Name: Generierung von Primärkulturen für die Bildgebung lebender Keratinozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Lernen Sie die Kultur frisch isolierter Keratinozyten (Passage 0) für die Bildgebung lebender Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht Echtzeitbeobachtung dynamischer Zellprozesse in vitro.

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<ol><li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes%3A+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> Int J Mol Med. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li>
<li>Handl, J., Čapek, J., Majtnerová, P., Báčová, J., Roušar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+repeated+passaging+on+the+susceptibility+of+human+proximal+tubular+HK-2+cells+to+toxic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Phy+Res+Aca+Sci+Boh%22%5BJournal%5D)">The effect of repeated passaging on the susceptibility of human proximal tubular HK-2 cells to toxic compounds.</a> Phy Res Aca Sci Boh. 69 (4), 731-738 (2020).</li>
<li>Xiao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+cell+cycle+duration+is+a+phenotype+of+human+epidermal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+The%22%5BJournal%5D)">Short cell cycle duration is a phenotype of human epidermal stem cells.</a> Stem Cell Res The. 15 (1), 76(2024).</li>
<li>Noujarède, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipid+paracrine+signaling+impairs+keratinocyte+adhesion+to+promote+melanoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Sphingolipid paracrine signaling impairs keratinocyte adhesion to promote melanoma invasion.</a> Cell Rep. 42 (12), 113586(2023).</li>
<li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image-based+dynamic+high-throughput+analysis+of+adherent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-prol%22%5BJournal%5D)">An image-based dynamic high-throughput analysis of adherent cell migration.</a> Bio-prol. 11 (6), e3957(2021).</li>
<li>Chapman, S., McDermott, D. H., Shen, K., Jang, M. K., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Rho+kinase+inhibition+on+long-term+keratinocyte+proliferation+is+rapid+and+conditional%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+The%22%5BJournal%5D)">The effect of Rho kinase inhibition on long-term keratinocyte proliferation is rapid and conditional.</a> Stem Cell Res The. 5 (2), 60(2014).</li>
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<li>Poumay, Y., Roland, I. H., Leclercq-Smekens, M., Leloup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+detachment+of+the+epidermis+using+dispase%3A+tissue+spatial+organization+and+fate+of+integrin+alpha+6+beta+4+and+hemidesmosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inv+Der%22%5BJournal%5D)">Basal detachment of the epidermis using dispase: tissue spatial organization and fate of integrin alpha 6 beta 4 and hemidesmosomes.</a> J Inv Der. 102 (1), 111-117 (1994).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22CellTra%22%5BJournal%5D)">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> CellTra. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Rheinwald, J. G., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+cultivation+of+strains+of+human+epidermal+keratinocytes%3A+the+formation+of+keratinizing+colonies+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells.</a> Cell. 6 (3), 331-343 (1975).</li>
<li>Boisseau, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+epidermal+sheets+in+a+serum+free+culture+system%3A+a+further+appraisal+of+the+role+of+extracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Der+Sci%22%5BJournal%5D)">Production of epidermal sheets in a serum free culture system: a further appraisal of the role of extracellular calcium.</a> J Der Sci. 3 (2), 111-120 (1992).</li>
<li>Roshan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+have+two+interconvertible+modes+of+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes have two interconvertible modes of proliferation.</a> Nat Cell Bio. 18 (2), 145-156 (2016).</li>
<li>Nanba, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR-mediated+epidermal+stem+cell+motility+drives+skin+regeneration+through+COL17A1+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">EGFR-mediated epidermal stem cell motility drives skin regeneration through COL17A1 proteolysis.</a> J Cell Bio. 220 (11), e202012073(2021).</li>
<li>Ścieżyńska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Der%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Der. 28 (2), 107-112 (2019).</li>
<li>Guo, A., Jahoda, C. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+human+keratinocyte+culture+from+skin+explants%3A+cell+expansion+is+linked+to+markers+of+activated+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Derm%22%5BJournal%5D)">An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells.</a> Exp Derm. 18 (8), 720-726 (2009).</li>
<li>Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+enzymatic+and+explant+methods+for+the+culture+of+keratinocytes+isolated+from+human+foreskin%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin.</a> Bio Rep. 3 (3), 304-308 (2015).</li>
<li>Usta, S. N., Scharer, C. D., Xu, J., Frey, T. K., Nash, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+serum-free+and+xeno-free+media+for+multiple+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+of+tra+med%22%5BJournal%5D)">Chemically defined serum-free and xeno-free media for multiple cell lineages.</a> Ann of tra med. 2 (10), 97(2014).</li>
<li>Lenihan, C., Rogers, C., Metcalfe, A. D., Martin, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+isolation+and+culture+methods+on+epithelial+stem+cell+populations+and+their+progeny-toward+an+improved+cell+expansion+protocol+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Cyt%22%5BJournal%5D)">The effect of isolation and culture methods on epithelial stem cell populations and their progeny-toward an improved cell expansion protocol for clinical application.</a> Cyt. 16 (12), 1750-1759 (2014).</li>
<li>Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+grown+at+the+air-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes grown at the air-liquid interface.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 22 (12), 695-705 (1986).</li>
<li>Ponce, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+primary+keratinocytes+from+piglet+skin+for+compartmentalized+co-culture+with+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of primary keratinocytes from piglet skin for compartmentalized co-culture with dorsal root ganglion neurons.</a> J Cell Bio. 2 (2), 93-115 (2017).</li>
<li>Nygaard, U. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+in+cell+culture%3A+friend+or+foe%3F+Suppression+of+keratinocyte+growth+and+differentiation+in+monolayer+cultures+and+3D+skin+models%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Der%22%5BJournal%5D)">Antibiotics in cell culture: friend or foe? Suppression of keratinocyte growth and differentiation in monolayer cultures and 3D skin models.</a> Exp Der. 24 (12), 964-965 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA (1X), 100 mL</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>100-μm-Zellfilter</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 cc Falcon</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ccm konischer Falcon</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6-Brunnen-Mikroplatte</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>70 % Reagenz Alkohol, 4 L</td><td>VWR Chemicals</td><td>BDH1164-4LP</td><td>Alternativ können Sie Ihre eigene verdünnen</td></tr><tr><td>Amphotericin B, 50 ml</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td>Verdünnen auf 5X (50 ug/mL)</td></tr><tr><td>Dipase, 100 ml</td><td>Corning</td><td>354235</td><td>1:1 mit HBSS verdünnen, 1x Gentamycin hinzufügen, filtersterilisieren</td></tr><tr><td>Epilife, 50 mL</td><td>Gibco</td><td>MEP1500CA</td><td>Fügen Sie HKGS hinzu, ziehen Sie Antibiotika in Betracht und ziehen Sie Antibiotika in Betracht</td></tr><tr><td>Fetal Rinderserumwert Hitzeinaktivierter FBS, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>A52568-01</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Zange</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin, 10 ml</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td>Verdünne auf 50 μG/ml für 5X</td></tr><tr><td>Hanks ausgewogene Salzlösung (1X), 500 ml</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>(HBSS)</td></tr><tr><td>HBSS 5X PSAG</td><td></td><td></td><td>Das ist HBSS + 5-fache Konzentrationen von Pen/Strep/Ampho/Gent</td></tr><tr><td>Hibiclens, Gallone</td><td>Molnlycke</td><td>57591</td><td>Verdünnen Sie auf 10 % mit deionisiertem H2O</td></tr><tr><td>Humanes Keratinozytenwachstumsserum, 5 mL</td><td>Gibco</td><td>S-001-5</td><td>Epilife hinzugefügt</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin, 100 ml</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Verdünne auf 5X (kommt im 100x-Original) für 5X PSA – 1X für Medienwechsel</td></tr><tr><td>Petrischale 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge NR. 23</td><td>VWR</td><td>76457-480</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>Eine weniger ätzende Alternative zu normalem Trypsin</td></tr><tr><td>Trypsin-neutralisierende Lösung</td><td></td><td></td><td>(TNS), das ist HBSS mit 10 % FBS (manche verwenden weniger Serum, 5 %)</td></tr></tbody></table>

generierung von primärkulturen für die bildgebung lebender keratinozyten

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Generierung von Primärkulturen für die Bildgebung lebender Keratinozyten

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

generating-primary-cultures-for-keratinocyte-live-cell-imaging

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Generierung von Organotypische Floßkulturen aus primären humanen Keratinozyten

Dieses Video beschreibt die Isolierung von Keratinozyten – den prominentesten Zellen der Epidermisschicht der menschlichen Haut, indem eine Kombination aus enzymatischer Verdauung und mechanischen Aufschlussmethoden angewendet wird. Diese Methode hilft bei der bevorzugten Züchtung von Keratinozyten gegenüber anderen Hautzelltypen unter Verwendung eines selektiven Wachstumsmediums.

Keratinozytenisolierung in der menschlichen Haut: Eine Methode zur Kultivierung primärer Keratinozyten aus Hautproben

In diesem Video führen wir einen klonogenen Assay von Keratinozyten durch, die von erwachsenen Mäusen entnommen wurden, um die Fähigkeit einzelner Zellen zu bestimmen, sich zu vermehren und Kolonien zu bilden. Diese Keratinozyten-Entnahmetechnik ist nützlich für die Untersuchung anderer nachgelagerter Aspekte der kutanen chemischen Karzinogenese und der Tumorförderung.

Keratinozyten-Koloniebildungs-Assay: Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Fähigkeit von Keratinozyten, zu Kolonien zu wachsen

Dieses Manuskript bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Gewinnung und Erhaltung menschlicher Keratinozyten aus gezupftem Haar und die anschließende Erzeugung von integrationsfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) durch episomale Vektoren.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein umfassendes und detailliertes Protokoll darüber bereitzustellen, wie genetisch veränderte menschliche organotypische Haut aus epidermalen Keratinozyten und devitalisierter menschlicher Dermis erzeugt werden kann.

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Epidermale Keratinozyten bilden eine funktionelle Hautbarriere und sind an der Frontlinie der Wirtsverteidigung gegen äußere Umweltbeleidigungen positioniert. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Primärkultur von epidermalen Keratinozyten aus neonataler und erwachsener Maushaut und Induktion der terminalen Differenzierung und UVB-ausgelösten Entzündungsreaktionen von Keratinozyten.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

Die menschliche Haut wirkt als eine erste Verteidigungslinie gegen die Außenumgebung. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen. Diese isolierten Keratinozyten eignen sich zahlreiche Versuchsaufbauten und sind ein sehr geeignetes Modell für die Untersuchung der molekularer Mechanismen in kutane Biologie in-vitro-.

Generation und Kultivierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe effizient zu isolieren. Diese Methode vereinfacht das konventionelle Verfahren mithilfe der ROCK-Inhibitor Y-27632 Mittel-und Impfung spontan Epidermiszellen von dermalen Zellen zu trennen.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Ziel dieses Protokolls ist es, epidermale Keratinozyten aus der dorsalen Haut erwachsener Mäuse für eine Vielzahl nachgelagerter Anwendungen wie Molekularbiologie, Biochemie, Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und primäre In-vitro-Anwendungen (z. B. clonogene Keratinozyten).

Isolierung von Maus epidermalen Keratinozyten und ihrer In-Vitro-Clonogenen Kultur

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur systematischen Kultivierung epidermaler Sphäroide in 3D-Suspensionskultur. Dieses Protokoll hat weitreichende Anwendungen für den Einsatz in einer Vielzahl von epithelialen Gewebetypen und für die Modellierung mehrerer menschlicher Krankheiten und Zustände.

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Hier stellen wir eine Methode zur Bildgebung lebender Zellen zur Verfügung, mit der die Abstammungslinien von Keratinozyten der Passage 0 manuell verfolgt werden können und die die Erfassung von Proliferationsmetriken ermöglicht, einschließlich des Verschicksals der Zellteilung und der Zellzyklusdauer.

Live-Zell-Imaging mit Zeitrafferfotografie zur Untersuchung der Proliferationskinetik der epidermalen Keratinozyten

Lernen Sie die Kultur frisch isolierter Keratinozyten (Passage 0) für die Bildgebung lebender Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht Echtzeitbeobachtung dynamischer Zellprozesse in vitro.

Generierung von Primärkulturen für die Bildgebung lebender Keratinozyten

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