Erzeugung von dreidimensionalen Sphäroiden/Organoiden aus zweidimensionalen Zellkulturen mit Hilfe eines neuartigen Stempelgeräts

Ziel unserer Forschung ist es, ein effizientes und reproduzierbares Protokoll für die Generierung dreidimensionaler Zellkulturen unter Verwendung eines innovativen stufenbasierten Mikrotitersystems in Agaroseformen zu etablieren. Unser Ziel ist es, Antworten darauf zu finden, wie eine vereinfachte, kontrollierte Umgebung geschaffen werden kann, die einheitliche, qualitativ hochwertige 3D-Kulturen für Arzneimitteltests, Gentechnik und verwandte Anwendungen fördert. Jüngste Fortschritte bei 3D-Zellkultursystemen verbessern die Zellinteraktionen und schaffen mehr in vivo-ähnliche Umgebungen.

Dieser Ansatz verbessert die Bildung von Sphäroid-Organoiden und ist damit ein vielversprechendes Werkzeug für die biomedizinische Forschung. Zu den aktuellen Technologien für die 3D-Zellkultur gehören hängende Tropfen, rotierende Zellkulturen, Kunststoffe mit geringer Anhaftung, Platten mit konischen Vertiefungen, mikroporöse Gerüste, magnetische Beads und gerüstfreie Hydrogele. Diese Methoden ermöglichen die Bildung von 3D-Zellstrukturen, jede mit ihren eigenen Vorteilen und Einschränkungen.

Unser Protokoll adressiert die Herausforderung, einheitliche 3D-Sphäroide und Organoide mit gleichbleibender Größe und Qualität in großem Maßstab zu erzeugen. Es löst Probleme der Lebensfähigkeit und Zelldichte, Handhabungsschwierigkeiten und Instabilität während des Prozesses und erweist sich als kostengünstige, reproduzierbare Lösung für die zuverlässige Forschung an 3D-Zellkulturen. Wir setzen uns für die Verbesserung der Forschungsinstrumente, die Generierung von Sphäroid-Organoiden von insulinproduzierenden Betazellen für die In-vitro-Analyse und die Verkapselung in Biopolymeren ein, mit dem Ziel der Rückgängigmachung von Typ-I-Diabetes und der Generierung von Sphäroid-Organoiden aus dreifach negativen menschlichen Brustkrebszellen als Wirkstoff-Screening-Plattform vor der Behandlung von Patientinnen.

Entwerfen Sie das Stempelgerät mit der angegebenen Software. Waschen Sie den maßgefertigten Stempel mit einem weichen Schwamm und destilliertem Wasser, um Rückstände zu entfernen. Setzen Sie den sauberen Stempel fünf bis 10 Minuten lang ultraviolettem Licht aus, um die Sterilität zu gewährleisten.

Um 1 bis 2% Agaroselösung herzustellen, wiegen Sie die erforderliche Menge reines Agarosepulver ab und lösen Sie es in PBS auf. Die Lösung in der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Als nächstes pipettieren Sie etwa drei Milliliter der 40 Grad Celsius heißen Agaroselösung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.

Den Stempel in die Mitte der Vertiefung legen und die Agarose 5 bis 10 Minuten fest werden lassen. Entfernen Sie nach der Erstarrung den Stempel mit sanften Hin- und Herbewegungen, um das Vakuum zu lösen, ohne die Mikrowells zu beschädigen. Waschen Sie die Mikrovertiefungen dreimal mit PBS, um Rückstände zu entfernen.

Setzen Sie die Platte 10 Minuten lang ultraviolettem Licht aus, um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Geben Sie drei Milliliter Nährmedium in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator. Um eine homogene Suspension von Pankreasinseln von Schweinen zu erhalten, fügen Sie Trypsin zu einer zweidimensionalen Zellkultur hinzu, um die Zellen zu dissoziieren.

Zählen Sie dann die Zellen und passen Sie die Konzentration an, um die gewünschte Anzahl von Zellen pro Mikrotiter einer Sechs-Well-Platte zu erreichen. Pipettieren Sie drei Milliliter der Zellsuspension über die Agarose-Mikrovertiefungen und schwenken Sie die Platte, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Lassen Sie die Zellen 10 bis 15 Minuten lang durch die Schwerkraft absetzen.

Beobachten Sie dann die angesiedelten Zellen unter dem Mikroskop. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Ersetzen Sie alle zwei bis drei Tage 50 % des alten oder verbrauchten Mediums durch frisches Medium.

Kultivieren Sie so lange, bis kompakte, dreidimensionale Strukturen vollständig gebildet sind. Um Sphäroide oder Organoide zu sammeln, entfernen Sie das Nährmedium und sammeln Sie mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze die dreidimensionalen Strukturen durch kräftiges Pipettieren. Durch 48-stündige Kultivierung in Agarose-Mikrovertiefungen wurden erfolgreich kompakte dreidimensionale Strukturen gebildet, die durch zeitabhängige Zellaggregation beobachtet wurden.

Lebensfähige dreidimensionale Strukturen blieben bei der Entnahme aus den Agarose-Mikrovertiefungen erhalten, wobei eine grüne Färbung auf lebende Zellen innerhalb der Strukturen hindeutete, was die Lebensfähigkeit und Stabilität der Zellen bestätigte.