Name: Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Lernen Sie SNP-FISH zur Unterscheidung ribosomaler RNA-Transkripte aus X- und Y-Chromosom-Loci in Drosophila melanogaster. Diese Methode ermöglicht die Analyse lokusspezifischer Transkriptionsregulation.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>PTC Tempo 96 Thermocycler</td><td>Bio Rad</td><td>12015382</td><td>Jeder Thermocycler kann verwendet werden</td></tr><tr><td>0,2 mL 8 Streifen Flatcap PCR-Röhrchen</td><td>VWR</td><td>89133-912</td><td>Alle kompatiblen Röhrchen können verwendet werden</td></tr><tr><td>1 kb DNA-Leiter</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td>Zur Verwendung bei der Überprüfung der Sequenzierung PCR-Amplikongröße durch Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>1,5 mL graduierte Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>Jedes zertifizierte RNase-freie Röhrchen kann</td></tr><tr><td>2 mM dNTP Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0241</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>1610743</td><td>für die Gelelektrophorese verwenden. Es kann ein beliebiger TAE-Puffer verwendet werden.</td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td></td><td></td><td>Jedes NaCl kann aus jeder Quelle verwendet oder hergestellt werden</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>97064-250</td><td>Jedes Agarose kann verwendet werden</td></tr><tr><td>ApE - A plasmid Editor software</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ <tr><td>Klarer Nagellack</td><td></td><td></td><td>Jeder Nagellack von jedem Einzelhändler kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Deckglas, Nr. 1 Dicke</td><td>Thomas Scientific</td><td>6672A38</td><td></td></tr><tr><td>Deionisiertes Formamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9569627</td><td></td></tr><tr><td>Dextransulfat Natrium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8906-10G</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Wird zum Präparieren von Proben</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M), Ph 8,0</td> <td>verwendetThermoFisher Scientific</td><td>R1021</td><td>Jedes vergleichbare Produkt kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td>Jedes Ethanol mit 200 Proof kann verwendet werden. Wird zur Verdünnung auf 70 % Ethanol zur Permeabilisierung und Reinigung für Rnase-freie Bedingungen verwendet</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Horizontales Mini-Gelelektrophoresesystem</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-170</td><td>Jedes Gelelektrophoresesystem kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotest-Färbeschale</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71564</td><td>Wird zum Präparieren von Proben verwendet</td></tr><tr><td>Nutating Shaker</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BMSB3D1020</td><td>Jeder Nutating Shaker kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>USA Scientific</td><td>3023-4526</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10X) pH 7,4, RNase-frei</td><td>Life Technologies</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Durchstechen 16% Formaldehyd (w/v), Methanolfrei</td><td>Life Technologies</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Präzisions-Allzweck-Wasserbad</td><td>Life Technologies</td><td>TSGP02</td><td>Jedes Wasserbad kann verwendet werden</td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Jedes Gel-Extraktionskit kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Rekombinante Proteinase K-Lösung (20 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2546</td><td>Jedes vergleichbare Produkt kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Rnase-frei UltraPure BSA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2618</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae tRNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8759</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X), RNase-frei</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Life Technologies</td><td>A16046.AE</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 1M Tris-HCl Puffer, pH 7,5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td><td>Jedes vergleichbare Produkt kann verwendet werden</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled</td><td>Water Life Technologies</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Vanadyl-Ribonukleosid-Komplex</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Einbettmedien mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>VWR Superfrost Mikroskop Objektträger</td><td>VWR</td><td>48311-601</td><td></td></tr><tr><td>y[1]w[1] Drosophila melanogaster Linie</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>1495</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980 Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss Mikroskopie</td><td></td><td>Jedes konfokale Mikroskop mit kompatibler Emission und Detektion kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000-C Stereomikroskop und Lichtquelle</td><td>Mikroskop Zentrales</td><td>455053</td><td>Jedes Stereomikroskop kann verwendet werden</td></tr></tbody></table>

einzelnukleotid-polymorphismus-sensitiver fish-nachweis der lokusspezifischen ribosomalen rna-transkription in drosophila melanogaster

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

Es wird erwartet, dass die Sequenzierungsergebnisse der SNP-Genotypisierung SNP-Unterschiede zwischen den X- und Y-rDNA-Loci aufdecken. Diese SNPs werden durch direkte Beurteilung der SNP-Positionen in Sequenzierungschromatogrammen nachgewiesen (Abbildung 2). Es wird erwartet, dass die Sequenzierung weiblicher Proben ein einzelnes Sequenzierungssignal an der SNP-Position aufweist, was auf eine SNP-Homozygotie zwischen den beiden X-Chromosomen hinweist (Abbildung 2A). Es wird erwartet, dass die Ergebnisse der Sequenzierung männlicher Proben einen doppelten Peak an der SNP-Position aufweisen (Abbildung 2B). Basierend auf dem X-Chromosomen-Genotyp, der durch die Sequenzierung weiblicher Proben bestimmt wurde, wird die Nicht-X-Variante als Y-Chromosomen-rDNA-SNP abgeleitet (d. h. X = T, Y = C für die 18S-SNP-Sequenzierung in Abbildung 2). Alternativ würde ein einzelner Sequenzierungspeak an einer SNP-Position in der männlichen Probe auf eine Homozygotie zwischen männlichen und weiblichen rDNA-Loci an dieser SNP-Position hinweisen, und diese Position wäre für rRNA SNP-FISH nicht verwendbar.
Gemäß dem Protokoll für SNP FISH können die Proben visualisiert werden, indem sie auf Objektträger montiert und unter ein versiegeltes Deckglas gelegt werden, gefolgt von einer konfokalen Mikroskopie. Unter Verwendung der in Tabelle 3 aufgeführten Sonden wird das Y-abgeleitete rRNA-Signal durch Alexa Fluor 647-Emission und das X-abgeleitete rRNA-Signal durch Alexa Fluor 488-Emission nachgewiesen. Es wird erwartet, dass rRNA-Signale im Nukleolus beobachtet werden, der als das DAPI-arme Loch im Zellkern identifiziert werden kann (Abbildung 3A). Der Nukleolus ist in Keimzellen aufgrund seines großen Zellkerns und Nukleolus besonders leicht zu identifizieren (Abbildung 3A). Das schwache Signal ist typischerweise auch im Zytoplasma zu finden (Abbildung 3), aber es handelt sich um ein unspezifisches Signal, das auch in Proben ohne rRNA nachgewiesen werden kann, die eine komplementäre SNP enthalten (d. h. Y-Signal in Zellen ohne Y-rDNA oder X-Signal in Zellen ohne X-rDNA; Abbildung 3B-C). Darüber hinaus kann die künstliche Co-Markierung von X- und Y-rRNA manchmal im somatischen Zentrum nachgewiesen werden, selbst in Proben, denen entweder X- oder Y-rDNA-Loci fehlen (Abbildung 3B-C, gelbe Pfeile). Daher sollten nur nukleäre Signale verwendet werden, um die Locus-spezifische Transkription zu beurteilen. Es wird erwartet, dass die meisten Zellen, insbesondere somatische Zellen, nur ein Y-rRNA-Signal haben, was darauf hindeutet, dass rRNA ausschließlich aus dem Y-rDNA-Locus transkribiert wird (Abbildung 3A, gelber gestrichelter Kreis und roter Pfeil)10,17. Die Koexpression von X- und Y-rRNA wird jedoch häufig in Keimzellen nachgewiesen, insbesondere in Keimbahnstammzellen13 (Abbildung 3A, weiß gestrichelte Kreise). X- und Y-rRNA-Signale in co-exprimierenden Zellen können benachbart sein und einen einzelnen Nukleolus bilden (Abbildung 3A obere Zelle) oder getrennt sein und zwei Nukleolen bilden (Abbildung 3A untere Zelle). Die Beispiele in Abbildung 3 sind von rDNA SNP-FISH unter Verwendung von Sondensätzen, die auf nur zwei SNPs (die beiden ITS1-SNPs) abzielen, und zeigen, dass nur zwei SNPs für rDNA SNP-FISH erforderlich sind. Robustere Signale werden jedoch beobachtet, wenn Sonden verwendet werden, die auf alle vier SNPsabzielen 13.
Negativkontrollen sind eine wichtige Ergänzung für diesen Assay, um zu bestätigen, dass Sonden nicht mit dem falschen SNP-Ziel kreuzreagieren, insbesondere bei der ersten Fehlerbehebung der Methode. Zu den Negativkontrollen des X-Chromosoms gehören alle Erkrankungen, bei denen die rDNA des X-Chromosoms fehlt, wie z. B. Männer, die ein X-Chromosom mit einer rDNA-Deletion besitzen. Es wird erwartet, dass die X-Chromosomen-Negativkontrollen nur das Y-rRNA-Signal und keine X-rRNA nachweisen (Abbildung 3B). Zu den Negativkontrollen des Y-Chromosoms gehören alle Erkrankungen, bei denen die rDNA des Y-Chromosoms fehlt. Einige Beispiele für diese Erkrankungen sind XX weibliche Gewebe, Gewebe von Männern, denen ein Y-Chromosom fehlt, oder Männer, die ein Y-Chromosom mit einer rDNA-Deletionbesitzen 15. Es wird erwartet, dass die Y-Chromosomen-Negativkontrollen nur das X-rRNA-Signal und kein nachweisbares Y-rRNA-Signal nachweisen (Abbildung 3C). Beachten Sie, dass diese Kontrollen nicht nur wichtig sind, um die Sondenspezifität zu bestimmen, sondern auch um Signalhintergründe oder Artefakte zu bestimmen. Alle neuartigen Sonden oder Assay-Bedingungen, die Spezifität in solchen Kontrollen gewährleisten, können genau zum Nachweis der locusspezifischen rDNA-Transkription verwendet werden.
Unterschiedliche genetische, Entwicklungs- oder Umweltbedingungen können die Wahrscheinlichkeit verändern, dass rDNA ausschließlich aus dem Y-Chromosomen-rDNA-Locus13,17 transkribiert wird. Die Häufigkeit der rDNA-Transkription von einem einzelnen Locus oder mehreren Loci kann quantifiziert und direkt zwischen den Proben verglichen werden. Um Unterschiede in der Transkription des rDNA-Locus quantitativ vergleichen zu können, muss jede Zelle individuell als Y-dominant, Co-dominant oder X-dominant kategorisiert werden. Zellen werden nur dann als Y- und X-dominant kategorisiert, wenn nur das jeweilige Signal detektiert wird. Jede Zelle, die sowohl Y- als auch X-rRNA-Signale aufweist, gilt als co-dominant, auch wenn ein Signal viel schwächer ist als das andere. So werden Zellen, die sehr starke X- und Y-Signale enthalten, qualitativ genauso angesehen wie Zellen mit starken Y- und schwachen X-Signalen oder starken X- und schwachen Y-Signalen. Der Gesamtprozentsatz aller Zellen über alle Stichproben in jeder Kategorie hinweg kann zwischen den Stichproben durch einen Chi-Quadrat-Test verglichen werden. Während dieser Assay gut funktioniert, um qualitativ zu bestimmen, ob ein bestimmter rDNA-Locus transkribiert wird oder nicht, haben wir bei der direkten Quantifizierung der Fluoreszenzintensität einzelner SNP-FISH-Signale keine konsistenten Auswertungen zwischen den Proben beobachtet. Daher empfehlen wir nicht, die Intensität des FISH-Signals zwischen den Proben oder die relative Intensität der X- und Y-rDNA-Signale innerhalb einer einzelnen Zelle quantitativ zu bewerten. Die Ursache für diese Inkonsistenz in der Fluoreszenzintensität ist unklar, obwohl sie auf die ineffiziente Bindung von maskierten Sonden zurückzuführen sein könnte, die nicht an alle Ziel-rRNAs binden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Diagramm der SNP-FISH-Methode. (A) Herkömmliche FISH-Antisense-Oligonukleotidsonden kreuzreagieren mit Nicht-Ziel-RNAs, die sich nur durch ein Nukleotid unterscheiden. (B) Bei der SNP-FISH-Methode wird ein komplementäres Masken-Oligonukleotid verwendet, das an die 3'-Region der Oligonukleotidsonde gebunden ist. Die Maske lässt nur 10 Nukleotide frei, die an die Zielsequenz binden können. Ein unmaskierter Sondenbereich bindet nicht stabil an Nicht-Zielsequenzen, die sich durch ein oder mehrere Nukleotide unterscheiden. Die Maske wird von der Sonde dissoziiert, nachdem die Sonde an das Ziel gebunden wurde, was eine stabile Bindung zwischen Sonde und Ziel ermöglicht. (C) Unterschiedlich markierte gepaarte SNP-Sonden in Kombination mit einer gemeinsamen Maske binden spezifisch Ziele, die sich durch ein einzelnes Nukleotid unterscheiden, ohne zu kreuzreagieren. (D) Mehrere Sonden können miteinander gepoolt werden, um spezifische rRNA-Haplotypen zu markieren. Vier SNP-Unterschiede wurden zwischen X- und Y-rDNA-Loci im y1w1 Drosophila melanogaster-Stamm charakterisiert. Ein SNP in der 18S rRNA, einer in der 28S rRNA und zwei im ITS1-Teil der prä-rRNA. X- und Y-spezifische rRNA-Haplotypen, die für SNP-FISH verwendet werden, werden angezeigt. Sonden, die auf die X-rDNA-Variante an den vier rRNA-SNPs abzielen, sind an ein gemeinsames Fluorophor (grün) konjugiert, und Sonden, die auf die Y-rDNA-Varianten abzielen, sind an ein anderes Fluorophor (magenta) konjugiert. Für jeden SNP wird eine gemeinsame Maske verwendet (insgesamt vier). Die SNP-spezifische Sondenbindung an jeder SNP-Position auf der rRNA kann rRNA aus den X- und Y-rDNA-Loci mit bis zu vier FISH-Oligonukleotidsonden spezifisch markieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Beispiele für homozygote und heterozygote rDNA-SNP-Sequenzierungsergebnisse. Beispiel: Sequenzierung von Chromatogrammen aus 18S SNP-Sequenzierung von DNA aus (A) weiblichen und (B) männlichen Proben. 18S SNP-Position, gekennzeichnet durch ein Sternchen (*). Das einzelne Thymin (T)-Signal für die SNP-Position in der weiblichen Probe deutet auf einen Thymin an der SNP-Position im rDNA-Locus des X-Chromosoms hin. Das Doppelsignal an der SNP-Position, aufgeteilt zwischen Thymin und Cytosin (C) in der männlichen Probe, deutet auf ein Cytosin an der SNP-Position im rDNA-Locus des Y-Chromosoms hin (abgeleitet aus dem Wissen, dass sich Thymin am X-Chromosomen-Locus befindet). Die Sequenzierungsergebnisse wurden mit ApE – einer Plasmid-Editor-Software19 – betrachtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Beispiele für SNP-FISH-Ergebnisse im Drosophila-Hoden mit nur zwei SNP-FISH-Sondensets. SNP FISH-Beispiele in den Hoden von Tieren mit (A) sowohl X- als auch Y-rDNA, (B) nur Y-rDNA oder (C) nur X-rDNA. In diesen Beispielen wurden nur Sondensätze verwendet, die die beiden ITS1 rRNA-SNPs markierten, was zeigt, dass rRNA SNP FISH mit nur zwei Ziel-SNPs arbeitet. Keimzellen werden durch ihren großen runden Kern und somatische Zellen durch ihren kleineren und weniger runden Kern identifiziert. Keimbahnstammzellen sind an ihrer Position direkt neben der somatischen Nabe zu erkennen, die mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet ist. Keimzellen, die rDNA sowohl aus den X- als auch aus den Y-rDNA-Loci transkribieren, werden sowohl durch X- als auch durch Y-Kern-FISH-Signale identifiziert (weiße gepunktete Kreise, A-A''). Keimzellen, die DNA nur aus dem Y-rDNA-Locus transkribieren, haben nur ein Y-nukleäres FISH-Signal (gelber gestrichelter Kreis). Nur Y-exprimierende somatische Zellen sind mit einem roten Pfeil gekennzeichnet. Die künstliche Co-Markierung von X- und Y-rDNA-Loci ist in der somatischen Nabe (gelber Pfeil) zu beobachten. Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Datei 1: rRNA-Sequenz des X-Chromosomen-Locus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/Dm_45S_rRNA.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

single-nucleotide-polymorphism-sensitive-fish-detection-locus

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Wir beschreiben eine robuste und vielseitige Protokoll zur Analyse von 3D-Kern Architektur DNA FISH mit direkt markierten fluoreszierenden Sonden.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

PCR in Kombination mit hochauflösenden Schmelzanalyse (HRMA) als schnelle und effiziente Methode, um Zebrafisch-Genotyp nachgewiesen.

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Das Ziel dieser Publikation ist es, sichtbar zu machen und zu diskutieren, die operativen Schritte einer Enhanced Northern Blot-Protokoll auf RNA aus Drosophila melanogaster Embryonen entnommen, Zellen und Geweben. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für eine effiziente Erkennung von kleinen RNA-Spezies.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in Drosophila melanogaster

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) ist in der Lage, die zelltypspezifische Translation von mRNA zu erfassen. Hier berichten wir über das erste TRAP-Protokoll, das sich der Isolierung von mRNA in seltenen Zellpopulationen von Drosophila-Embryonen widmet.

TRAP-rc, Translating Ribosom Affinitätsreinigung von Rare Zellpopulationen<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung, Detektion, Analyse und Verfolgung des endogenen mRNA-Handels in der lebenden Drosophila melanogaster Eikammer mit molekularen Baken, Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie und Open-Source-Analyse vor. software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Die Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) ist eine Methode zur genauen Quantifizierung der Konzentrationen und Lokalisierung spezifischer RNAs auf Einzelzellebene. Hier berichten wir über unsere validierten Laborprotokolle für die Nasstischverarbeitung, Bildgebung und Bildanalyse zur Einzelzellquantifizierung spezifischer RNAs.

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Hier stellen wir ein vereinfachtes endogenes Gen-Tagging-Protokoll für Drosophila vor, das eine PCR-basierte Technik zur markerfreien Identifizierung erfolgreicher genetischer Veränderungen verwendet und die Entwicklung stabiler Knock-in-Linien erleichtert.

Einstufige CRISPR-basierte Strategie zur endogenen Genmarkierung in Drosophila melanogaster

Drosophila ist ein etabliertes Modell für die Untersuchung von Schlüsselmolekülen, die die Myogenese regulieren. Derzeitige Methoden reichen jedoch nicht aus, um die Dynamik der mRNA-Transkription und die räumliche Verteilung innerhalb der Synzytien zu bestimmen. Um diese Einschränkung zu beheben, haben wir eine RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode optimiert, die den Nachweis und die Quantifizierung von mRNAs auf Einzelmolekülebene ermöglicht.

Untersuchung der Transkriptionsdynamik von Muskeln auf Einzelmolekülskalen in Drosophila

Expansion-Assisted Itercence In Situ Hybridization (EASI-FISH) ist eine robuste Technik, die Expansionsmikroskopie mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert, um die Expression mehrerer Gene in dickem Gewebe nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt die jüngsten Fortschritte in der Methode und ihre Anpassung an die Markierung des intakten Drosophila-Zentralnervensystems.

Multiplex-Detektion der Genexpression im intakten Drosophila-Gehirn mittels expansionsunterstützter iterativer Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Lernen Sie SNP-FISH zur Unterscheidung ribosomaler RNA-Transkripte aus X- und Y-Chromosom-Loci in Drosophila melanogaster. Diese Methode ermöglicht die Analyse lokusspezifischer Transkriptionsregulation.

Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal

Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster

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