Name: Durchflusszytometrische Hochdurchsatzmessung des zellulären Mechanotyps auf der Grundlage einer Ruptur und Abgabe von DNA-Spannungssonden in die Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T12:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Erfahren Sie eine Hochdurchsatzmethode zur Messung zellulärer Zugkräfte mittels Durchflusszytometrie. Diese Technik nutzt DNA-Spannungssonden zur Mechanophenotypisierung und eröffnet neue Ansätze für die Mechanotherapie.

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<ol><li>Puleo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+during+directed+cell+migration+requires+dynamic+actin+polymerization+at+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing during directed cell migration requires dynamic actin polymerization at focal adhesions.</a> J Cell Biol. 218 (12), 4215-4235 (2019).</li>
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<li>Chapman, M., Rajagopal, V., Stewart, A., Collins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+of+single-cell+mechanotyping+approaches+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Critical review of single-cell mechanotyping approaches for biomedical applications.</a> Lab Chip. 24 (12), 3036-3063 (2024).</li>
<li>Swaminathan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stiffness+grades+metastatic+potential+in+patient+tumor+cells+and+in+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanical stiffness grades metastatic potential in patient tumor cells and in cancer cell lines.</a> Cancer Res. 71 (15), 5075-5080 (2011).</li>
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<li>Liu, Y., Galior, K., Ma, V. P. -Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tension+probes+for+imaging+forces+at+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular tension probes for imaging forces at the cell surface.</a> Acc Chem Res. 50 (12), 2915-2924 (2017).</li>
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<li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+single+molecular+forces+required+to+activate+integrin+and+notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling.</a> Science. 340 (6135), 991-994 (2013).</li>
<li>Jo, M. H., Cottle, W. T., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+molecular+tension+during+cell+adhesion+and+migration+using+multiplexed+differential+analysis+of+tension+gauge+tethers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of molecular tension during cell adhesion and migration using multiplexed differential analysis of tension gauge tethers.</a> ACS Biomater Sci Eng. 5 (8), 3856-3863 (2019).</li>
<li>Tompkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+underpinnings+of+ssDNA+specificity+by+Rep+HUH-endonucleases+and+implications+for+HUH-tag+multiplexing+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular underpinnings of ssDNA specificity by Rep HUH-endonucleases and implications for HUH-tag multiplexing and engineering.</a> Nucleic Acids Res. 49 (2), 1046-1064 (2021).</li>
<li>Lovendahl, K. N., Hayward, A. N., Gordon, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-Directed+Covalent+Protein-DNA+Linkages+in+a+Single+Step+Using+HUH-Tags%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Sequence-Directed Covalent Protein-DNA Linkages in a Single Step Using HUH-Tags.</a> J Am Chem Soc. 139 (20), 7030-7035 (2017).</li>
<li>Kim, K. A., Vellampatti, S., Hwang, S. H., Kim, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+single+molecule+force+sensor+for+characterization+of+%CE%B1+5+%CE%B2+1+integrin+tension+required+for+invadopodia+formation+and+maturation+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">DNA-based single molecule force sensor for characterization of α 5 β 1 integrin tension required for invadopodia formation and maturation in cancer cells.</a> Adv Funct Mater. 32 (28), 2110637(2022).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+molecular+tension+within+motile+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Integrin molecular tension within motile focal adhesions.</a> Biophys J. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li>
<li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanocytometry+using+tension-activated+cell+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanocytometry using tension-activated cell tagging.</a> Nat Methods. 20 (11), 1666-1671 (2023).</li>
<li>Pal, K., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitous+membrane-bound+DNase+activity+in+podosomes+and+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ubiquitous membrane-bound DNase activity in podosomes and invadopodia.</a> J Cell Biol. 220 (7), e202008079(2021).</li>
<li>Kim, K. A., Vellampatti, S., Kim, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+integrin+molecular+tension+of+human+breast+cancer+cells+on+anisotropic+nanopatterns%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of integrin molecular tension of human breast cancer cells on anisotropic nanopatterns.</a> Front Mol Biosci. 9, 825970(2022).</li>
<li>Wang, Y., Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensor+revealed+abnormal+nuclease+spatial+activity+on+cancer+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Optical sensor revealed abnormal nuclease spatial activity on cancer cell membrane.</a> J Biophotonics. 12 (5), e201800351(2019).</li>
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<li>Rashid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-covalent+nuclease-resistant+and+hydrogel-tethered+DNA+hairpin+probes+map+pN+cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">All-covalent nuclease-resistant and hydrogel-tethered DNA hairpin probes map pN cell traction forces.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 15 (28), 33362-33372 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 mL konisches Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Glasbodenplatte</td><td>Cellvis</td><td>P96-1.5H-N Selbstklebende PCR-Plattenfolie</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Apex Bioresearch Produkte&nbsp;</td><td>25-530</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 20 mL Säule</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyliert BSA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Kompetent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51030284</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75009521</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseschlauch</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI88242</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>Durchfluss Zytometer</td><td>BD</td><td>Accuri C6 Plus</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo&nbsp;</td><td>BD</td><td>FlowJo v10.10</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O3196-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02125</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>Ligand Stand</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>benutzerdefiniertes Oligo</td><td>GCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Protein</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Nickel-NTA Harz&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88222</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodidlösung</td><td>Cayman Chemicals</td><td>10008351</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Serum Freie Medien</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4124801</td><td>Gibco Optimem Gebrauchte, alternative serumfreie Medien sind in Ordnung zu verwenden</td></tr><tr><td>Scherankerstrang</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>vom Benutzer entwickelt Oligo</td><td>/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG CC</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-345-139</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>ultrazentrifugaler Filter, 10 kDa Cutoff</td><td>Amikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unzipping Anchor Strang</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>benutzerdefinierte Oligo</td><td>/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/</td></tr><tr><td>WDV Plasmid</td><td>AddGene</td><td>226983</td><td></td></tr><tr><td>WDV-Echistatin Plasmid</td><td>AddGene</td><td>226985</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>rekonstituiert in DMSO</td></tr></tbody></table>

durchflusszytometrische hochdurchsatzmessung des zellulären mechanotyps auf der grundlage einer ruptur und abgabe von dna-spannungssonden in die zellen

High-throughput Flow-cytometry Measurement of Cellular Mechanotype Based on Rupture and Delivery of DNA Tension Probes into Cells

Um den Nutzen und die einfache Anwendung von RAD-TGTs zu demonstrieren, analysierten wir die Auswirkungen von Rho-Kinase (ROCK)-Inhibitoren auf den Mechanotyp von CHO-K1-Zellen. Der ROCK-Signalweg ist an der Organisation des Aktins und der Myosinaktivierung beteiligt. Frühere Studien mit TGTs haben gezeigt, dass die ROCK-Hemmung den Bruch von Scher-TGTs verringert 16,17,18. Scher- oder Hochkraft-TGTs berichten über kontraktile K...

Durchflusszytometrische Hochdurchsatzmessung des zellulären Mechanotyps auf der Grundlage einer Ruptur und Abgabe von DNA-Spannungssonden in die Zellen

Mechanical forces guide many critical cellular processes, and cellular mechanical phenotype, or mechanotype, is disrupted in many diseases. The most ...

high-throughput-flow-cytometry-measurement-cellular-mechanotype-based

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Das Video demonstriert eine Methode zur Bewertung von Rezeptorkräften, die von Immunzellen mit Polyethylenglykol-verankerten Goldnanopartikeln und DNA-Haarnadel-Zugsonden angewendet werden. CD8-positive T-Zell-Wechselwirkungen lösen die Entfaltung der Sonde aus und emittieren Fluoreszenz, während Verriegelungsstränge das Signal zur Quantifizierung der von Immunzellen ausgeübten Kräfte aufrechterhalten.

Verwendung von DNA-basierten Zugsonden zur Bewertung der von Immunzellen ausgeübten Rezeptorkräfte

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluoreszenz Komplementation bietet einen hohen Durchsatz quantitative Methode zur Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Diese Methode kann zur Zuordnung Proteinbindungsstellen und zum Screening von Faktoren, die Protein-Protein-Interaktion reguliert angewendet werden.

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Wir zeigen eine Mikrofluidik-basierten Assay, um die Zeitskala für Zellen für den Transit durch eine Sequenz von Mikrometermaßstab Verengungen zu messen.

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Mikropipette-Methode, um eine kontrollierte Kraft direkt in den Zellkern in einer lebenden Zelle anwenden. Dieser Test ermöglicht Verhör der nuklearen mechanischen Eigenschaften in der lebendigen, anhaftende Zelle.

Eine direkte Kraft-Sonde zur Messung der mechanischen Integration zwischen dem Kern und dem Zytoskelett

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer-basierte Spannung Sensoren zur Messung der Belastung und Fluoreszenz Proteingewinnung nach Immunofluoreszenz Proteindynamik ermöglichen die Messung der Kraft-und Kleinschreibung messen Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen.

Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

Die vorgestellte Methode kombiniert die quantitative Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusverteilung und Apoptose, um eine zellzyklusspezifische Auswertung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers zu ermöglichen.

Zellzyklusspezifische Messung von H2AX und Apoptose nach genotoxischem Stress durch Durchflusszytometrie

Mechanische Kräfte sind wichtig für die Steuerung der Zellmigration. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von elastischen Hydrogelen, die mit einer Glasmikropipette und einem Mikromanipulator verformt werden können, um Zellen mit einem lokalen Steifigkeitsgradienten zu stimulieren, um Veränderungen in der Zellstruktur und Migration hervorzurufen.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Hier stellen wir ein Protokoll für Mikrostrukturzellen mit Einzelzellauflösung unter Verwendung von DNA-programmierter Adhäsion vor. Dieses Protokoll verwendet eine Benchtop-Photolithographie-Plattform, um Muster von DNA-Oligonukleotiden auf einem Glasobjektträger zu erzeugen und dann Zellmembranen mit kommerziell erhältlichen komplementären Oligonukleotiden zu markieren. Die Hybridisierung der Oligos führt zu einer programmierten Zelladhäsion.

Einfache, erschwingliche und modulare Musterung von Zellen mit DNA

In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von DNA-basierten Spannungssonden beschrieben, um die von Immunzellen ausgeübten Rezeptorkräfte abzubilden. Dieser Ansatz kann Rezeptorkräfte &gt;4,7 pN in Echtzeit abbilden und Kräfte über die Zeit integrieren.

DNA-Spannungssonden zur Kartierung der transienten Piconewton-Rezeptor-Kräfte durch Immunzellen

Das vorliegende Protokoll bietet eine praktische Lösung, die die Messung von Apoptose, mitochondrialem Membranpotenzial und DNA-Schäden in menschlichen Spermien mit einem einzigen Zytometer ermöglicht.

Durchflusszytometrische Analyse von Biomarkern zum Nachweis von Funktionsdefekten menschlicher Spermien

Hier wird eine Methode zur mechanischen Phänotypisierung einzelner Zellen unter Verwendung einer elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform namens Mechano-Node-Pore Sensing (Mechano-NPS) vorgestellt. Diese Plattform hält einen moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s aufrecht und misst gleichzeitig die elastischen und viskosen biophysikalischen Eigenschaften der Zellen.

Mechano-Node-Pore Sensing: Eine schnelle, markierungsfreie Plattform für viskoelastische Multiparameter-Einzelzellmessungen

Erfahren Sie eine Hochdurchsatzmethode zur Messung zellulärer Zugkräfte mittels Durchflusszytometrie. Diese Technik nutzt DNA-Spannungssonden zur Mechanophenotypisierung und eröffnet neue Ansätze für die Mechanotherapie.

Durchflusszytometrische Hochdurchsatzmessung des zellulären Mechanotyps auf der Grundlage einer Ruptur und Abgabe von DNA-Spannungssonden in die Zellen (Video) | JoVE Journal

Durchflusszytometrische Hochdurchsatzmessung des zellulären Mechanotyps auf der Grundlage einer Ruptur und Abgabe von DNA-Spannungssonden in die Zellen

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