Durchflusszytometrische Hochdurchsatzmessung des zellulären Mechanotyps auf der Grundlage einer Ruptur und Abgabe von DNA-Spannungssonden in die Zellen

Unser Labor untersucht im Allgemeinen molekulare Mechanismen, die Zellen nutzen, um mechanische Reize zu übertragen. In jüngster Zeit haben wir Hochdurchsatzmethoden entwickelt, um die Kräfte zu messen, die Zellen auf ihre Umgebung ausüben, um die Mechanobiologie in die Omics-Ära zu bringen. Studien deuten darauf hin, dass mechanische Kräfte daran beteiligt sind, wie T-Zellen durch das richtige Antigen aktiviert werden und wie sich Stammzellen in spezialisierte Zelltypen differenzieren.

In jüngster Zeit hat die Ausrichtung auf Prozesse, die der dysregulierten Zellmechanik zugrunde liegen, zur Entwicklung von Mechanotherapeutika als Mittel zur Behandlung von Krankheiten geführt. DNA-Duplex- und Haarnadelsensoren messen extrazelluläre Kräfte, während genetisch kodierte Sensoren intrazelluläre Messungen ermöglichen. Fast alle benötigen High-End-Mikroskope.

Mit der Zugkraftmikroskopie kann die Kraft gemessen werden, die die Zellen auf ihre Umgebung ausüben, aber auch hier ist eine hochauflösende Bildgebung erforderlich. In dieser Arbeit befassen wir uns mit drei Herausforderungen in diesem Feld: erstens die Verwendung von Durchflusszytometrie zur Kraftmessung anstelle von Bildgebung, zweitens die Verwendung der HOH-Tag-Technologie zur Befestigung von Liganden und Antikörpern an DNA-Sonden und drittens die Verwendung von Standard-Zellkulturplatten ohne spezielle Oberflächenbehandlungen. Wie können Veränderungen zellerzeugter Kräfte als prognostischer Marker für den Krankheitszustand genutzt werden, und tragen diese Kräfte dazu bei oder sind sie ein sekundärer Effekt des Krankheitszustands?

Zu Beginn assemblieren Sie Duplexe in einem Verhältnis von 1,1 zu einem molaren Verhältnis von Ankerstrang mit Quencher zu Ligandenstrang mit Fluorophor. Bereiten Sie die Duplexe in einer Endkonzentration von 40 mikromolaren Ligandensträngen in der Lösung vor. Zum Glühen der zusammengesetzten Doppelhäuser inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 98 Grad Celsius.

Lassen Sie die Mischung dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur abkühlen, ohne Licht zu erhalten. Reagieren Sie die geglühten Duplexe mit HUH unter Verwendung der Konzentration des am wenigsten häufigen Strangs aus dem Annealing-Schritt, der in diesem Fall der Ligandenstrang ist. Mischen Sie die Duplexe mit HUH in einem Verhältnis von ein bis zwei molaren Molekülen bei einer Endkonzentration von 10 mikromolaren Duplex und 20 mikromolaren HUH.

Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten in einem Thermocycler oder einem lichtgeschützten Wärmeblock. Entfernen Sie nach der Inkubation die Reaktion vom Erhitzen und verwenden Sie eine Tisch-Minizentrifuge, um die jetzt zusammengebauten Zugspannungsmessgurte (TGTs) herunterzudrehen. Wenn die TGTs ausreichend haften, waschen Sie die Vertiefungen mit den gewünschten Zellen dreimal mit PBS.

Führen Sie anschließend zwei Wäschen mit serumfreien Medien durch und lassen Sie das Medium nach der letzten Wäsche in den Vertiefungen. Geben Sie 200 Mikroliter PBS in die peripheren Vertiefungen, um Randeffekte zu mildern. Übertragen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um die Platte vorzuwärmen.

Rufen Sie dann die interessierenden Zellen mit einer Konfluenz von etwa 80 % ab. Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie dann die Zellen mit PBS und inkubieren Sie die Zellen mit Trypsin bei 37 Grad Celsius, bis die Zellen dissoziieren, was etwa fünf bis 10 Minuten dauert. Sobald die Zellen dissoziiert sind, fügen Sie das ursprüngliche Volumen des vollständigen Zellmediums hinzu, das zur Erhaltung der Zellen verwendet wurde.

Resuspendieren Sie die Zellen mit einer serologischen Pipette und überführen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Die Zellen werden vier Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Saugen Sie das Medium an und resuspendieren Sie das Pellet in PBS.

Nach Wiederholung der Zentrifugation die Zellen in fünf Millilitern serumfreiem Medium resuspendieren und erneut zentrifugieren. Aspirieren und resuspendieren Sie die Zellen in etwa zwei Millilitern serumfreiem Medium. Bestimmen Sie die Dichte der resuspendierten Zellen, um die Konzentration wie gewünscht einzustellen.

Wenn Arzneimittelwirkungen getestet werden, fügen Sie optional die entsprechende Konzentration des Arzneimittels zu den Zellen hinzu und bringen Sie die Zellen für die Vorinkubationszeit in den Inkubator zurück, bevor Sie fortfahren. Nehmen Sie nun die Originalplatte aus dem Inkubator und entfernen Sie die Medienreste, die von der Wäsche in den Versuchsvertiefungen übrig geblieben sind. Waschen Sie die Wells einmal mit dem gewünschten Medium und pipettieren Sie 100 Mikroliter der resuspendierten Zellen in die gewünschten Wells.

Bringen Sie die plattierten Zellen für 90 Minuten in den Inkubator. Entnehmen Sie nach der Inkubation etwa 125 bis 170 Mikroliter Volumen aus jeder Vertiefung. Waschen Sie die Zellen bei Bedarf schonend mit 200 Mikrolitern erwärmtem PBS.

Inkubieren Sie dann die Zellen in jeder Vertiefung mit 50 Mikrolitern Trypsin, bis die Zellen zu dissoziieren beginnen, was etwa fünf bis 10 Minuten dauert. Geben Sie anschließend 160 Mikroliter frisch zubereiteten Fließpuffer in jede Vertiefung. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen zu dissoziieren.

Übertragen Sie 196 Mikroliter dieser Zellsuspension in PCR-Röhrchen, fügen Sie vier Mikroliter Propidiumiodid hinzu und mischen Sie vorsichtig. Legen Sie die Röhrchen abschließend in einen Eiskübel mit einem Deckel, der jegliches Licht blockiert, und messen Sie die Fluoreszenzintensität mit einem Durchflusszytometer. Das Durchflusszytometrie-Gating bestätigte die erfolgreiche Isolierung lebender Einzelzellen und gewährleistete eine genaue Mechanotypanalyse.

Ein negatives Kontroll-Gating, das auf das 99. Perzentil der Cy5-A-Fluoreszenz eingestellt wurde, lieferte eine Ausgangsbasis für den Vergleich der experimentellen Bedingungen. CHO-K1-Zellen, die mit Y27632 behandelt wurden, zeigten eine signifikante Abnahme des Prozentsatzes der Zellen, die das negative Kontrollgate bei Scher-TGTs überschritten, während das Entpacken von TGTs nur eine bescheidene und statistisch nicht signifikante Abnahme aufwies. Das Entpacken von TGTs führte durchweg zu einem höheren Prozentsatz von Zellen, die die Negativkontrolle überschritten, verglichen mit Scher-TGTs, was ihren geringeren Kraftbedarf bestätigt.