Name: Extraktion des Elastizitätsmoduls nativer pulmonaler Basalmembranen von Mäusen aus der Rasterkraftmikroskopie abgeleiteten Kraftkarten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie den Elastizitätsmodul nativer pulmonaler Basalmembranen von Mäusen durch Rasterkraftmikroskopie bestimmen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mechanischer Eigenschaften unfixierter biologischer Proben.

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<table><tbody><tr><td>1 mL Spritze</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td>Injekt-F</td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>B Braun</td><td>4606108V</td><td>Injekt Luer Solo</td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td>Röhrchen mit Schraubverschluss</td></tr><tr><td>Cantilever-Sonden - MLCT</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>3444</td><td>AFM Cantilevers mit pyramidenförmiger Spitzenform</td></tr><tr><td>Kryotomklingen</td><td>Leica Biosystems</td><td>14035843496</td><td>Low-Profile Einwegklingen DB80LX</td></tr><tr><td>Kryotom-Probenhalter</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047740044</td><td>Probenscheibe 30</td></tr><tr><td>Cyotome</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1950</td><td>Leica Cryostat</td></tr><tr><td>Direct Overlay Extension</td><td>Bruker</td><td></td><td>Softwareerweiterung für die JPK SPM Software, die es ermöglicht, das optische Bild des inversen Mikroskops in den Data Viewer der SPM-Software zu importieren.</td></tr><tr><td>Einweg-Basisform</td><td>Science Services</td><td>SA62534-15</td><td>Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm</td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>tesa Film</td><td>56661-00002</td><td>Fotofilm Klebeband</td></tr><tr><td>Cantilever-Halter mit fester Feder</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop - Leica DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK Motorisierter Tisch</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 4XP BioScience</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK SPM Software</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K5 CMOS Mikroskop Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Version R2024a oder höher</td></tr><tr><td>MATLAB - Curve Fitting Toolbox&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Toolbox für die Bildverarbeitung</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Toolbox für die Signalverarbeitung&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Toolbox für Statistik und maschinelles Lernen</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Carl Roth</td><td>H869.1</td><td>Einfache Objektträger für die Cantilever-Kalibrierung</td></tr><tr><td>Objektträger mit mattem Rand</td><td>Carl Roth</td><td>H870.1</td><td>Objektträger mit mattiertem Rand für Kryosektionen</td></tr><tr><td>Nadel & Schrägstrich; 0,9 mm & mal; 25 mm</td><td>B Braun</td><td>4657500</td><td>OCT Injektion&nbsp; in die Lungenprobe</td></tr><tr><td>Nadel & Schrägstrich; 0,9 mm & mal; 70 mm</td><td>B Braun</td><td>4665791</td><td>Lange Nadel zum Auftragen von PBS unter der AFM</td></tr><tr><td>OCT Verbindung</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td></tr><tr><td>Phosphat Buffered Saline</td><td>Bio& Verkauf der</td><td>BS.L1825</td><td>PBS-Lösung ohne Ca2+, Mg2+, 500 mL</td></tr><tr><td>QI Advanced Imaging Extension</td><td>Bruker</td><td></td><td>Software-Erweiterung für die JPK SPM Software, die für jedes aufgenommene Bildpixel die gesamte zugrunde liegende Kraftkurve bereitstellt.</td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>B Braun</td><td>5518083</td><td>Chirurgische Einweg-Skalpellschere</td></tr><tr><td></td><td>Kaut-Bullinger</td><td>M681700</td><td>Präzisionsschere 13 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Einseitiges Klebeband</td><td>tesa Film</td><td>57330-00000</td><td>glasklares Klebeband, 33 m x 19 mm</td></tr><tr><td>Diabox</td><td>GWL Storing Systems</td><td>K50W</td><td>Diabox für 50 Dias</td></tr><tr><td>Stereomikroskop - Stemi DR1663</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette - Vomm SS-SA-ESD</td><td>Eleshop</td><td>ELE002121</td><td></td></tr></tbody></table>

extraktion des elastizitätsmoduls nativer pulmonaler basalmembranen von mäusen aus der rasterkraftmikroskopie abgeleiteten kraftkarten

Extracting the Young's Modulus of Native Murine Pulmonary Basement Membranes from Atomic Force Microscopy Derived Force Maps

Nach der Identifizierung und Messung einer intakten Alveolarwand ist das primäre Ergebnis dieses Protokolls die gefilterten Elastizitätsmodulwerte des BM. Es ist wichtig zu beachten, dass es nicht in jedem Gewebeschnitt möglich ist, eine geeignete Alveolarwand für die AFM-Messung zu finden. In unseren experimentellen Beobachtungen wiesen ca. 75% der Kryoschnitte aus murinen Lungenproben eine quantifizierbare Alveolarwand auf. Um die räumliche Verteilung des Elastizitätsmoduls in einem pulmonalen BM genau zu bestimmen, empfehlen wir, Kraftkarten zu verwenden, die entweder 3 μm x 3 μm oder 4 μm x 4 μm umfassen. Dieser Ansatz gewährleistet eine ausreichende Auflösung für die Untersuchung von Lungen-BMs von Mäusen, die typischerweise eine Dicke von 100 nm bis 200 nm haben. Daher werden beim experimentellen Ansatz 50 x 50 Kraftkurven für jede Kraftkarte erfasst, was insgesamt 2.500 Kraftkurven ergibt. Innerhalb der Kraftkarte sind die Kraftkurven gleichmäßig verteilt. Dies impliziert, dass neben dem Young-Modul des BM auch die Gewebestrukturen, die den BM umgeben, auch in den kleinen Kraftkarten untersucht werden. Um den Elastizitätsmodul ausschließlich des pulmonalen BM genau und selektiv zu bestimmen, haben wir daher in diesem Protokoll einen zweistufigen Filterprozess implementiert.
Der erste Filterschritt der bedienerabhängigen räumlichen Filterung wählt die Ergebnisse der Kraftkurvenanpassung aus, die aus dem murinen Lungen-BM stammen und etwa 10 % bis 25 % der Gesamtergebniswerte ausmachen, die in der analysierten Kraftkarte enthalten sind. Nach dieser anfänglichen räumlichen Filterung werden ca. 250 bis 625 Anpassungsergebnisse für die weitere Analyse beibehalten. Der nächste Filterschritt stellt sicher, dass nur die BM-bezogenen Ergebnisse einbezogen werden, die aus Kraftkurven stammen, die durch das modifizierte Hertz-Modell angemessen beschrieben wurden. Daher wird das Bestimmtheitsmaß (R2) der modifizierten Hertz-Modellanpassung als Filterkriterium verwendet. Unsere empirischen Erfahrungen deuten darauf hin, dass die Beibehaltung von Ergebnissen mitR2-Werten über 0,96 für Fit-Ergebnisse geeignet ist, die durch die Einhaltung dieses Protokolls erzielt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass derR2-Wert maßgeblich von der Qualität (Glätte) und Länge der Basislinie des Kraftverlaufs, der Bestimmung des Kontaktpunktes und der Konvergenz des angepassten Modells beeinflusst wird. Nach Anwendung beider Filterverfahren verbleiben typischerweise etwa 100 bis 500 Elastizitätsmodulwerte für die BM einer einzelnen Alveolarwand.
Die Verteilung dieser verbleibenden Elastizitätsmodulwerte aus dem BM kann mit Hilfe eines Histogramms visualisiert werden (Abbildung 4A). Es ist wichtig zu beachten, dass die resultierenden Elastizitätsmodulwerte des pulmonalen BM einer logarithmischen Normalverteilung folgen, die häufig bei Zufallsvariablen beobachtet wird, die nur positive Werte61 erreichen können. Dies wird durch das QQ-Diagramm in Abbildung 4B visualisiert. Folglich kann eine Normalverteilung (Gaußsche Verteilung) an die Verteilung der logarithmisch transformierten Werte des Elastizitätsmoduls (E) angepasst werden. Hier wurde der natürliche Logarithmus (ln) verwendet, um die E-Werte zu transformieren. Die Spitzenposition der Verteilung (μ) und der Standardabweichung (σ) wurde aus dieser Anpassung extrahiert und anschließend erneut transformiert, um den repräsentativen Elastizitätsmodul zu erhalten, der als EBM bezeichnet wird, wobei die folgende Gleichung verwendet wurde:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq01.jpg" style="margin: auto;">
Beachten Sie, dass das Standardabweichungsintervall nach der Retransformation nicht mehr symmetrisch um den Spitzenwert ist. Die negativen (σ-) und positiven (σ+) Kanten des Standardabweichungsintervalls können mit den folgenden Ausdrücken berechnet werden:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq02.jpg" style="margin: auto;">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq03.jpg" style="margin: auto;">
Diese Gleichungen sind eine Folge der Tatsache, dass die Exponentialfunktion die Kehrfunktion des natürlichen Logarithmus62 ist.
Nach der erneuten Transformation des Spitzenwerts μ = 9,31 und der aus dem Histogramm in Abbildung 4A ermittelten Standardabweichung σ = 0,18 beträgt der repräsentative Elastizitätsmodulwert EBM = 11,05 kPa mit einem Standardabweichungsintervall von [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. Alternativ kann eine logarithmisch-normale Verteilung an das Histogramm der nicht transformierten Werte des Elastizitätsmoduls (E) angepasst werden, um die charakteristischen Parameter der Verteilung zu bestimmen.
Es wird empfohlen, mindestens vier Wände pro Maus zu analysieren, um ein robustes repräsentatives Ergebnis zu erhalten, wie wir in Hartmann et al.59 ausführlich gezeigt haben. Um den repräsentativen Elastizitätsmodul EBM für eine Maus zu bestimmen, wurden die logarithmisch transformierten Werte aller vier Wände in einem kombinierten Histogramm aufgetragen und μ und σ durch Anpassung einer Normalverteilung bestimmt. Anschließend werden μ und σ wie zuvor beschrieben erneut transformiert, um EBM und das Standardabweichungsintervall für die Probandmaus abzurufen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Überblick über die wichtigsten Protokollschritte zur Bestimmung des Elastizitätsmoduls einer murinen pulmonalen Basalmembran. Der erste Schritt besteht darin, murine Lungen zu gewinnen, vorzubereiten und anschließend einzubetten. Daher wird die Lunge mit einer Kombination aus OCT-Medium und PBS injiziert und dann vollständig in die OCT-Verbindung eingetaucht. Anschließend werden 15 μm dicke Lungengewebeschnitte durch Kryosektion mit einem Kryotom gewonnen. In diesem Protokoll beschreiben wir den Prozess der Verwendung von einseitigen und zweiseitigen Klebebändern, um die Proben während des Schneidprozesses an Ort und Stelle zu sichern. Anschließend werden die Elastizitätsmodulwerte des BM durch AFM-Kraftmesskarten an den Gewebeschnitten bestimmt. Nach Abschluss der Kraftkurvenanalyse wird eine räumliche und R²-Filterung angewendet, um die Ergebnisse des Elastizitätsmoduls der interessierenden Struktur, insbesondere des BM (in der Kraftkarte grün dargestellt und in der logarithmisch transformierten Elastizitätsmodulverteilung quantifiziert) zu isolieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Ein beispielhaftes Kraftkartierungs-AFM-Experiment, das an einem murinen Lungengewebeschnitt durchgeführt wurde. (A) Hellfeldmikroskopisches Übersichtsbild eines murinen Lungengewebeschnitts, das die Identifizierung geeigneter intakter Alveolarwände zwischen zwei Lungenbläschen ermöglicht. Auf der rechten Seite des Bildes ist der dreieckige MLCT-Ausleger F des AFM zu sehen. (B) Vergrößerte Ansicht einer ausgewählten Wand innerhalb des Gewebeschnitts. (C) Neigung und (D) Höhenkanal einer 15 x 15 μm großen Übersichtskarte mit 50 x 50 Kraftkurven der Alveolarwand. Im Hangkanal ist das BM als helle Linie (weißer Pfeil) zu erkennen, die auf eine Struktur mit erhöhter Steifigkeit innerhalb der Wand hinweist. Der Höhenkanal bestätigt die Unversehrtheit der Wand und zeigt keine Anzeichen eines Bruchs. Nach der Identifizierung des BM in der Übersicht 15 x 15 μm Karte wird eine kleinere 4 x 4 μm Karte (E: Steigungskanal, F: Höhenkanal) mit 50 x 50 Kraftverläufen aufgenommen. Maßstabsleisten: (A) 200 μm und (B-D) 25 μm. Die Bereiche der Farbskalen der gezeigten AFM-Bilder betragen (C) 2,36 - 9,29 nN/μm, (D) 0 - 3,38 μm, (E) 2,36 - 9,29 nN/μm (Übersichtsbild) und 2,42 - 8,37 nN/μm (kleineres Bild), (F) 0 - 3,38 μm (Übersichtsbild) und 0 - 1,99 μm (kleineres Bild), von dunkel bis hell. Für alle AFM-Bilder wurden lineare Farbskalen verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Visualisierung des räumlichen Filterverfahrens. (A) Die Young-Modulkarte, die sich aus der Kraftkurvenanalyse ergibt, wie sie im Ergebnisfilterwerkzeug angezeigt wird, um die räumliche Filterung der Ergebnisse zu ermöglichen. Der BM ist als heller Streifen (hohe Elastizitätsmodulwerte) zu erkennen, der von weicheren Gewebekompartimenten umgeben ist. (B) Histogramm der Elastizitätsmodulwerte, die der ungefilterten Karte entsprechen (A). Nach der Anwendung der räumlichen Filtermaske (grüner Bereich) (C) enthält das Histogramm ausschließlich die Elastizitätsmodulwerte aus dem grün hervorgehobenen Bereich, der als BM identifiziert wurde. Es ist zu beachten, dass die auf der linken Seite des Histogramms beobachtbaren weichen Restwerte auf schlecht konvergierende Passungen zurückzuführen sind, die im nachfolgenden R²-Filterschritt eliminiert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Elastizitätsmodulverteilung eines murinen Lungen-BM, der nach diesem Protokoll erhalten wurde. (A) Logarithmisches normalisiertes Histogramm der resultierenden BM-Elastizitätsmodulwerte (N = 325). Durch Anpassung an eine Normalverteilung (schwarze durchgezogene Linie) wird der Mittelwert μ = 9,31 mit einer Standardabweichung von σ = 0,18 ermittelt. Nach der Retransformation entspricht dies einem Elastizitätsmodul des BM von EBM = 11,05 kPa mit einem asymmetrischen Standardabweichungsintervall von [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. (B) QQ: Diagramm der Quantile der logarithmusisierten BM-Elastizitätsmodulwerte im Vergleich zu den Quantilen einer Standardnormalverteilung. Dieses Diagramm zeigt, dass mit Ausnahme einiger Werte am linken und rechten Rand der Verteilung die resultierenden Werte des Elastizitätsmoduls hauptsächlich logarithmisch-normalverteilt sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Extraktion des Elastizitätsmoduls nativer pulmonaler Basalmembranen von Mäusen aus der Rasterkraftmikroskopie abgeleiteten Kraftkarten

Atomic force microscopy (AFM) allows the characterization of the mechanical properties of a sample with a spatial resolution of several tens of ...

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