Name: Ein Elektroporationszytometrie-Protokoll für die Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen unter Verwendung von U2 OS-Zellkulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T12:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Lernen Sie Elektroporationszytometrie für die Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen mit U2 OS-Kulturen. Diese Methode ermöglicht kontinuierliche Experimente bis zu 72 Stunden zur Untersuchung des Zellzyklus.

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<ol><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+electroporation-based+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A review on electroporation-based intracellular delivery.</a> Molecules. 23 (11), 3044(2018).</li>
<li>Kandušer, M., Miklavčič, D. Electroporation in biological cell and tissue: An overview. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandu%C5%A1er%2C+M+%22Electrotechnologies+for+extraction+from+food+plants+and+biomaterials.+Food+Engineering+Series%22">Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials. Food Engineering Series</a>. , Springer. New York. (2009).</li>
<li>Cemazar, M., Sersa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+electrochemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectricity%22%5BJournal%5D)">Recent advances in electrochemotherapy.</a> Bioelectricity. 1 (4), 204-213 (2019).</li>
<li>Iyengar, S. K., Iyengar, S., Srivathsan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+pulsed+field+ablation+and+the+challenges+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">The promise of pulsed field ablation and the challenges ahead.</a> Front Cardiovasc Med. 10, 1235317(2023).</li>
<li>Miklavčič, D., Mali, B., Kos, B., Heller, H., Serša, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemotherapy%3A+From+the+drawing+board+into+medical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Electrochemotherapy: From the drawing board into medical practice.</a> Biomed Eng Online. 13 (1), 29(2014).</li>
<li>Ando, R., Sakaue-Sawano, A., Shoda, K., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+coral+fluorescent+proteins+of+distinct+colors+for+sharp+visualization+of+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Two coral fluorescent proteins of distinct colors for sharp visualization of cell-cycle progression.</a> Cell Struct Funct. 48 (2), 132-144 (2023).</li>
<li>Nesmith, T., Vieira, C., Rackus, D., Gupta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electroporation+cytometry+system+for+long-term%2C+live+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">An electroporation cytometry system for long-term, live cell cycle analysis.</a> Biomicrofluidics. 18 (4), 044105(2024).</li>
<li>Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sorting%3A+automated+separation+of+mammalian+cells+as+a+function+of+intracellular+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence.</a> Science. 166 (3906), 747-749 (1969).</li>
<li>Chao, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+human+cell+cycle+is+a+series+of+uncoupled%2C+memoryless+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Bio%22%5BJournal%5D)">Evidence that the human cell cycle is a series of uncoupled, memoryless phases.</a> Mol Sys Bio. 15 (3), e8604(2019).</li>
<li>Diehl, F. F., Sapp, K. M., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bidirectional+relationship+between+metabolism+and+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">The bidirectional relationship between metabolism and cell cycle control.</a> Trends Cell Bio. 34 (2), 136-149 (2024).</li>
<li>Rems, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+electrofusion+using+nanosecond+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cell electrofusion using nanosecond electric pulses.</a> Sci Rep. 3, 3382(2013).</li>
<li>Klein, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+best+practices+for+controlling+mammalian+cell+culture+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Bio%22%5BJournal%5D)">Toward best practices for controlling mammalian cell culture environments.</a> Front Cell Dev Bio. 10, 788808(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Kammerschlitten (3D-gedruckt/montiert) &nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kulturplatte (10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Delta Vision</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Alternative Mikroskopmodelle können ebenfalls verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Bühne und das Umgebungssystem den Elektroporationskammerschlitten (55 mm x & nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM &ndash; </td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum mit hohem Glukosegehalt&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A5256701&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>i3 MK3S 3D Drucker</td><td>Prusa N</td><td>/A</td><td>Es können alternative Druckermodelle verwendet werden, die STL-Dateien verwenden können.</td></tr><tr><td>Pen</td><td>Strep ThermoFisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>tFUCCI(CA)5</td><td>Addgene</td><td>153521</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-07-07</td><td></td></tr><tr><td>U2-OS Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

ein elektroporationszytometrie-protokoll für die fluoreszenzmikroskopie lebender zellen unter verwendung von u2 os-zellkulturen

An Electroporation Cytometry Protocol for Live-Cell, Fluorescence Microscopy Using U2 OS Cell Culture

Unter Verwendung des FUCCI-Systems (Abbildung 2) wurden visuelle Zellzyklusdaten erhalten, indem die Zeitspanne gemessen wurde, in der jede Farbe von der Zelle als Ergebnis der Proteinexpression und Unbiquitination exprimiert wurde. Basierend auf den Ergebnissen aus den unsynchronisierten und synchronisierten Experimenten (Abbildung 3) war offensichtlich, dass die S-Phasen-PEF-Exposition den Zellzyklus hochregulierte. Dies wurde durch die Abnahme der durchschnit...

Ein Elektroporationszytometrie-Protokoll für die Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen unter Verwendung von U2 OS-Zellkulturen

Pulsed electric fields (PEFs) have a wide range of applications in medical research and clinical applications. A key area of research focuses on ...

an-electroporation-cytometry-protocol-for-live-cell-fluorescence

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Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Video zeigen wir effiziente Elektrofusion von...

Zell Elektroschweißmuffe Visualisierte mit Fluoreszenz-Mikroskopie

RNA-Polymerase II Transkription Kinetik auf bestimmte Gene in lebenden Zellen gemessen. mRNAs aus dem Gen von Interesse transkribiert werden fluoreszenzmarkierten und mit Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der in vivo Kinetik von Transkriptions-Dehnung erhalten werden.

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

Quelle: Aigrain, L., et al. Internalisierung und Beobachtung fluoreszierender Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen mittels Elektroporation.  J. Vis. Exp. (2015)Das Video demonstriert die Abgabe von fluoreszierenden Biomolekülen in elektrokompetente mikrobielle Zellen mittels Elektroporation. Der Prozess beginnt mit der Einführung von fluorophor-markierter DNA oder Proteinen in eine gekühlte Zellsuspension. Anschließend wird ein Hochspannungsimpuls angelegt, um temporäre Membranporen zu...

Elektroporationsbasierte Abgabe fluoreszierender Biomoleküle in Bakterienzellen

Dieses Video beschreibt BiFC-PALM ― eine Kombination aus photoaktivierter Lokalisationsmikroskopie und bimolekularer Fluoreszenzkomplementierung ― zur Beurteilung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. BiFC beinhaltet die Fusion von zwei fluoreszierenden Proteinfragmenten mit zwei interagierenden Proteinen von Interesse. Wenn die beiden Proteine interagieren, werden die Fragmente in die Nähe gebracht, wodurch die beiden Teile zusammenkommen und ein funktionsfähiges fluoreszierendes Protein...

Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementierungs-gekoppelte photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie

Dieses Video zeigt die Bildgebung von lebenden Zellen der immunologischen Synapsentopologie und untersucht die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und Epithelzellen, die fluoreszierende Antigene tragen. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt eine rote Zytoplasma-Verschiebung und gelbe Membranringe in Endothelzellen, was auf die Bildung immunologischer Synapsen hinweist.

Beurteilung der immunologischen Synapsentopologie durch Lebendzell-Bildgebung

Studien von Biomolekülen in vivo sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Funktion in einem biologischen Kontext. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die es ermöglicht, fluoreszierende Biomoleküle, wie DNA oder Proteine, in lebende Mikroorganismen zu internalisieren. Die Analyse von in vivo-Daten, die durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, wird ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

Protein-Wechselwirkungen werden in Zellen mit räumlicher Auflösung im Nanometerbereich visualisiert, indem die bimolekulare Fluoreszenzkomplemmentierung (BiFC) mit der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) kombiniert wird. Beschrieben wird hier die Verwendung von BiFC-PALM zur Abbildung von Ras-Raf-Wechselwirkungen in U2OS-Zellen zur Visualisierung des nanoskaligen Clusterings und der Diffusion einzelner Ras-Raf-Komplexe.

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.

Double In Utero Elektroporation, um zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzuvisieren

Dieses Protokoll beschreibt die Mikrofabrikationstechniken, die erforderlich sind, um ein mikrofluidisches Lab-on-a-Chip-Elektroporationsgerät zu bauen. Der Versuchsaufbau führt kontrollierte Transfektionen auf Einzelzellebene in einem kontinuierlichen Fluss durch und kann mit populationsbasierter Kontrolle auf höhere Durchsätze erweitert werden. Es wird eine Analyse bereitgestellt, die die Fähigkeit zeigt, den Grad der Permeabilisierung der Zellmembran in Echtzeit elektrisch zu überwachen.

Herstellung und Betrieb eines kontinuierlichen Durchfluss-Mikroelektroporationssystems mit Permeabilisierungsdetektion

Zur Untersuchung der Reaktionen erregbarer Zellen in vitro beschreibt das Protokoll die optische Überwachung von Änderungen der Aktionspotentialerzeugung aufgrund der Elektroporation an einem einfachen erregbaren Zellmodell von gentechnisch veränderten Tet-on-Spiking-HEK-Zellen sowie von Änderungen der Transmembranspannung mit automatisierter Extraktion relevanter Parameter.

Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Durchführung der tiefen, ganzzelligen Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) mit einem rotierenden Scheibenkonfokalmikroskop mit optischer Photonenzuordnung, wodurch DNA-PAINT-Bildgebung ohne individuelle Optik oder komplexe Beleuchtung erforderlich ist.

Ganzzell-Superauflösungsbildgebung mittels DNA-PAINT auf einer rotierenden Scheibe konfokal mit optischer Photonenumzuweisung

Lernen Sie Elektroporationszytometrie für die Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen mit U2 OS-Kulturen. Diese Methode ermöglicht kontinuierliche Experimente bis zu 72 Stunden zur Untersuchung des Zellzyklus.

Ein Elektroporationszytometrie-Protokoll für die Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen unter Verwendung von U2 OS-Zellkulturen

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