Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen myeloischen Zellen und CAR-T-Zellen in vitro und in vivo
25. Juli 2025
Angesichts der begrenzten Xenotransplantat-Modelle, die zur Untersuchung von Interaktionen zwischen humanen CART- und myeloischen Zellen zur Verfügung stehen, haben wir in vitro und in vivo Modelle etabliert, um die Auswirkungen menschlicher Makrophagen auf CART-Zellen zu verstehen. Die Ergebnisse können möglicherweise verallgemeinert werden, um die Rolle von Makrophagen in der Tumormikroumgebung zu bewerten und Makrophagen-gezielte Immuntherapien zu testen.
Unsere Studie liefert vereinfachte in vitro und in vivo Modelle, um den Einfluss von humanen immunsuppressiven Makrophagen auf die Anti-Tumor-Aktivität von CA 19 im Rahmen des Mantelzell-Lymphoms zu verstehen. Das am häufigsten verwendete Modell zur Untersuchung der menschlichen Makrophagen und Monozyten in vivo ist die Transplantation hämatopoetischer Stammzellen in ausgerottete immundefiziente Mäuse. Die Transplantation immundefizienter Mäuse mit humanen hämatopoetischen Stammzellen zur Untersuchung menschlicher myeloischer Zellen bei Mäusen kann zeitaufwändig und teuer sein.
Die Effizienz der Transplantation kann ebenfalls eingeschränkt sein. Wir etablieren vereinfachte in vitro und in vivo Modelle, um die Wechselwirkungen zwischen menschlichen Makrophagen, CAR T und Tumorzellen zu untersuchen. Es kann auch verwendet werden, um andere Immuntherapien zu testen, die auf Makrophagen abzielen.
Zentrifugieren Sie zunächst die isolierten 10 Millionen menschlichen klassischen Monozyten bei 300 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in Kulturmedien auf eine Endkonzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter. Geben Sie humanes rekombinantes GM-CSF in die Suspension, um eine Endkonzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter zu erreichen, und mischen Sie gründlich.
Übertragen Sie die Monozyten in einen T25-Gewebekulturkolben und inkubieren Sie sie sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius. Am siebten Tag pipettieren Sie die Zellen alle 10 Minuten kräftig auf Eis und überprüfen Sie sie unter einem Mikroskop, bis sich die meisten Makrophagen lösen. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis.
Waschen Sie dann die Zellen mit eiskaltem PBS, um die restlichen Zellen zu lösen und verbinden Sie sie in der konischen Röhre. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300 g bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand und waschen und resuspendieren Sie das Pellet mit fünf Millilitern eiskaltem PBS.
Nachdem Sie das Röhrchen erneut zentrifugiert und den Überstand abgesaugt haben, resuspendieren Sie das endgültige Zellpellet in eiskaltem PBS, um eine Konzentration von 20 Millionen Zellen pro Milliliter zu erreichen. Füllen Sie die Lösung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie es auf Eis. Als nächstes überträgst du die vorbereiteten 15 Millionen Luciferase-positiven JeKo-Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Nach dem Zentrifugieren der JeKo-Zellen wird der Überstand abgesaugt. Resuspendieren Sie das Pellet in eiskaltem PBS auf eine Konzentration von 40 Millionen Zellen pro Milliliter. Mischen Sie nun die gleichen Volumina der Makrophagensuspension und der Tumorzellsuspension in einem frischen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Fügen Sie das gleiche Volumen der löslichen Basalmembranmatrix hinzu und mischen Sie es gründlich auf Eis. Mischen Sie zur Kontrolle die restlichen JeKo-Zellen mit dem gleichen Volumen PBS in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie das gleiche Volumen der löslichen Basalmembranmatrix hinzu und mischen Sie es auf Eis.
Nachdem Sie die Mäuse betäubt haben, legen Sie sie auf eine beheizte Bühne mit Nasenkegeln. Tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen der Mäuse auf, um Hornhautschäden zu vermeiden. Rasieren Sie die rechte Flanke jeder Maus, um die Haut freizulegen.
100 Mikroliter der JeKo Makrophagenmischung in eine 0,5 Milliliter Spritze geben und Luftblasen entfernen. Heben Sie die freiliegende Haut vorsichtig an und führen Sie die Nadel in den erhabenen Hautbereich ein, während Sie Fingerdruck auf die Stelle ausüben. Injizieren Sie die Zellen langsam in die Unterhautschicht und ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück.
Um den in vivo Einfluss immunsuppressiver Makrophagen zu bewerten, wurde die Progression der Tumorlast durch Biolumineszenz-Bildgebung in NSG-Mäusen verfolgt, die allein oder in Kombination mit differenzierten Makrophagen mit JeKo-Zellen transplantiert wurden. Das Vorhandensein von differenzierten Makrophagen beschleunigte die Tumorprogression in vivo deutlich, was durch eine signifikant höhere Tumorlast bei co-transplantierten Mäusen bis zum Tag 17 im Vergleich zu JeKo allein angezeigt wird.
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Übersicht
Diese Studie etabliert vereinfachte In-vitro- und In-vivo-Modelle, um die Auswirkungen menschlicher immunsupprimierender Makrophagen auf die anti-tumorale Aktivität von CAR-T-Zellen bei Mantelzell-Lymphom zu untersuchen. Diese Modelle sollen das Verständnis der Wechselwirkungen von Makrophagen im Tumormikromilieu verbessern und die Testung von Makrophagen-gerichteten Immuntherapien erleichtern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Onkologie
Hintergrund
- Menschliche Makrophagen spielen eine entscheidende Rolle im Tumormikromilieu.
- Aktuelle Modelle zur Untersuchung menschlicher myeloischer Zellen sind komplex und kostspielig.
- Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Makrophagen und CAR-T-Zellen ist entscheidend, um Immuntherapiestrategien zu verbessern.
- Bisherige Xenotransplantationsmodelle weisen Einschränkungen hinsichtlich Effizienz und Praktikabilität auf.
Zweck der Studie
- Entwicklung effizienterer Modelle zur Untersuchung der Interaktionen zwischen menschlichen Makrophagen und CAR-T-Zellen.
- Beurteilung der Rolle von Makrophagen im Kontext des Mantelzell-Lymphoms.
- Ermöglichung der Testung von Makrophagen-gerichteten Immuntherapien.
Verwendete Methoden
- Entwicklung von In-vitro-Modellen zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Makrophagen.
- Entwicklung von In-vivo-Modellen unter Verwendung vereinfachter Engraftment-Techniken.
- Beurteilung der Aktivität von CAR-T-Zellen in Gegenwart menschlicher Makrophagen.
- Bewertung potenzieller makrophagenzielgerichteter Therapien.
Hauptergebnisse
- Neue Modelle bieten einen zugänglicheren Ansatz, humane Makrophagen zu untersuchen.
- Nachgewiesene Interaktionen zwischen CAR-T-Zellen und humanen Makrophagen.
- Die Ergebnisse stützen das Potenzial makrophagenzielgerichteter Immuntherapien.
- Die Modelle können für weitere Forschungen in der Tumorimmunologie angepasst werden.
Schlussfolgerungen
- Die etablierten Modelle vertiefen das Verständnis der Rolle von Makrophagen in der Krebsentwicklung.
- Sie bieten einen praktischen Ansatz zur Testung neuer Immuntherapien.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um Behandlungsstrategien zu verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Resistenz gegen CAR-T-Zell-Therapien bei hämatologischen Malignitäten wird häufig durch immunsuppressive myeloische Zellen im Tumormikromilieu verursacht, wodurch nachhaltige klinische Ansprechen untergraben werden. Diese Studie stellt optimierte in-vitro- und in-vivo-Modelle vor, um den mechanistischen Einfluss menschlicher Makrophagen auf die Funktion von CAR-T-Zellen zu untersuchen, und geht damit direkt ein kritisches biologisches Risiko in der Immuntherapieentwicklung an. Diese Modelle ermöglichen es translationsorientierten Teams, makrophagenvermittelte Resistenzmechanismen zu entschärfen und die Entwicklung von auf Makrophagen abzielenden Kombinationstherapien zu unterstützen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der von Makrophagen vermittelten Suppression der CAR-T-Zell-Aktivität in krankheitsrelevanten Systemen.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem die Rolle myeloischer Zellen bei der therapeutischen Resistenz geklärt wird.
- Erleichtert die funktionelle Zielstrukturvalidierung für makrophagenmodulierende Wirkstoffe in Immuno-Onkologie-Portfolios.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet reproduzierbare Kokultur- und Xenotransplantationsmodelle zur quantitativen Beurteilung der Wirksamkeit von CAR-T-Zellen in Gegenwart immunsuppressiver Makrophagen.
- Ermöglicht eine standardisierte Bewertung von vielversprechenden Makrophagen-gerichteten Therapien für die kombinatorische Untersuchung.
- Unterstützt die Assay-Entwicklung zur Messung der Tumorlast und der Interaktionen zwischen Immunzellen mittels Biolumineszenz und Zellquantifizierung.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung präklinischer Modelle auf die Komplexität der menschlichen Tumormikroumgebung, indem humane Makrophagen in Xenotransplantatsysteme integriert werden.
- Ermöglicht die translationale Entdeckung von Biomarkern durch die Verfolgung des Tumorprogresses und der immunologischen Modulation in vivo.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Immuntherapeutika durch Modellierung klinisch relevanter Resistenzmechanismen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Modelle schließen die Lücke zwischen der frühen Entdeckung und der präklinischen Validierung, indem sie hypothesengeleitete Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen Makrophagen und CAR-T-Zellen sowie therapeutischer Interventionen ermöglichen.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Überprüfung der Nullhypothese zur Makrophagen-vermittelten CAR-T-Zell-Inhibition und die Aufklärung beteiligter Signalwege.
- Screening: Bietet quantitative und reproduzierbare Ergebnisse zum Vergleich therapeutischer Bedingungen in Kokultur- und Xenotransplantat-Assays.
- Analytik: Liefert Biolumineszenz- und Zellzählwerte zur Unterstützung der statistischen Analyse von Tumorlast und Immunzellfunktion.
- Translationale Forschung: Modelliert die Komplexität der menschlichen Tumorumgebung (TME) zur präklinischen Bewertung von Immuntherapiestrategien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt anpassungsfähige Plattformen für die kontinuierliche Evaluierung myeloidgerichteter und CAR-T-Zell-Therapien in verschiedenen Onkologieprogrammen bereit.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit hinsichtlich der Wirksamkeit von Immuntherapien, indem wichtige Resistenzmechanismen modelliert werden.
- Operationaler Wert: Vereinfacht präklinische Arbeitsabläufe durch vereinfachte, skalierbare In-vitro- und In-vivo-Systeme.
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über die Weiterentwicklung oder Einstellung von Kombinationsimmuntherapien, die auf die Tumormikroumgebung abzielen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten, die makrophagenvermittelte Resistenzmechanismen adressieren.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung, Differenzierung und Kokultur menschlicher Immunzellen.
- Benötigt Zugang zu immundefizienten Mausmodellen und einer Biolumineszenz-Bildgebungsausstattung für In-vivo-Studien.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Zellpräparation, dem Engraftment und den Auswerteprotokollen, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Die Anpassung an andere Tumormodelle oder Immunzelltypen kann eine Optimierung des Protokolls erfordern.
- Zu den Einschränkungen gehören die Effizienz des Engraftments und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Interpretation von Daten aus human-murinen Xenotransplantaten.
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