Ein Kraniotomie Chirurgie Verfahren für chronische Brain Imaging

Bildgebende Verfahren werden bei der Erforschung der Gehirnfunktion immer wichtiger. Unter ihnen hat sich die Zwei-Photonen-Lasermikroskopie als äußerst nützliche Methode herausgestellt, da sie die Untersuchung des lebenden Anta-Gehirns und mit entsprechenden Vorbereitungen ermöglicht. Diese Technik ermöglicht die Beobachtung desselben kortikalen Bereichs chronisch von Minuten bis Monaten.

In diesem Video zeigen wir ein Präparat für die chronische in vivo Bildgebung des Gehirns mittels zweier Fotomikroskopie. Dr. Carl Voda, ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute auf der Janelia Farm, leistete ursprünglich Pionierarbeit bei der Vorbereitung von Schädelfenstern, die wir heute vorstellen werden. Hallo Und Ricardo muss aus dem Labor von Carlos Porter Cayo in der Abteilung für Neurologie an der University of California Los Angeles kommen.

Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Erstellung eines Schädelfensters für die chronische in vivo Bildgebung. Dieses Präparat ist sehr nützlich, da es ermöglicht, mit dem Photonen-Lasermikroskop tief im Inneren des Gehirns abzubilden. Also fangen wir an.

Vor Beginn der Operation werden die Mäuse mit Fluor betäubt. 4% für die Induktion, ein Punkt eineinhalb bis 2% für die Operation, bei Verwendung von I-A-C-U-C-zugelassenen Verfahren, ist es wichtig, Schwanz- und/oder Zehenkneifungen zu verwenden, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig sediert ist. Mit einem Nagerschneider werden die Haare vom Nacken bis zu den Augen geschoren.

Nach der Rasur wird die Maus auf ein stereotaktisches Gestell gelegt, das auf einer Wasserzirkulationsdecke aufliegt. Bei 37 Grad Celsius wird der Kopf mit Ohrstangen fest fixiert. Anschließend wird eine Augensalbe aufgetragen, um ein Austrocknen des Auges des Tieres zu verhindern. Als nächstes werden Dexamethason, 0,2 Milligramm pro Kilogramm, und Carprofen fünf Milligramm pro Kilogramm subkutan verabreicht.

Um eine Schwellung des Gehirns bzw. eine Entzündungsreaktion zu verhindern. Achten Sie vor Beginn der Operation darauf, den Operationsbereich zu sterilisieren, indem Sie die Haut mit drei abwechselnden Tupfern von 70% Alkohol und Betadine abwischen. Alle chirurgischen Instrumente wurden mit einem Glasperlensterilisator unter Verwendung einer mit Ethanol besprühten Schere vorsterilisiert.

Die Haut über dem Schädel wird entfernt, beginnend mit einem horizontalen Schnitt entlang der Basis des Kopfes, gefolgt von zwei Schnitten in rostraler Richtung, die fast bis zu den Augenlidern reichen. Dann zwei schräge Schnitte, die an der Mittellinie zusammenlaufen. Zu diesem Zeitpunkt wird ein Tropfen Lidocain und Adrenalinlösung auf das Periost aufgetragen, um übermäßige Blutungen oder Schmerzen mit einem Skalpell zu vermeiden, das Periost wird bis zu den Rändern des Schädels zurückgezogen.

Auch die Muskulatur des Nackens wird leicht eingezogen. Anschließend wird die gesamte freiliegende Stelle des Schädels vorsichtig mit einem Skalpell abgeschabt, um eine trockene Oberfläche zu schaffen. Dies ist sehr wichtig, da der Kleber beim späteren Auftragen besser haften kann.

Sobald eine Bildgebungsstelle ausgewählt wurde, kann man zuerst das Schädelfenster erstellen. Ein Kreis von etwa vier Millimetern Durchmesser wird mit einem pneumatischen Zahnbohrer schonend gezogen. Nach einer leichten Bohrung wird wieder Lidocain-Adrenalin-Lösung auf die Schädeloberfläche aufgetragen.

Die Bohrung wird gestoppt, wenn eine sehr dünne Knochenschicht übrig bleibt, in der Regel eine Nase. Dieses Stadium wird erreicht, indem man sanft auf die Mitte der Kraniotomie drückt, um zu spüren, wie sie unter einem Tropfen Kochsalzlösung nachgibt, und indem man die Knochentrabekel ausnutzt. Eine schwammige Struktur des Knochens.

Die Kraniotomie wird mit einer sehr dünnen Pinzette vom Schädel weggehoben. Die Kochsalzlösung ist wichtig, weil sie hilft, den Schädel anzuheben und Blutungen der Dura zu verhindern. Als nächstes wird ein zuvor in Kochsalzlösung getränkter Gelschaum auf die Duramasse aufgetragen, um kleine Blutungen zu stoppen, die manchmal bei der Entfernung des Schädels auftreten

Nach dem Trocknen der Dura Matter-Oberfläche und der Sicherstellung, dass kein Ausbluten entsteht, wird ein steriler, fünf Millimeter dicker Glasdeckglas sanft auf die Dura Matter gelegt. Ein Tropfen Kleber auf Cyanacrylatbasis wird auf die gegenüberliegende Hemisphäre des Schädels aufgetragen. Mit Hilfe einer Nadel wird der Kleber sanft rund um das Fenster aufgetragen, wobei darauf zu achten ist, dass er nicht unter die Scheibe gelangt.

Der Kleber kann nun in einer dünnen Schicht auf die gesamte Oberfläche des Schädels aufgetragen werden. Sobald der Kleber getrocknet ist, wird Zahnacryl gemischt und auf die gesamte Schädeloberfläche aufgetragen, wobei auch ein kleiner Rand des Deckglases bedeckt wird, um es zu sichern. Nach dem Befestigen des Deckglases wird eine kleine Vertiefung um das Fenster herum mit Dentalacryl gemacht.

In das Dentalacryl ist ebenfalls ein Titansteg eingelassen. Diese Stange wird später verwendet, um die Maus sicher auf dem Tisch des Mikroskops zu befestigen. Für die Bildgebung ist es wichtig, sicherzustellen, dass der Balken waagerecht ist, so dass er parallel zu einem Schädelfenster ist.

Wenn Sie ein Blatt Papier unter die Stange legen, kann die Stange waagerecht bleiben, während das Acryl aushärtet, das Dentalacryl wird 10 Minuten lang aushärten oder aushärten gelassen, wobei die Titanstange an Ort und Stelle fixiert wurde. Das Tier wird dann in einen warmen Käfig gebracht, bis es sich erholt hat. Nach der Genesung von der Narkose kann das Tier noch am selben Tag abgebildet werden.

Dieser Film zeigt einen Stapel von 160 Bildern, die in Abständen von fünf Mikrometern mit unserem speziell angefertigten Zwei-Photonen-Mikroskop durch ein Schädelfenster aufgenommen wurden, das über dem somatosensorischen Kortex einer drei Monate alten GFPM-Maus platziert wurde. Diese transgene Linie von Mäusen exprimiert GFP in einer kleinen Untergruppe von parmalen Neuronen. In Schicht fünf und Schicht zwei drei wurde das Bild mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,8 und einer Anregungswellenlänge von 910 Nanometern aufgenommen.

Auf den oberflächlicheren Bildern sind die dendritischen Dorne der apikalen Dendriten der Parametallzellen leicht zu erkennen. Das apikale Büschel der Dendriten jedes Neurons konvergiert zu einem einzigen großen apikalen Dendriten. Kleinere schräge Dendriten sind ebenfalls zu sehen, die von diesen apikalen Dendriten-Hauptaxonen ausgehen und das Sichtfeld durchqueren.

Dies ist ein Stapel von 12 Bildern, die alle eineinhalb Mikrometer mit demselben 40-fachen Objektiv bei höherer Vergrößerung aufnehmen, ein oberflächlicher Dendrit wird mit hoher Auflösung gezeigt, die ausreicht, um einzelne dendritische Stacheln aufzulösen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie eine Schädelfensterpräparation für die chronische Bildgebung des Gehirns mit Hilfe der Fotomikroskopie durchführen können. Dies ist eine äußerst leistungsfähige Methode für die Erforschung des Gehirns, da sie es Ihnen ermöglicht, sowohl die Struktur als auch die Funktion des lebenden Gehirns zu untersuchen, nicht nur in einer einzigen Vorstellungskraft, sondern auch chronisch durch mehrere Vorstellungsformen über Zeiträume von Monaten.

Ein weiterer Vorteil der Schädelfensterpräparation besteht darin, dass eine große Sichtfläche abgebildet werden kann, die es ermöglicht, große Strukturen wie eine ganze Aktion oder den Inri-Dorn über eine Spannweite von Millimetern abzubilden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, unter möglichst sauberen und sterilen Bedingungen zu arbeiten und eine sehr ruhige Hand zu haben. Okay, und das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.