Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster

Unsere Forschung konzentriert sich darauf, zu verstehen, wie Zellen die multiplen ribosomalen DNA-Loci in ihrem Genom wahrnehmen, überwachen und regulieren. Konkret wollen wir die Mechanismen aufdecken, die unterscheiden, welche rDNA-Loci aktiv transkribiert werden und wie diese Loci individuell reguliert werden. Wir haben kürzlich herausgefunden, dass sich die Menge an rDNA in einer Zelle im Laufe der Zeit ändern kann und dass diese Änderung die rDNA-Loci beeinflusst, die transkribiert werden.

Wir wissen jetzt, dass Zellen ihre rDNA-Transkription basierend auf der Menge an rDNA, die sie haben, verändern. Diese Entdeckung führt uns zu der Frage, woher Zellen wissen, wie viel RDA sie haben und wie sie bestimmen, welchen rDNA-Locus sie bevorzugt exprimieren. Unser Labor konzentriert sich nun darauf, den Mechanismus zu verstehen, den Zellen nutzen, um zwischen verschiedenen rDNA-Loci zu unterscheiden und ihre Aktivität zu spüren und zu regulieren.

Präparieren Sie Drosophila unter einem Stereomikroskop, um Hoden in RNase-freiem PBS zu isolieren. Fassen Sie zunächst mit einer Pinzette die Mitte des Bauches und mit einem anderen Paar das Ende des Bauches, um das Tier vorsichtig auseinander zu ziehen. Übertragen Sie die isolierten Hoden mit einer Pinzette aus der Präparierschale in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen, das 0,5 Milliliter RNase-freies PBS enthält.

Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie einen Milliliter Fixierlösung hinzu. Legen Sie die Probe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Nutenschüttler. Nach der Inkubation die Fixierlösung aspirieren.

Waschen Sie die Probe dann zweimal mit einem Milliliter PBS für jeweils fünf Minuten auf einem Nutationsschüttler. Nach dem Aspirieren des PBS fügen Sie einen Milliliter RNase-freies 70%iges Ethanol hinzu und inkubieren die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Nutationsschüttler. Als nächstes aspirieren Sie das Ethanol und fügen der Probe einen Milliliter Waschpuffer hinzu.

Die Probe wird drei Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Nutationsschüttler inkubiert. Lassen Sie die Röhre danach zwei Minuten aufrecht stehen. Mischen Sie die Sonden und Masken mit dem Hybridisierungspuffer, um ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern pro Probe herzustellen, wie hier gezeigt.

Geben Sie dann 100 Mikroliter Hybridisierungslösung in die Probe, nachdem Sie den Waschpuffer aspiriert haben. Tragen Sie eine transparente Folie auf, um die Ränder der Tube zu versiegeln. Wickeln Sie das Röhrchen in Alufolie ein, um es vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie die Probe mindestens 24 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Ohne die Hybridisierungslösung zu aspirieren, geben Sie einen Milliliter Waschpuffer in die Probe. Inkubieren Sie die Probe in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 30 Minuten im Dunkeln. Sobald der Waschpuffer aspiriert ist, geben Sie einen Milliliter frischen Waschpuffer in die Probe und inkubieren Sie erneut.

Am Ende der Inkubation aspirieren Sie den Waschpuffer und geben Sie 50 Mikroliter Eindeckmedium in die Probe. Verwenden Sie unter einem Präparierstereomikroskop eine Pipette, um die Probe auf einen Objektträger zu übertragen. Ordnen Sie die Hoden mit einer Pinzette in einer Linie auf dem Objektträger an, um die Probenidentifikation während der Bildgebung zu erleichtern.

Decken Sie die Probe mit einem Deckglas ab und tupfen Sie die Ränder des Deckglases mit einem Taschentuch ab, um überschüssige Eindeckmedien zu entfernen. Versiegeln Sie die Ränder des Deckblatts mit Nagellack und lassen Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln liegen, damit der Nagellack trocknen kann. rRNA-Signale wurden im Nukleolus nachgewiesen und traten als DAPI-Porenregionen im Zellkern auf, insbesondere in Keimzellen mit großen Zellkernen und Nukleolen.

Schwache, unspezifische Signale wurden im Zytoplasma in Proben ohne rRNA-Loci beobachtet. In den meisten Zellen wurden ausschließlich YrRNA-Signale nachgewiesen, was auf eine rRNA-Transkription aus dem YrDNA-Locus hinweist. In Keimzellen wurde eine Co-Expression von X- und YrRNA beobachtet, wobei die Signale entweder zu einem einzigen Zellkern verschmelzen oder sich in zwei Nukleolen aufteilen.