Modifizierter Most Probable Number Assay zur Quantifizierung von Salmonellen in rohen und küchenfertigen Hühnerprodukten

Unsere Forschung entwickelt schnelle Nachweis-, Quantifizierungs- und Charakterisierungstechnologien für lebensmittelbedingte Krankheitserreger und konzentriert sich dabei auf empfindliche Methoden, die die Lebensmittelsicherheit durch die Identifizierung einer Kontamination in realen Umgebungen verbessern können. Zu den wichtigsten Herausforderungen gehören eine schnelle empfindliche Detektion und komplexe Matrizen mit kostengünstigen und dennoch skalierbaren Lösungen. Wir gehen auch auf Schwierigkeiten bei der Reduzierung von Fehlalarmen und der Verbesserung der Kompatibilität mit verschiedenen Testumgebungen ein.

Für die Lebensmittelsicherheit bedeutet dies, Krankheitserreger in geringen Konzentrationen in einer Vielzahl von Lebensmittelmatrizen genau nachzuweisen. Unser Protokoll schließt die Lücke zwischen dem Nachweis der Prävalenz und der Quantifizierung von Salmonellen, um deterministische Werte für den Grad der Kontamination in Lebensmitteln zu liefern. Das Verfahren ist minimal störend, da es validierte Assays enthält, die in FSIS-Protokollen verwendet werden, und flexibel genug, um zusätzliche Krankheitserreger und Lebensmittelmatrizes aufzunehmen.

Legen Sie zunächst das Hackfleisch aus der Frischfleischabteilung des örtlichen Einzelhandels auf eine Arbeitsplattform. Das Fleisch aseptisch in 25 Gramm Proben aufteilen. Erwerben Sie küchenfertige Hähnchenprodukte aus der Tiefkühlabteilung des örtlichen Einzelhandels und teilen Sie sie aseptisch in 25-Gramm-Proben auf.

Streifen Salmonella enterica Serovar Typhimurium ATCC 14028 auf einer Gehirn-Herz-Infusionsschneckenplatte. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag impfen Sie 25 Milliliter Gehirn-Herz-Infusionsbrühe mit einer Kolonie frisch gezüchteter Salmonellen.

Züchten Sie die Kultur aerob über Nacht bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 100 U/min. Um eine Reihe von zehnfachen Verdünnungen herzustellen, werden 0,5 Milliliter der Kultur in 4,5 Milliliter gepuffertes Peptidwasser oder BPW überführt und gründlich gemischt. Dann werden für jede weitere Verdünnung 0,5 Milliliter aus der vorbereiteten Verdünnung in 4,5 Milliliter BPW überführt.

Füllen Sie anschließend 25 Gramm bestrahltes Hähnchenhackfleisch aseptisch in sterile Magenbeutel um. Beimpfen Sie die Probe mit einem Milliliter der gewünschten Konzentration der Kulturverdünnung. Verteilen Sie das Inokulum mit einem sterilen Zellspreizer vorsichtig gleichmäßig auf der Oberfläche des Huhns und lassen Sie es eine Stunde lang bei vier Grad Celsius stehen.

Nach einer einstündigen Inkubation von bestrahlten Hühnerhackfleischproben mit Salmonellenkulturen werden jeder Probe 225 Milliliter BPW zugesetzt, um das gewünschte Proben-zu-Medien-Verhältnis zu erreichen. Homogenisieren Sie die Hühnerproben mit dem Stomacher bei normaler Geschwindigkeit für 120 Sekunden. Entfernen Sie mit einer 50-Milliliter-Pipette vorsichtig die Flüssigkeit von der gefilterten Seite des Stomachers und teilen Sie sie in zwei sterile Zentrifugenflaschen auf.

Die Proben werden 10 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in drei Millilitern BPW mit einem sterilen Spatel. Geben Sie 12 Milliliter BPW in das resuspendierte Pellet und mischen Sie es gründlich unter Rühren mit einem sterilen Spatel.

Kombinieren Sie den Inhalt beider Zentrifugenflaschen in einer Flasche. Geben Sie drei Milliliter der resuspendierten Probe in jede Vertiefung in Spalte eins des 48-Well-Blocks, um acht Replikate zu erstellen. Um eine Reihe von zehnfachen Verdünnungen über die Säulen eins bis sechs mit einer Achtkanalpipette vorzubereiten, fügen Sie 0,3 Milliliter der Probe aus jeder Vertiefung in 2,7 Milliliter BPW in der nächsten Säule hinzu, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.

Inkubieren Sie die Blöcke über Nacht bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 100 U/min. Am nächsten Tag werden mit einer Mehrkanalpipette sieben Mikroliter Kultur aus jeder Verdünnung in einem Vier-mal-Sechs-Raster auf die Schneckenplatten der Gehirn-Herz-Infusionsschnecke aufgefüllt. Lassen Sie die Platten 10 Minuten trocknen, bevor Sie sie 18 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Untersuchen Sie nach der Inkubation die Schneckenplatten und markieren Sie mindestens eine Kolonie als positiv und kein Wachstum als negativ. Geben Sie die Anzahl der Verdünnungen und den Verdünnungsfaktor in ein Arbeitsblatt ein. Geben Sie das entsprechende Volumen oder Gewicht der Probe ein.

Geben Sie dann die Anzahl der Replikate an, und geben Sie die Anzahl der Proben ein, die positiv getestet wurden. Klicken Sie auf Ergebnisse berechnen, um kommentierte positive und negative Ergebnisse mit der einfachen Methode der maximalen Wahrscheinlichkeitsauflösung zu analysieren. Richten Sie zunächst den 48-Well-MPN-Block für Salmonellenkulturen ein, die mit Hühnerproben geimpft wurden.

Mischen Sie Kulturen in einem 48-Well-Block, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Übertragen Sie 200 Mikroliter jeder Kultur in eine 96-Well-PCR-Platte. Die Platte verschließen und bei 6.600 g 10 Minuten zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 20 Mikroliter des Reagenzes des DNA-Extraktionskits zum Pellet. Mischen Sie das Pellet, indem Sie es auf und ab pipettieren. Verschließen Sie die Platte erneut und erhitzen Sie sie 10 Minuten lang bei 99 Grad Celsius, gefolgt von einem Abkühlen auf 20 Grad Celsius.

Verwenden Sie nach der Zentrifugation zwei Mikroliter des Überstands, um das QPCR-Gemisch gemäß dem festgelegten Protokoll herzustellen. Führen Sie unter den folgenden Bedingungen die Echtzeit-PCR durch. Exportieren Sie nach der PCR die Ergebnisse, und betrachten Sie die Wells mit Zyklusschwellenwerten kleiner oder gleich 30 als positiv und größer als 30 als negativ.

Mischen Sie Kulturen in einem 48-Well-Block, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Übertragen Sie 20 Mikroliter jeder Probe in das mit dem Salmonellen-Kit gelieferte Analyseröhrchen für den molekularen Nachweisassay. Erhitzen Sie die Proben 15 Minuten lang bei 100 Grad Celsius.

Anschließend werden die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Übertragen Sie 20 Mikroliter Lysat aus jedem Lyseröhrchen in ein Reagenzröhrchen und laden Sie die Reagenzröhrchen in den Halter. Fügen Sie den Halter mit den Reagenzröhrchen dem Instrument des molekularen Detektionssystems hinzu.

Konfigurieren Sie die Softwareeinstellungen für den Assay des molekularen Nachweissystems. Führen Sie den Assay aus und exportieren Sie den Bericht zur Analyse. Der MDS-Laufbericht enthält detaillierte Ausgabeinformationen, die positiv oder negativ sind.