Name: In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2 / 3 der Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Lernen Sie die In-vivo-2-Photonen-Calcium-Imaging-Methode zur Aufzeichnung neuronaler Netzwerkaktivität in der Maus mit Einzelzellauflösung. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Erfassung dichter neuronaler Populationen.

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Wir möchten Olga Garaschuk für hilfreiche Diskussionen zur Optimierung der Bulk-Loading von Kalzium-Indikatoren bestätigen.

<ol><li> Bereiten Sie die fluoreszierenden Kalzium-Indikator-Lösung. Wir verwenden Acetoxymethylester Farb-oder AM Farbstoffe für kurze. Dies sind Farbstoffe, die von den Zellen aufgenommen werden können, wenn sie injiziert extrazellulär. Wir verwenden in der Regel Oregon-Green BAPTA-1 AM-oder Fluo-4 AM in einer Konzentration von 1 mM. AM Farbstoffe können von Invitrogen in 50 Mikrogramm Fläschchen erhältlich. Wir bereiten Sie zunächst eine 20% ige Lösung von Pluronic F-127 in DMSO. Wir erwärmen die Lösung vor Gebrauch jeden Tag bis zu seiner klar. Wir lösen das Kalzium-Indikator von 20% Pluronic F-127/DMSO für 15-20 Minuten zu einer Konzentration von 10 mM. Wir haben dann verdünnt die Lösung auf 1mm in einer Lösung mit, in mM: 150 NaCl, 2,5 KCl, 10 Hepes, pH 7,4. Darüber hinaus ist 100 uM Sulforhodamin 101 meist Label Astrozyten enthalten und visualisieren Sie die Pipette während der Injektion. Wir filtern die Lösung vor der Injektion mit einem 0,49 Mikron Zentrifugalfilter (Stosiek et al, 2003;.. Garaschuk et al, 2006). </li><li> Implant ein Schädel-Fenster über den Bereich abgebildet werden. Wir haben <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=680" target="_blank">den allgemeinen Ansatz in JoVE beschrieben</a> , aber die folgenden Änderungen sind für Calcium-Farbstoff Injektion wichtig: Machen Sie eine kleine Kraniotomie von 2 mm Durchmesser in den kortikalen Bereich des Interesses, wobei äußerste Sorgfalt nicht auf die zugrunde liegende Dura Schäden. Sichere einem Deckglas in Ort über die Kraniotomie, aber nur teilweise decken die Kraniotomie, noch ein kleiner Spalt zwischen dem Rand der Kraniotomie und das Deckglas, um Platz für eine Pipette zum Kortex schräg geben können. Vor der Injektion, machen Sie eine flache Wanne mit Zahnzement rund um die Kraniotomie. Das sollte gut zu verlängern, als rostral in Richtung und flach genug, um das Einführen der Mikropipette für die Injektion zu ermöglichen. </li><li> Übertragen Sie die Maus übertragen auf die Bühne des Mikroskops und Immobilisierung des Kopfes, wie in unserem gezeigt <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=678" target="_blank">video auf den Blutfluss Bildgebung</a> . </li><li> Pull Glas-Mikroelektrode Pipetten zu einem Spitzendurchmesser Nachgeben 2-4 Mega Ohm im Widerstand, mit einer Pipette Abzieher. Laden Sie die Kalzium-Indikator-Farbstoff-Mix auf der Glaspipette mit einer Mikroliterspritze. Mit einem Mikromanipulator, sanft niedriger der Mikropipette auf die Oberfläche des Gehirns mit einem 4X Ziel, die dann fein ist unter einem 40X-Objektiv positioniert. Wählen Sie einen geeigneten Standort für die Injektion, so dass es nur wenige oder gar keine darüber liegenden Blutgefäße zur Bildgebung im Dunkeln. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ist die Spitze der Pipette visualisiert und ging langsam in die Rinde, bis zu einer Tiefe von 200 Mikrometern unterhalb der Dura. Dann spritzen Druck der Farbstoff-Gemisch bei 10 PSI für 1 Minute mit einem Picospritzer. Wir liefern in der Regel zwei vor vier Injektionen des AM Calcium-Farbstoff-Mix, im Raum von etwa 200-300 Mikrometer voneinander getrennt. Diese Schüttgutfrachtraum Ansatz leicht überlappenden Injektionen sorgt dafür, dass eine Fläche so groß wie 600 x 600 Mikrometer ausreichend ist für Kalzium-Imaging gefärbt. Begin Bildgebung 1 Stunde nach der Injektion des AM Farbstoffmischung, um den Farbstoff zu verbreiten und sich von den Neuronen aufgenommen werden können. </li><li> Führen Sie in-vivo Zwei-Photonen-Imaging mit einer custom made Zwei-Photonen-Mikroskop mit einer Chameleon Ti-Saphir-Laser (abgestimmt auf 800-880 nm) und Cambridge Technology Galvanometerspiegeln. Wir erwerben von Bildern mit scanimage Software in Karel Svoboda Labor (Pologruto et al., 2003) entwickelt. Laser Power ist in der Regel deutlich unter 70 mW an der Probe. Gesamten Bereich Bilder erworben werden entweder mit einem 20fach (0,95 NA) oder 40X (0,8 NA) Olympus Ziele, bei 1,95-15,63 Frames pro Sekunde (512 x 256 Pixel bis 256 x 64 Pixel). Line-Scans bei 500 Hz erworben. Während der Aufnahme werden die Tiere unter leichtem Isofluran-Narkose (0,6-0,9%) gehalten werden, und sind auch bei 37 ° C mit einem Harvard Apparatus Temperature Control Device. Es wird darauf geachtet, die Atemfrequenz der Tiere so nah zu 100 Atemzüge / Minute wie möglich zu halten. Dieses Maß an Betäubung ist die unterste Ebene, dass das Tier bewegungsunfähig, aber immer noch erlaubt spontane Aktivität aufgezeichnet werden. </li></ol>

<ol><li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, (2006).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.%26nbsp%3B%26nbsp%3B+Biomed+Eng+Online+2%3A13%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.&nbsp;&nbsp; Biomed Eng Online 2:13.</a> Biomed Eng Online. 2, (2003).</li>
</ol>

Der Vorteil dieser Methode gegenüber elektrophysiologischen Ableitungen ist, dass sie weniger invasiv ist und erlaubt die Aufnahmen der Aktivität in neuronalen dichten neuronalen Netzen. Wenn Sie dieses Verfahren es ist wichtig, daran zu erinnern, extreme Vorsicht beim Ausführen der Kraniotomie nicht auf die Dauer beschädigen. Schon eine kleine Menge von subduralen Blutungen mit stark hinwegtäuschen Bildgebung.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green BAPTA1-AM</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>O-6807</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4- AM</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamin 101</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 in DMSO</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalfilter (0,45 Mikrometer)</td><td>Reagenz</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC3 0HV 0S</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo 2-photon calcium imaging in layer 2 / 3 der mäuse

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

Um zu verstehen, Netzwerk-Dynamik Mikroschaltungen in den Neocortex, ist es wichtig, gleichzeitig aufzeichnen die Aktivität einer großen Anzahl von Neuronen. In-vivo Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging ist die einzige Methode, dass man, um die Aktivität eines dichten neuronalen Population mit Single-Cell-Auflösung aufzeichnen können. Die Methode besteht in der Implantation eines Schädel-Bildgebung Fenster Injektion einer fluoreszierenden Kalzium-Indikator-Farbstoff, die sich durch eine große Anzahl von Neuronen genommen werden kann und schließlich die Aufnahme der Aktivität von Neuronen mit Zeitraffer-Kalzium-Imaging mit einem in-vivo Zwei-Photonen-Mikroskop. Co-Injektion von Astrozyten-spezifische Farbstoffe ermöglicht es, Neuronen aus Astrozyten differenzieren. Die Technik kann in Mäusen, die fluoreszierende Moleküle in bestimmten Subpopulationen von Neuronen zum besseren Verständnis der Netzwerk-Interaktionen der verschiedenen Gruppen von Zellen durchgeführt werden.

Um zu verstehen, Netzwerk-Dynamik Mikroschaltungen in den Neocortex, ist es wichtig, gleichzeitig aufzeichnen die Aktivität einer großen Anzahl von Neuronen. In-vivo Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging ist die einzige Methode, dass man, um die Aktivität eines dichten neuronalen Population mit Single-Cell-Auflösung aufzeichnen können.

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2 / 3 der Mäuse

Um die Netzwerkdynamik von Mikroschaltkreisen im Neokortex zu verstehen, ist es essenziell, die Aktivität einer großen Anzahl von Neuronen gleichzeitig aufzuzeichnen.

Um die Netzwerkdynamik von Mikroschaltkreisen in der Neokortex zu verstehen, ist es unerlässlich, die Aktivität einer großen Anzahl von Neuronen gleichzeitig aufzuzeichnen. In vivo ist die Kalzium-Bildgebung die einzige Methode, die es ermöglicht, die Aktivität einer dichten neuronalen Population mit Einzelzellauflösung zu erfassen.Die Methode besteht darin, ein Schädel-Imaging-Fenster zu implantieren, einen fluoreszierenden Kalziumfarbstoff zu injizieren, der von einer großen Anzahl von Neuronen aufgenommen werden kann, und abschließend die Aktivität der Neuronen mittels zeitraffenden Kalzium-Imagings aufzuzeichnen. Hallo, ich bin Payman Go aus dem Labor von Carlos Portera-Caio in der Abteilung für Neurologie an der David Geffen School of Medicine der UCLA. In früheren Videos demonstrierte unser Labor ein Verfahren zur Durchführung einer Kraniotomie und zur Zwei-Photonen-Bildgebung der Durchblutung bei Mäusen.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung der in-vivo-Zwei-Photonen-Calcium-Bildgebung bei Mäusen. Bevor wir beginnen, muss die Farbstoffinjektionslösung hergestellt werden.Bereiten Sie zunächst die fluoreszierende Kalziumindikatorlösung vor. Wir verwenden Ethyles

in-vivo-2-photon-calcium-imaging-in-layer-23-of-mice

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in Nervenzellen sind essentiell für die Fähigkeit des Gehirns, in Reaktion auf Verhaltensstörungen Herausforderungen anzupassen.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

Hier beschreiben wir die in Zwei-Photonen-Bildgebung von Maus Cortex während Verhalten in einer Umgebung der virtuellen Realität beteiligt experimentellen Verfahren.

Zwei-Photonen-Calcium Imaging in Mäuse Navigieren in einer Virtual-Reality-Umgebung

Zeitraffer-Bildgebung am lebenden Tier liefert wertvolle Informationen über die strukturelle Reorganisation im intakten Gehirn. Hier stellen wir ein verdünntes Schädelpräparat vor, das die transkranielle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Strukturen in der lebenden Mausrinde mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Hier stellen wir ein Verfahren zur Durchführung einer großformatigen Ca 2+ -Bildgebung mit zellulärer Auflösung über mehrere kortikale Schichten in frei beweglichen Mäusen vor. Hunderte von aktiven Zellen können gleichzeitig mit einem Miniatur-, Kopf-Mikroskop gekoppelt mit einer implantierten Prismensonde beobachtet werden.

Mehrschicht-Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging in frei beweglichen Mäusen mit Prisma-Sonden und miniaturisierte Fluoreszenzmikroskopie

Wir präsentieren eine in Vivo zwei-Photon imaging-Protokoll für die Belichtung der Hirnrinde des Neugeborenen Mäusen. Diese Methode ist geeignet für die Analyse der Entwicklungs Dynamik der kortikalen Neuronen, die molekularen Mechanismen, die die neuronale Dynamik und die Veränderungen in der neuronalen Dynamik in Krankheitsmodellen steuern.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Diese Methode beschreibt eine chronische Zubereitung, die den optischen Zugang zum Hippocampus lebender Mäuse ermöglicht. Dieses Präparat kann verwendet werden, um längsinale optische Bildgebung der neuronalen strukturellen Plastizität und aktivitätsbeschworenen zellulären Plastizität über einen Zeitraum von mehreren Wochen durchzuführen.

Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

Wir präsentieren ein Protokoll, um das Hirnstamm der erwachsenen Maus von der ventralen Seite zu entlarven. Durch die Verwendung einer Gradienten-Refraktiven Indexlinse mit einem Miniaturmikroskop kann die Kalzium-Bildgebung verwendet werden, um die Aktivität von minderwertigen oliv-neuralen Somata nin vivo zu untersuchen.

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur chronischen in vivo Beobachtung der ruhenden Mikroglia im Hippocampus CA1 der Maus mittels präzise kontrollierter Chirurgie und Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Im lebenden Organismus Chronische Zwei-Photonen-Bildgebung von Mikroglia im Hippocampus der Maus

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das die Adeno-assoziierte Virusinjektion mit der Implantation eines Schädelfensters kombiniert, um die Dynamik der Mikroglia und die neuronale Aktivität in wachen Mäusen simultan abzubilden.

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung eines großen (6 x 3 mm2) Schädelfensters mit Lebensmittelverpackung, transparentem Silikon und Deckglas. Dieses Schädelfenster ermöglicht in vivo Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebungsexperimente in derselben Maus.

Im lebenden Organismus Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung einer Maus mit einem großen Schädelfenster

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Bildgebung von Kalziumantworten im Colliculus superior (SC) von wachen Mäusen, einschließlich der Abbildung der Aktivität einzelner Neuronen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie, während der Kortex bei Wildtyp-Mäusen intakt bleibt, und der Abbildung des gesamten SC mit Weitfeldmikroskopie bei Mäusen mit Teilkortex-Mutante.

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

Lernen Sie die In-vivo-2-Photonen-Calcium-Imaging-Methode zur Aufzeichnung neuronaler Netzwerkaktivität in der Maus mit Einzelzellauflösung. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Erfassung dichter neuronaler Populationen.

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2 / 3 der Mäuse

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