse von Auswirkungen von Fibroblasten aus dem Bindegewebe auf verbundene Epithelzellen beschrieben. Die Kombination dieser Verfahren und dreidimensionalen Gewebekultur Analyse von Zellen nach der Isolierung aus 3D zu erleichtern. Die Technik ist für Zellen unterschiedlicher maligne Potential, so dass systematische Untersuchung der Wirkungen von Tumor-assoziiertem Stroma auf Tumorzellen.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

Fortschritte in der Biomaterialtechnologie ermöglichen die Entwicklung dreidimensionaler Konstrukte vom Typ Mehrzelle. Wir haben Elektrospinning-Protokolle entwickelt, um drei einzelne Gerüste herzustellen, um die Hauptstrukturzellen der Atemwege zu kultivieren und ein 3D-In-vitro-Modell der Bronchiolenwand der Atemwege zu erstellen.

Anpassung der Elektrospinnverfahren für einen Dreischicht stellen drei einzigartige Umgebungen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Atemwegswand

Diese Handschrift beschreibt eine weiche Lithographie-basierte Technik einheitlichen Arrays von dreidimensionalen (3D) Epithelgewebe definierter Geometrie durch extrazelluläre Matrix umgeben zu konstruieren. Dieses Verfahren ist offen für eine große Vielfalt von Zelltypen und experimentelle Kontexten und ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von identischen Replikaten.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

Aktuelle Bilayer Kultur Modelle erlauben nicht funktioneller in-vitro- Studien, die in Vivo Mikroumgebungen zu imitieren. Mit Polyethylenglykol und Zinkoxid Template Methode, beschreibt dieses Protokoll die Entwicklung der eine ultradünne biomimetische Basalmembran mit einstellbaren Steifigkeit, Porosität und biochemische Zusammensetzung, die eng in Vivo imitiert extrazellulären Matrizen.

Ultradünne derzei-elastischen Hydrogele als eine biomimetische Basalmembran für Dual Zellkultur

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur 3D-Kultur-Systeme selbst Montage Peptid Gerüste zur Förderung der Differenzierung der entdifferenzierten menschlichen Gelenkknorpel Chondrozyten Knorpel-ähnliches Gewebe zu erhalten.

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Fruchtwassermembran, um deren Heterogenität und funktionelle Eigenschaften für eine mögliche Anwendung in klinischen und physiopathologischen Modellen zu bestimmen.

In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Entwicklung und den Einsatz einer Phalloidin-basierten filamentösen Aktin-Färbetechnik mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) zur Visualisierung der adhärenten Zellschichtstruktur in mikrofluidischen dynamischen Kulturkanälen und traditionellen statischen Fix-Well-Kulturkammern. Dieser Ansatz hilft bei der Bewertung der Zellschichtkonfluenz, der Monolagenbildung und der Gleichmäßigkeit der Schichtdicke.

Präparation und strukturelle Bewertung von Epithelzell-Monoschichten in einer physiologisch dimensionierten mikrofluidischen Kulturanlage

Gewebekultureinsätze mit Kunststoffmembranen sind der goldene Standard in Zellkulturlaboren als durchlässige Stützen zur Etablierung von Zellschichten und Modellen von Barrieregeweben. Hier stellen wir eine einfache Methode vor, um die Kunststoffmembran durch eine biologisch relevantere Membran zu ersetzen, die aus einem rekombinanten funktionalisierten Spinnenseidenprotein besteht.

Nanofibrilläre Basalmembran-Imitation aus rekombinant funktionalisierter Spinnenseide in maßgefertigten Gewebekultureinsätzen

Ein neuartiges Dichtungsprotokoll zur Herstellung wasserdichter, silikonbasierter Dichtungen für Membranen von Polydimethylsiloxan-(PDMS)-Chip-Bauelementen. Vorgesehen für Labore zur Einrichtung von Chipmodellen und der Entwicklung von Chip-Plattformen im kleinen Maßstab. Wir demonstrieren das Protokoll mit Kunststoff- und nativen Gewebemembranen. Dieses Verfahren erfordert nur PDMS, Toluol, Schimmel, Membran und eine Vakuumkammer.

Zugängliches Silikonchip-zu-Membran-Abdichtungsverfahren für flexible, zuverlässige Bindungen

Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie (OR-PAM) ist eine aufstrebende Technologie, mit der abbildenden optischen Absorption...

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Erfahren Sie die Entwicklung eines 3D-Kokultursystems für Epithelzellen und Fibroblasten unter Verwendung nanofaseriger PVA- und PCL-Membranen. Diese Methode ermöglicht verbesserte zelluläre Interaktionen und Gewebeformation im Vergleich zu traditionellen 2D-Kulturen.

Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen

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