Multimodale optische Bildgebungsplattform zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels
6. Juni 2025
Unter Verwendung einer multimodalen Plattform, die markierungsfreie optische Bildgebungsmodalitäten kombiniert, haben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik und des Stoffwechsels entwickelt. Durch Bildgebung mittels Multiphotonenfluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen und stimulierte Raman-Streumikroskopie können wir einen ganzheitlichen Überblick über die zelluläre und molekulare Umgebung erhalten.
Unsere Forschung umfasst die Nutzung unseres multimodalen Mikroskops, um molekulare und metabolische Unterschiede in verschiedenen Pathologien zu messen und ihre räumliche Heterogenität sichtbar zu machen. Der multimodale Ansatz der optischen Bildgebung ermöglicht es uns, pathophysiologische Veränderungen aus einer Vielzahl von Perspektiven zu identifizieren. Der multimodale Ansatz der optischen Mikroskopie erweitert kontinuierlich seine Anwendungen, insbesondere im klinischen Umfeld, wo die Entwicklung von Mikroendoskopen einen Weg für die klinische Bildgebung eröffnet hat.
Die aktuellen experimentellen Herausforderungen liegen in der Komplexität, die gesamte Hardware miteinander zu verbinden, was einer der Gründe ist, warum wir ein maßgeschneidertes Mikroskopsystem verwenden. Durch den Einsatz unserer multimodalen optischen Bildgebungsplattform haben wir bedeutende Fortschritte bei der markierungsfreien bioorthogonalen Krankheitsforschung gemacht, einschließlich der Klassifizierung verschiedener Brustkrebs-Subtypen und der Analyse des Fettstoffwechsels in der Drosophila und im Gehirn von Mäusen. Mit unserer markierungsfreien multimodalen optischen Bildgebung sind wir in der Lage, den Stoffwechsel, die Morphologie und die molekulare Zusammensetzung gleichzeitig zu visualisieren, was ein leistungsstarkes Werkzeug für die Untersuchung von Krankheiten und des Alterungsprozesses ist.
Um zu beginnen, wärmen Sie den Laser auf und warten Sie etwa 15 bis 20 Minuten. Schalten Sie die Steuerbox ein, gefolgt von dem Touchpanel-Controller, dem Netzteil für die Haupt-Laserfernbedienung und dem Netzteil für die Sub-Laser-Fernbedienung, dann schalten Sie dann den Silizium-Fotodiodendetektor und den Lock-in-Verstärker ein. Richten Sie das Lasersystem mit einem Pumpstrahl ein, der von 780 Nanometern bis 990 Nanometern abstimmbar ist, mit einer Pulsbreite von fünf bis sechs Pikosekunden und einer Wiederholrate von 80 Megahertz.
Der Stokes-Laserstrahl soll eine feste Wellenlänge von 1031 Nanometern haben, mit einem Puls von sechs Pikosekunden und einer Wiederholrate von 80 Megahertz. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Pumpen- als auch der Fokes-Strahl eine geringe Leistung von mindestens 20 Milliwatt haben, damit sie auf der Ausrichtungsplatte sichtbar sind. Tragen Sie Öl auf den Ölkondensator mit hoher numerischer Apertur auf.
Montieren Sie den Objektträger auf den Ölkondensator und platzieren Sie einen großen Wassertropfen auf dem Objektträger für das 25X-Wasserobjektiv. Stellen Sie den Z-Tisch so ein, dass der Fokus so eingestellt wird, dass das helle Hellfeldbild der biologischen Probe unter dem 25-fachen Wasserobjektiv sichtbar ist. Beginnen Sie den Bildgebungsprozess in der richtigen Reihenfolge, um Photobleaching zu vermeiden.
Um schnell zwischen MPF und SHG zu wechseln, wechseln Sie vom Pumpbalken auf den festen Stokes-Strahl. Wählen Sie die Bildauflösung als 512 x 512 Pixel. Legen Sie die Verweilzeit auf acht Mikrosekunden pro Pixel für MPF und SHG fest, mit einem durchschnittlichen Frame über drei.
Verwenden Sie 40 Mikrosekunden pro Pixel mit einem durchschnittlichen Frame von zwei für die SRS-Modalität. Um Autofluoreszenz mit MPF zu erhalten, schalten Sie den Stokes-Laserstrahl aus. Stimmen Sie den Pumplaser auf 800 Nanometer ab, um NADH und Flavin anzuregen.
Erfassen Sie das Kollagenfasersignal mit SHG. Schalten Sie den Pumplaserstrahl aus und verwenden Sie den Stokes Laserstrahl nur mit einer Leistung von 500 Milliwatt. Erhalten Sie die räumliche Verteilung von Proteinen und Lipiden mit SRS.
Lassen Sie beide Laserstrahlen eingeschaltet und passen Sie die Frequenz des Laserstrahls an den spezifischen Schwingungsmodus für jedes Molekül an. Um die hyperspektralen SRS-Bilddatensätze zu erfassen, wählen Sie den Suite-Modus und stellen Sie den Wellenlängenbereich von 781,3 Nanometern bis 806,5 Nanometern ein. Wählen Sie eine Stapelnummer von mindestens 60 und erfassen Sie den hyperspektralen Bildstapel.
Speichern Sie alle Bilder derselben Interessenbereiche im selben Ordner und stellen Sie sicher, dass das Bildformat eine Olympus OIR-Datei ist. Mit der Autofluoreszenz- und SRS-Bildgebung wurden metabolische und strukturelle Informationen aus menschlichem Lungengewebe erfolgreich erfasst. Die ratiometrische Analyse des optischen Redoxverhältnisses und des Lipidunsättigungsverhältnisses lieferte räumliche Verteilungen der Stoffwechselaktivität und der molekularen Zusammensetzung im menschlichen Lungengewebe.
Der quantitative Vergleich von oxidativem Stress und Lipidunsättigung zwischen gesundem Gewebe und Tumorgewebe zeigt Unterschiede in den Stoffwechselzuständen.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert eine multimodale optische Bildgebungsplattform, die die Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik und des Stoffwechsels ermöglicht. Durch den Einsatz verschiedener Bildgebungstechniken können wir Einblicke in die zelluläre und molekulare Umgebung verschiedener Pathologien gewinnen.
Hauptkomponenten der Studie
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Optische Bildgebung
Hintergrund
- Multimodale Mikroskopie ermöglicht die Messung molekularer und metabolischer Unterschiede.
- Sie bietet einen ganzheitlichen Blick auf pathophysiologische Veränderungen.
- Anwendungen expandieren in klinischen Umgebungen, insbesondere mit Mikroendoskopen.
- Maßgeschneiderte Mikroskopsysteme adressieren experimentelle Herausforderungen.
Zweck der Studie
- Zur gleichzeitigen Visualisierung von Stoffwechsel, Morphologie und molekularer Zusammensetzung.
- Zur Untersuchung von Krankheiten und dem Alterungsprozess.
- Zur Klassifizierung verschiedener Brustkrebssubtypen.
Verwendete Methoden
- Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie
- Mikroskopie der zweiten Harmonischen Generation
- Stimulated Raman Scattering Mikroskopie
- Etikettierungsfreie bioorthogonale Bildgebungstechniken
Hauptergebnisse
- Erhebliche Fortschritte im Verständnis des Lipidstoffwechsels in Modellorganismen.
- Identifizierung räumlicher Heterogenität in der zellulären Dynamik.
- Klassifizierung von Brustkrebssubtypen mittels Bildgebungstechniken.
- Verbesserte Visualisierung von Stoffwechselprozessen im Gehirn.
Schlussfolgerungen
- Der multimodale Ansatz ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Krankheitsforschung.
- Etikettierungsfreie Bildgebungstechniken liefern umfassende Einblicke in zelluläre Umgebungen.
- Zukünftige Anwendungen könnten die klinischen Bildgebungsmöglichkeiten weiter verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Multimodal optical imaging platforms that integrate MPF, SHG, and SRS modalities enable simultaneous, label-free quantification of cellular metabolism, morphology, and molecular composition at subcellular resolution. This capability addresses a critical need for high-content, spatially resolved metabolic and structural data in early discovery and translational research, supporting predictive confidence in disease modeling and mechanistic de-risking. The platform's ability to coregister multiple functional readouts from the same biological region enhances portfolio decision-making and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of metabolic activity and molecular heterogeneity in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by correlating metabolic states with structural and compositional features.
- Facilitates functional target validation through label-free, multiplexed imaging of live cells and tissues.
Screening & Assay Development
- Provides validated, reproducible imaging outputs for quantitative assessment of metabolic and structural biomarkers.
- Supports assay standardization by enabling simultaneous acquisition of multiple modalities from the same sample region.
- Accelerates screening readiness by reducing the need for exogenous labels and minimizing sample perturbation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns metabolic and molecular imaging outputs with disease progression and therapeutic response in preclinical models.
- Enables spatial mapping of metabolic heterogeneity relevant to tumor biology and neurodegeneration.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing in situ, label-free readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This multimodal imaging platform bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by delivering multiplexed, quantitative data from intact biological systems.
- Discovery Biology: Integrates hypothesis testing and pathway clarification by correlating metabolic, structural, and compositional data.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Provides ratiometric and spatially resolved measurements of oxidative stress and lipid unsaturation for robust statistical analysis.
- Translational Research: Enables alignment of imaging biomarkers with disease states and therapeutic outcomes in model systems.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, label-free imaging capability adaptable across diverse biological models and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and pathway validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing high-content, multiplexed data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced optical imaging and multimodal hardware integration.
- Demands specialized instrumentation, including tunable lasers and synchronized detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptation across model systems may require optimization of imaging parameters and sample preparation.
- Complexity of hardware integration and data management may limit throughput in some settings.
