Genomweiter CRISPR-Screen zur Entschlüsselung strahlenempfindlicher und strahlenresistenter Gene

Diese Forschung konzentriert sich auf das genomweite CRISPR-Screening und die Strahlentherapie. Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, um strahlenempfindliche und strahlenresistente Gene mit einem genomweiten CRISPR-Screen in Lungenkrebszellen nach der Bestrahlung zu betrachten. Zu den aktuellen experimentellen Herausforderungen gehören die Off-Target-Effekte, die durch die enorme Komplexität des Genoms und mögliche Schwierigkeiten bei der Erforschung der zugrunde liegenden Mechanismen verursacht werden. Im Vergleich zu herkömmlichen Screening-Methoden erreicht CRISPR eine dauerhafte genetische Veränderung und weist eine überlegene Präzision auf, was es besonders wertvoll für die funktionelle Genomforschung und die Zielentdeckung macht. In Zukunft wird sich unser Team auf die Erforschung des In-vivo-CRISPR-Screenings konzentrieren, um die Probleme zu lösen, die diese Forschung hinterlassen hat, und wir werden uns für die Optimierung der CRISPR-Technologie einsetzen.

[Erzähler] Stellen Sie zunächst die Dichte der adhärenten Zellen auf fünf mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter ein. Verteilen Sie mit einer Pipette zwei Milliliter der Zellsuspension in jede 3,5 Zentimeter große Kulturschale für die Bestrahlung in unterschiedlichen Dosen. Stellen Sie die Gerichte in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und inkubieren Sie sie über Nacht. Nummerieren Sie jede 3,5 Zentimeter große Kulturschale mit einem Marker von eins bis fünf. Verabreichen Sie mit einer Strahlenquelle Strahlendosen von 2, 4, 6 bzw. 8 Grau an die Schüssel zwei bis fünf. Stellen Sie die bestrahlte Zelldichte auf eins mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter ein. 10 Mikroliter pro Well, entsprechend 1000 Zellen pro 100 Mikroliter, in Sechs-Well-Platten mit drei Replikaten pro Strahlendosis aussäen. Dann säen Sie 30 Mikroliter pro Well, was 3000 Zellen pro 100 Mikroliter entspricht, in 96-Well-Platten mit fünf Replikaten pro Strahlendosis. Mischen Sie nun das CCK-8-Reagenz mit RPMI 1640 Medium ohne FBS im Verhältnis eins zu neun. Gib die Mischung auf die 96-Well-Platte und inkubiere die Platte eine Stunde lang im Dunkeln. Verwenden Sie dann einen Mikroplatten-Reader, um die optische Dichte bei 450 Nanometern zu messen. Um den Infektionsprozess zu starten, richten Sie einen logarithmischen Konzentrationsgradienten für Lentiviren von null bis 800 Einheiten pro Milliliter ein. Geben Sie das entsprechende Volumen Lentivirus zu zwei Mikrolitern Polybren pro Schale und lassen Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibrieren. Die Lentivirus-Polybrene-Mischung langsam in jede Vertiefung tropfen. Stellen Sie die Dichte der Elternzellen auf dreimal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter ein und inokulieren Sie einen Milliliter in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. Geben Sie Puromycin in einem Konzentrationsgradienten in die Vertiefungen. Ersetzen Sie nach 72 Stunden nach der Infektion das Medium in jeder Vertiefung durch ein vollständiges Medium, das die minimale Puromycinkonzentration für die Zellabtötung enthält. Berechnen Sie die Vielzahl der Infektionen für jede Vertiefung basierend auf den überlebenden Zellen. Stellen Sie die Dichte der adhärenten Zellen auf eins mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter ein. Fügen Sie das Lentivirus bei einer Infektionsvielfalt von 0,3 in 30 Mikroliter Polybrene pro Schale hinzu und lassen Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibrieren. Die Mischung aus Lentivirus und Polybrene langsam in die 15 Zentimeter große Kulturschale tropfen lassen. Gut mischen und über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Am zweiten Tag nach der Infektion aspirieren Sie das Medium aus der Kulturschale und ersetzen Sie es durch 15 Milliliter RPMI 1640 vollständiges Medium mit 10 % FBS. Wiederholen Sie die gleiche Behandlung für die nicht infizierten Elternzellen als Negativkontrolle und kultivieren Sie 72 Stunden lang. Verdauen Sie nun die Zellen aus einer 15 Zentimeter großen Kulturschale mit 0,25 % Trypsin. Resuspendieren Sie die Zellen in RPMI 1640 Komplettmedium mit 10% PBS und zählen Sie die Anzahl der Zellen. Verwenden Sie nach der Extraktion der genomischen DNA für den Tag Null ein NanoDrop UV-Spektralphotometer, um die DNA-Konzentration und -Reinheit zu messen. Verabreichen Sie den Zellen in der Behandlungsgruppe eine angemessene Strahlendosis und lassen Sie die Zellen der Kontrollgruppe unbehandelt, damit sie sich normal vermehren können. Nach 14-tägiger Behandlung verdauen Sie sowohl die Zellen der Behandlungs- als auch der Kontrollgruppe mit 0,25 % Trypsin. Resuspendieren Sie die Zellen in RPMI 1640 Komplettmedium mit 10% FBS. Die Zellen werden fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS. Nach Wiederholung des Zentrifugationsschritts wird die genomische DNA vom Tag 14 aus dem Pellet extrahiert und die DNA-Konzentration bestimmt. Bereiten Sie anschließend die erforderlichen Grundierungen vor und verdünnen Sie sie auf 10 Mikromolaren. Nachdem Sie die Komponenten hinzugefügt haben, um ein 20-Mikroliter-Reaktionssystem einzurichten, zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Sekunden lang kurz bei 300 g. Bereiten Sie für die Agarose-Gelelektrophorese das Gel vor, entfernen Sie den Kamm davon und füllen Sie den Elektrophoresetank mit ausreichend Puffer, um das Gel zu bedecken. Geben Sie Ladepuffer in die DNA-Probe und mischen Sie gut. Laden Sie schließlich das Gemisch in die Vertiefungen und starten Sie die Elektrophorese. Die Koloniebildung nach 14 Tagen zeigte, dass die Exposition gegenüber zwei Gray Strahlung die Anzahl der überlebenden Kolonien im Vergleich zu null Gray signifikant reduzierte. Der CCKA-Assay zeigte eine erhebliche Abnahme der Zellviabilität bei zwei Gray mit einer weiteren Abnahme bei höheren Strahlendosen. Die Behandlung mit steigenden Konzentrationen von Puromycin für 72 Stunden zeigte, dass ein Mikromolar die Mindestkonzentration war, die erforderlich war, um A549-Zellen zu eliminieren. Die PCR-Validierung zeigte deutliche Banden bei 231 Basenpaaren, was die erwartete Länge der sgRNA-Sequenzen in der CRISPR-Bibliothek bestätigt. Die Sequenzierungsanalyse ergab, dass etwa 60 % der Reads erfolgreich mit dem Referenzgenom abgebildet werden konnten. Die Anzahl der sgRNA-Lesevorgänge folgte einer Poisson-Verteilung, was den theoretischen Erwartungen für ein Screening auf Genomebene entsprach. Die PCA- und Heatmap-Analyse zeigte eine hohe Variabilität zwischen den Gruppen und eine geringe Variation zwischen den Gruppen, was die experimentelle Konsistenz bestätigt. Die Gen-Ontologie-Analyse identifizierte die DNA-Schadensantwort als einen der Top 15 der Ergebnisse.