Eine Methode zur 2-Photonen-Imaging der Blutfluss in den Neocortex durch ein Cranial Fenster

Die Fähigkeit, das zerebrale Gefäßsystem abzubilden und die Dynamik des Blutflusses im intakten Gehirn lebender Nagetiere aufzuzeichnen, ist eine leistungsfähige Technik, die zur Untersuchung der zerebralen Ischämie oder der normalen Gehirnphysiologie eingesetzt werden kann. Hier zeigen wir, wie man mit Hilfe von zwei Fotomikroskopien die Dynamik des Blutflusses im Neokortex lebender Mäuse mit Fluoreszenzfarbstoffen, die in die Schwanzvene injiziert werden, abbilden kann. Diese Technik wurde ursprünglich von David Kleinfeld in Winfred Dank entwickelt.

Hallo, ich bin Ricardo Mota vom Labor von Carlos Porter Cayo in der Abteilung für Neurologie an der University of California Los Angeles. In einem früheren Video haben wir Ihnen die Methode zur Implantation eines Schädelfensters für chronisch bildgebende Experimente in vivo gezeigt. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Darstellung der Blutflussdynamik in der Großhirnrinde durch ein Schädelfenster.

Dieses Präparat ist sehr nützlich, da es ermöglicht, mit Hilfe der Photonenlasermikroskopie tief im Inneren des Gehirns abzubilden. Also fangen wir an. Um das Hirngefäßsystem abzubilden, muss den Tieren intravenös ein Fluoreszenzfarbstoff injiziert werden.

Wir verwenden konjugierte Farbstoffe von Dexter, da das Dextron Moty verhindert, dass der Farbstoff die Blut-Hirn-Schranke überwindet und aus den Blutgefäßen austritt. Die Mäuse werden mit Fluor betäubt, 4 % zur Induktion und 1,5 bis 2 % während der Injektion. Als nächstes wird der Schwanz mit drei Tupfern 70%iger Alkohol mit einer 26-Gauge-Nadel desinfiziert, 75 bis hundert Mikroliter einer 5%igen Lösung von R domine Dextran, gelöst in Kochsalzlösung, wird durch die Schwanzvene injiziert.

der Mitte des Schwanzschaftes können Tiere unmittelbar nach der Schwanzveneninjektion abgebildet werden, bis die Matrize mit dem Urin ausgeschieden wird, der sich rosa färbt, wenn ERO Domine-Farbstoff verwendet wird. Etwa zwei Stunden nach der fluoreszierenden Dexter-Farbstoffinjektion wird die Maus mit Fluor betäubt. Auch hier 4 % für die Induktion, eins bis 1,5 % für die Bildgebung. Die Maus wird mit Hilfe der Titanstange fest mit dem Mikroskoptisch verbunden, der ein thermisch geregeltes Heizkissen enthält, um das Tier warm zu halten.

Etwas Augensalbe wird aufgetragen, um die Augen feucht zu halten. Das Deckglas des Schädelfensters wird mit 70%igem Alkohol gereinigt. Das Fenster wird parallel zur Fokusebene positioniert und im Sichtfeld zentriert.

Unter dem Vier-fach-Objektiv ist es am besten, mit einer Digitalkamera ein Foto der Oberflächengefäße des Gehirns zu machen. Dieses Bild wird in den folgenden Bildgebungssitzungen als Referenzbild verwendet, um den Bildbereich von Tag zu Tag wiederholt zu finden. Das vierfache Objektiv wird dann durch ein 40-fach-Objektiv mit Wasserimmersion ersetzt.

Ohne die Bühne zu bewegen, wird das digitale Bild der Ansicht aufgenommen. Auch hier werden die Koordinaten des Tischmanipulators auf Null gesetzt. Wir verwenden Scanbild als Bilderfassungssoftware.

Dies wurde in MATLAB von Tom Paul Rudo und Bernardo Sabatini im Labor von Carls Voto geschrieben. Als nächstes schalten wir alle anderen Geräte ein, den Laser, den Leistungsmesser, die Photomultiplier-Röhren, die Verstärker und so weiter. Der für die Abbildung geeignete Bereich des Fensters wird kurz bei geringer Vergrößerung abgetastet, um die besten Bereiche zu finden.

Sobald diese identifiziert sind, wird der Stapel mit geringer Vergrößerung des ausgewählten abzubildenden Bereichs entnommen und seine XY-Koordinaten werden mit Anmerkungen versehen, um die Dynamik des Blutflusses in kleinen Gefäßen oder Kapillaren aufzuzeichnen. Wir verwenden Zeilenscans entlang von mindestens 40 Mikrometern des interessierenden Gefäßes. Diese einzelnen Sweeps, die eine Sekunde dauern, werden mit so wenig Laserleistung wie möglich durchgeführt und die Koordinaten und der Scanwinkel werden notiert.

Sobald die Bildgebung beendet ist, wird das Tier in eine warme Kammer gebracht, wo es sich von der Narkose erholen kann. Hier zeigen wir einen Stapel von hundert Bildern, die alle fünf Mikrometer mit unserem Zwei-Photonen-Mikroskop durch ein Schädelfenster aufgenommen wurden, das über dem somatosensorischen Kortex einer fünf Monate alten Maus platziert wurde, der r Domine Dextran durch die Schwanzvene injiziert wurde. Diese Bildsequenz zeigt das komplexe Netzwerk aus großen und kleinen Blutgefäßen, einschließlich Kapillaren.

Wir haben Ihnen gerade eine Methode zur Visualisierung der Blutflussdynamik in vivo durch ein Schädelfenster gezeigt. Dies ist eine äußerst leistungsfähige Methode, um die Dynamik des zerebralen Blutflusses im kortikalen Gefäßsystem abzubilden, um beispielsweise Veränderungen des Blutflusses nach einem Schlaganfall zu untersuchen. Multiple Imaginationen können zu verschiedenen Zeiten in BULs durchgeführt werden, indem wiederholte Schwanzveneninjektionen des Fluoreszenzfarbstoffs verwendet werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, unter möglichst sauberen und sterilen Bedingungen zu arbeiten und eine sehr ruhige Hand zu haben. Okay, und das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihrem Experiment.