Design und Validierung eines volumetrischen Extrusions-Bioprinters für das Bioprinting von löslichem Basalmembranextrakt für die translationale Forschung

Der Umfang dieser Forschung umfasst die Entwicklung und Validierung eines kostengünstigen Bioprinting-Systems zur volumetrischen Kontrolle und die Entwicklung eines spezifischen Protokolls für das Bioprinting von löslichen Basalmembranextrakten. SBMEs zeichnen sich durch eine einzigartige und komplexe Serologie aus, die viele Herausforderungen in ihrer Handhabung mit sich bringt, eine sorgfältige Kontrolle während ihrer Herstellung erfordert und ihre Verwendung als reine Materialien stark einschränkt. Standardmäßige, pragmatisch orientierte Bioprinting-Systeme sind nicht in der Lage, die SBME-Dosierung richtig zu steuern, und erfordern oft Biotintenmischungen, die zu Variabilität führen. Bioprinting-Systeme mit volumetrischer Kontrolle können diese Probleme lösen, sind aber bei konstanten Lösungen begrenzt. Im Vergleich zu den Techniken bietet unser kundenspezifisches Bioprinting-System zur volumetrischen Kontrolle eine lokale Kostenlösung für das Bioprinting von reinen oder verdünnten Konstrukten unter Verwendung von SBMEs mit guter Formtreue.

[Dozent] Laden Sie zunächst die STL-Designdatei in die Slicing-Software. Positionieren Sie das Werkstück auf einer ebenen Fläche, und verschieben Sie es auf die Koordinaten 65, 42,5, 0 Millimeter in der X-, Y- und Z-Achse. Erstellen Sie zwei Kopien, indem Sie in der Objektliste auf den STL-Dateinamen klicken und Ausgewählte multiplizieren auswählen. Verschieben Sie sie auf die Koordinaten: 16, 42,5, 0 Millimeter und -33, 42,5, 0 Millimeter. Navigieren Sie zu den Druckeinstellungen im Bühnenmenü. Legen Sie im Wandquerschnitt die Anzahl der Wandlinien auf Null fest. Legen Sie die obere und untere Dicke im oberen und unteren Bereich auf Null fest. Legen Sie im Füllbereich das Füllmuster auf Raster fest. Abstand der Fülllinie auf fünf Millimeter und Richtung der Fülllinie auf Null. Deaktivieren Sie das Zurückziehen im Bereich "Verfahrweg" und deaktivieren Sie dann die Druckkühlung im Bereich "Kühlen". Wählen Sie im Abschnitt "Bauplattenhaftung" die Option "Keine" als Art der Bauplattenhaftung aus. Wählen Sie im Abschnitt "Spezialmodus" die Option "Eine Option nach der anderen" als Druckreihenfolge aus. Klicken Sie auf die Slice-Schaltfläche, um den G-Code zu generieren. Öffnen Sie die G-Code-Datei mit Editor. Entfernen Sie die Zeilen M104 S200, M105 und M109 S200 in Zeile 12 nach dem Satz Generiert mit Cura_SteamEngine 4.9.0. G1 Z25 vor der Zeile hinzufügen, ; Dateiname der MESH-Spalte. STL. Teilen Sie die nächste Zeile in zwei Zeilen auf. Ändern Sie den Z-Wert in jeder Zeile auf Z25, die nach TIME_ELAPSED Kommentar für die letzte Layer-Anweisung jedes Stücks vorhanden ist. Stellen Sie den Kolben mit handelsüblichen murinen Prostatakrebszellen unter eine Biosicherheitswerkbank. Entnehmen Sie das Zellkulturmedium mit einer Pipette aus dem Kolben. Waschen Sie die Zellen einmal mit zwei Millilitern PBS und saugen Sie es dann ab. 500 Mikroliter Trypsin in den Kolben geben. Stellen Sie den Kolben für fünf Minuten in einen Inkubator, um die Zellablösung von der Platte zu erleichtern. Überprüfen Sie die Zellen auf Trypsinisierung. Geben Sie dann 4,5 Milliliter Nährmedium in den Kolben. Waschen Sie die Platte sorgfältig, um sicherzustellen, dass alle abgelösten Zellen im Medium schwimmen. Das Medium wird abgesaugt und in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Nehmen Sie ein Aliquot von 20 Mikrolitern der Suspension und mischen Sie es mit Trypanblau. Pipettieren Sie 10 Mikroliter dieser Mischung in eine Zellzählkammer, um die lebenden Zellen zu zählen. Die restliche Zellsuspension bei 345 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in kaltlöslichem Basalmembranextrakt oder SBME-Matrix bei der gewünschten Zelldichte. Mit einer Kaltspritze werden 800 Mikroliter der Matrixsuspension, die die Zellen enthält, aspiriert. Nachdem Sie alle eingeschlossenen Luftblasen aus der Spritze entfernt haben, legen Sie die Spritze in eine sterile Schachtel und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang, um eine Gelierung zu ermöglichen. Führen Sie die Spritze nach der Inkubation in den Druckkopf des Bioprinters ein. Stellen Sie sicher, dass der Spritzenkolben in Kontakt mit dem Schubblock ist. Sichern Sie den Kolben und die Spritze mit dem Kolbenhalter der Spritze. Verwenden Sie zwei Schrauben und entsprechende Muttern zur Befestigung. Verwenden Sie M4-Muttern am unteren Teil des Extruders, um den Federdruck einzustellen und die Spritze zu verriegeln. Kalibrieren Sie das System, indem Sie im Menü des Biodruckers die Auto-Home-Einstellung auswählen, um den Ursprung der Achsen automatisch zu erkennen. Platzieren Sie eine Platte mit sechs Vertiefungen auf der Druckebene. Bewegen Sie den Extruder mit dem Befehl Achsen verschieben, bis die Nadelspitze den Boden der Vertiefung berührt, um Z-Null manuell zu definieren. Wählen Sie die G-Code-Datei aus der Menüoption im Biodrucker aus und beginnen Sie mit dem Druck, um ein quadratisches Sechs-Lagen-Gitter mit einer Seite von 2,6 Zentimetern in jede Vertiefung abzugeben. Verwenden Sie nach dem Drucken ein inverses Mikroskop, um sicherzustellen, dass der Druckvorgang erfolgreich ist. Legen Sie die Multiwell-Platte für zwei Minuten in den Inkubator, damit sich das SBME nach der Extrusion absetzen kann. Zum Schluss pipettieren Sie zwei Milliliter Zellkulturmedium in jede Vertiefung. Diese Abbildung zeigt die Bewertung der Bedruckbarkeit in Serpentinenmustern, wobei der Schwerpunkt auf der Faserhomogenität und dem Spreizverhältnis bei unterschiedlichen Vorschubgeschwindigkeiten liegt. Mit der Erhöhung der Vorschubgeschwindigkeit von E100 auf E200 nahm auch das Spreizverhältnis zu, was auf eine breitere Faserabscheidung bei höheren Durchflussraten hinweist. Wenn die Druckgeschwindigkeit von fünf Millimetern pro Sekunde bis 20 Millimeter pro Sekunde variiert wurde, blieb das Streuverhältnis unter allen getesteten Bedingungen relativ stabil, was darauf hindeutet, dass die Druckgeschwindigkeit nur einen minimalen Einfluss auf die Faserbreite hatte. Diese Abbildung zeigt die Bewertung der Bedruckbarkeit von einlagigen und mehrschichtigen Rastern. In den einschichtigen Strukturen führten Variationen in der Porengröße zu deutlichen Unterschieden in der Gittergleichmäßigkeit. Beim Drucken von mehrschichtigen Rastern behielten die Konstrukte ihre Formtreue weitgehend bei. Die gedruckten Strukturen bedeuten, dass der Faserdurchmesser mit CAD-Modellen und einschichtigen Konstrukten übereinstimmt. Dies zeigt, dass der Bioprinting-Prozess über mehrschichtige Strukturen und unterschiedliche Geometrien hinweg zuverlässig ist. Diese Abbildung bewertet die Zellviabilität in 3D-biogedruckten Konstrukten im Vergleich zu Kontrollproben. Die Lebensfähigkeit blieb bei über 80 %, ähnlich wie bei Kontrollproben, was darauf hindeutet, dass der Druckprozess nur minimale Auswirkungen hatte. Mikroskopieaufnahmen mit 10- und 20-facher Vergrößerung zeigten keine signifikanten morphologischen Unterschiede, was eine ähnliche Zellverteilung und Morphologie in beiden Gruppen bestätigt.