Name: Einzelmolekül-Fluoreszenz-Visualisierung der DNA-Polymerase-Dynamik an G-Quadruplexen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: Erfahren Sie, wie Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie die Dynamik von DNA-Polymerase Delta bei G-Quadruplex-Strukturen aufklärt. Diese Methode identifiziert einen neuen Austauschweg bei Replikationshindernissen.

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<ol><li>Sutton, M. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+DNA+polymerases%3A+Coordinating+DNA+replication%2C+DNA+repair%2C+and+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Managing DNA polymerases: Coordinating DNA replication, DNA repair, and DNA recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (15), 8342-8349 (2001).</li>
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<table><tbody><tr><td>100 nt Kontroll-DNA-Template</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td></td><td>Primäre Kontroll-Template in Primer-Verlängerungsassays</td></tr><tr><td>100 nt G4-bildende DNA-Vorlage</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>Primäre G4-bildende Vorlage in Primer-Verlängerungsassays</td></tr><tr><td>15 % Mini-PROTEAN TBE-Harnstoff-Gel, 12 Well, 20 & Mikro; L</td><td>Bio-Rad</td><td>4566055</td><td>Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>20 nt markiertes/biotinyliertes Primer-Oligonukleotid</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td></td><td>Erforderlich für die Primer-Verlängerung der 100-nt-Templates</td></tr><tr><td>22 nt Kontroll-DNA-Template</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td></td><td>Primäre Kontroll-Matrize in Zirkulardichroismus-Spektroskopie-Experimenten</td></tr><tr><td>22 nt G4-bildendes DNA-Template</td><td>Integrierte DNA Technologien</td><td></td><td>Primäres G4-bildendes Template in Zirkulardichroismus-Spektroskopie-Experimenten</td></tr><tr><td>24 x 24 mm Deckglas</td><td>Marienfeld Superior</td><td>100062</td><td>Erforderlich für die TIRF-Mikroskopie</td></tr><tr><td>3-Aminopropyltriethoxysilan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10668.22</td><td>Deckglas-Funktionalisierung</td></tr><tr><td>647 nm Laser</td><td>Kohärentes</td><td>1196627</td><td>Wählen Sie die Wellenlänge, um der Färbung/Färbung von Auswahl</td></tr><tr><td>670 nm Emissionsfilter</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET655lp</td><td>Stellt sicher, dass nur die relevanten Wellenlängen zum Detektor durchgelassen</td></tr><tr><td>werden Amersham Typhoon 5 biomolekularer Imager</td><td>Cytiva</td><td>29187191</td><td>Gelanalyse</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-PEG-SVA-5K-100MG</td><td>Deckglas-Funktionalisierung</td></tr><tr><td>Desoxynukleotide Triphosphat-Lösungsmischung</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-1005L</td><td>Bausteine für die Replikation</td></tr><tr><td>Digitales Trockenbad (115 V)</td><td>Bio-Rad</td><td>1660571</td><td>Heizlösungen</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td>Disulfidbindungsreduktion</td></tr><tr><td>EM-CCD-Kamera</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>Aufnahme von Einzelmolekül-Filmen</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>DNA-Denaturierung während Ensemble-DNA-Replikationsassays</td></tr><tr><td>Gasdichte Spritze, 1 mL</td><td>SGE</td><td>21964</td><td>Füllküvette für die Zirkulardichroismusspektroskopie</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop mit CFI Apo TIRF 100x Öl-Immersionsobjektiv</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>ermöglicht die Einzelmolekül-TIRF-Mikroskopie</td></tr><tr><td>J-810 Spektralphotometer</td><td>Jasco</td><td>J-810</td><td>Messung der Zirkulardichroismusspektroskopie</td></tr><tr><td>mPEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5K-100MG</td><td>Deckglas-Funktionalisierung</td></tr><tr><td>NanoDrop One Spektralphotometer</td><td>Thermofisher</td><td>Scientific ND-ONE</td><td>Messung von Protein- und Markierungskonzentrationen</td></tr><tr><td>NeutrAvidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Tethering von DNA-Templates an die funktionalisierten Deckgläser bei Einzelmolekül-Experimenten</td></tr><tr><td>Polyethylen-Schlauch</td><td>Instech</td><td>BTPE-60</td><td>Wird für den Bau von Durchflusszellen benötigt</td></tr><tr><td>Quarzküvette, 10 mm</td><td>Starna Scientific</td><td>1/Q/10/CD</td><td>Hält eine Probe für die Zirkulardichroismus-Spektroskopie</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Adelab Scientific</td><td>NE-1002X</td><td>Wird verwendet, um Puffer und Substrate durch eine mikrofluidische Durchflusszelle</td></tr><tr><td>zu fließen Tris-EDTA-Puffer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>93283</td><td>DNA-Lösungspuffer</td></tr><tr><td>Hefepolymerase & Delta;</td><td>Michael O'Donnell Lab</td><td></td><td>Replikation der DNA-Templates</td></tr><tr><td>Zeba Spin-Entsalzungssäule, 7 K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89882</td><td>Polymerase-Aufreinigung</td></tr></tbody></table>

einzelmolekül-fluoreszenz-visualisierung der dna-polymerase-dynamik an g-quadruplexen

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

Für diesen Assay wurden zwei DNA-Substrate mit einem fluoreszenzmarkierten 20-nt-Primer entworfen: eines mit einer G4-bildenden Sequenz (Abbildung 1A, links) und eines ohne diese Sequenz (Abbildung 1A, rechts). Um zu bestätigen, dass das G-Quadruplex ein wirksames Hindernis für die Polymeraseaktivität darstellt, wurde die DNA-Synthese durch Pol δ an einem denaturierenden PAGE-Gel überwacht. Die Aktivität des gereinigten markierten Pol-δ auf den DNA-Substraten wurde mittels Gelelektrophorese untersucht. Abbildung 1B (links) zeigt, dass das fluoreszenzmarkierte Pol δ nicht in der Lage ist, am G-Quadruplex vorbei zu synthetisieren. Vor Beginn der Synthese (t = 0 min) liegt eine Bande vor, die 20 nt entspricht und den markierten Primer darstellt, der aus dem Template-Strang denaturiert wurde. Nach 3 Minuten wurde diese 20-nt-Bande in eine 60-nt-Bande umgewandelt, was darauf hindeutet, dass die Synthese auf der gesamten DNA stattgefunden hat und bestätigt, dass die Polymerase vollständig durch die G-Quadruplex-Struktur blockiert wurde. Diese Blockierung impliziert, dass sich die Polymerase weder entfalten noch die Struktur umgehen konnte. Im Gegensatz dazu ergab die Synthese eines Kontroll-Templates, das die G-Quadruplex-bildende Sequenz nicht enthält (Abbildung 1A, rechts), nach 3 min eine 100-nt-Bande (Abbildung 1B, rechts).
Nach Bestätigung der Synthese an den Templates und der effizienten Blockierung durch das G-Quadruplex wurden diese Messungen an einem Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskop wiederholt, um das Verhalten der Polymerase zu überwachen. Die DNA-Templates wurden in einer mikrofluidischen Durchflusszelle an funktionalisierte Deckgläser gebunden (Abbildung 2A), und die Position jedes Substrats wurde durch Visualisierung des fluoreszenzmarkierten Primers bestimmt. Dann wurde markiertes Pol δ in Gegenwart von dNTPs geladen, um die Synthese zu initiieren. Innerhalb eines typischen FOV werden einzelne Spots verfolgt, um zu quantifizieren, wie oft Pol δ an die DNA bindet und von ihr dissoziiert (Abbildung 2B, C). Durch die Messung der Intensität als Funktion der Zeit an jedem DNA-Substrat können Einzelmolekül-Trajektorien erzeugt werden (Abbildung 2C, Ergänzende Abbildung 3). Gemessen werden kann die charakteristische "Verweildauer", also die durchschnittliche Dauer, in der Pol δ an die Vorlage gebunden bleibt. Für das G4-Substrat wurde die Verweilzeit mit 6 s ± 2 s bestimmt, während sie für das Kontrollsubstrat 10 s ± 3 s betrug (Abbildung 2D, Ergänzende Abbildung 4). Darüber hinaus kann für jede Trajektorie quantifiziert werden, wie oft Pol δ an das Template bindet. Die Anzahl der Bindungsereignisse an das G4-Substrat ist im Vergleich zum Kontroll-Template viel höher (Abbildung 2E). Während es Instanzen von mehr als einem Bindungsereignis in der Kontrollvorlage gibt, die auf schulische Bindung und Aufhebung der Bindung zurückzuführen sind, ist die Anzahl der Bindungsereignisse im Durchschnitt für die G4-bildende Vorlage deutlich gestiegen. Dies deutet darauf hin, dass die gebundene Polymerase nach dem Stoppen der Synthese durch das G-Quadruplex von der DNA dissoziiert, bevor neue Polymerasen aus der Lösung einen kontinuierlichen Zyklus der Bindung und Entbindung in Gang setzen. Daher bietet dieser Einzelmolekül-Assay einen beispiellosen Einblick in die Reaktion von DNA-Polymerasen auf DNA-Blockaden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Ensemble-Primer-Verlängerungsassay. (A) Schematische Darstellung der DNA-Substrate. Das G4-Substrat (links) enthält eine G-Quadruplex-bildende Sequenz, während das Kontrollsubstrat (rechts) dies nicht tut. (B) Ensemble-DNA-Primase-Extensions-Assay der geprimten G4- und Kontroll-DNA-Substrate, der zeigt, dass die fluoreszenzmarkierte Hefe Pol δ vollständig durch den G-Quadruplex blockiert wird. Das PAGE-Gel zeigt die Replikation der DNA-Templates im Laufe der Zeit, was zu einer Verschiebung des markierten 20-nt-Primers in das 60-nt-Produkt für das G4-Substrat (links) und das 100-nt-Produkt für das Kontroll-Template (rechts) führt. M stellt eine Leiter dar, die markierte 20 nt-, 60 nt- und 100 nt-Oligos enthält. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie. (A) Schematische Darstellung des Einzelmolekül-Primer-Verlängerungsassays unter Verwendung von AF647-markierter Hefe Pol δ. (B) Typisches FOV, das aus einem Einzelmolekül-Assay gewonnen wurde. Jeder Spot stellt eine fluoreszenzmarkierte Pol-δ dar, die an eine DNA-Matrize bindet. Maßstabsbalken: 10 μm. (C) (Oben) Beispielmolekül aus dem Einzelmolekül-Assay, das eine Ein-/Aus-Bindung zeigt, wenn der Pol δ austauscht. (Unten) Einzelmolekül-Trajektorie desselben Moleküls, die die Intensität über den Zeitverlauf des Experiments zeigt. Die schwarze Linie stellt das Hidden-Markov-Modell (HMM) dar, das an die Daten angepasst wurde. (D) Verweilzeit von Pol δ auf dem G4-Substrat (violett) und dem Kontrollsubstrat (grau). Die Linien stellen exponentielle Passungen dar, was eine Lebensdauer von 6 s ± 2 s auf dem G4-Substrat und 10 s ± 3 s auf dem Kontrollsubstrat ergibt. (E) Anzahl der Pol δ Bindungsereignisse an einzelne DNA-Substrate. Die mediane Anzahl der Bindungsereignisse auf dem G4-Substrat (violett) beträgt 3,5 im Vergleich zum Kontrollsubstrat 1 (grau). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: CD-Spektroskopie. CD-Spektren der G4-bildenden (violett) und Kontrollsequenz (grau) in TE-Puffer mit 200 mM KCl bei 25 °C. Der charakteristische Peak bei 260 nm, gefolgt vom negativen Peak bei 240 nm, ist charakteristisch für einen parallelen, intramolekularen GQ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%201%20(CD).pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Konstruktion der Durchflusszelle. (A) Schematische Darstellung der einzelnen Teile der Durchflusszelle. Der quadratische PDMS-Block befindet sich auf dem Deckglas des Mikroskops. Diese Teile werden dann im Deckel und Boden des Durchflusszellenhalters zusammengefügt. (B) Die komplette Durchflusszelle. In jede Seite des PDMS-Blocks können Röhrchen eingeführt werden, um die Kanäle zu bilden, durch die Puffer mittels Mikrofluidik durch das Gerät geleitet werden können. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%202%20(Flow%20Cell).pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 3: Trajektorien von Einzelmolekülen. (A) Beispiel für die Trajektorie eines Moleküls, das während des 10-minütigen Zeitrahmens des Experiments ein einzelnes Bindungsereignis durchläuft. (B) Beispiel für die Trajektorie eines Moleküls, das während des 10-minütigen Zeitrahmens des Experiments Null-Bindungsereignisse durchläuft. Die schwarze Linie in (A) und (B) stellt das an die Daten angepasste Hidden-Markov-Modell (HMM) dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%203%20(Extra%20Traces).pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 4: Verweilzeiten. (A) Verweilzeit von Pol δ auf dem G4-Substrat. Die Linie stellt die exponentielle Anpassung dar, die eine Lebensdauer von 6 s ± 2 s ergibt. (B) Verweilzeit von Pol δ auf dem Kontrollsubstrat. Die exponentielle Anpassung ergibt eine Lebensdauer von 10 s ± 3 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%204%20(Split%20Lifetimes).pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 5: Kontrolle des Photobleachings. Das Diagramm zeigt die durchschnittliche Zeit, die ein einzelnes AF647-markiertes Hefe-Pol-δ-Enzym benötigt, um mit dem 647-nm-Laser photogebleicht zu werden. Die Linie stellt die exponentielle Anpassung dar, was eine Lebensdauer von 39 ± 6 s ergibt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%205%20(Photobleaching%20Control).pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Visualisierung der DNA-Polymerase-Dynamik an G-Quadruplexen

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA ...

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