Name: Im lebenden Organismus Überwachung der transkriptionellen Aktivität während des metabolischen Übergangs mit einem biolumineszierenden Reporter in Hefe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Überwachung transkriptioneller Aktivität in Hefe während des metabolischen Übergangs mit einem biolumineszierenden Reporter. Diese Methode ermöglicht Echtzeitanalysen für fermentationsbiologische Anwendungen.

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<ol><li>Salinas, F., Rojas, V., Delgado, V., López, J., Agosin, E., Larrondo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+light-oxygen-voltage+domains+for+optogenetic+control+of+gene+expression+and+flocculation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Fungal light-oxygen-voltage domains for optogenetic control of gene expression and flocculation in yeast.</a> mBio. 9 (4), e00626-e00718 (2018).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Perez-Samper, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crabtree+Effect+shapes+the+Saccharomyces+cerevisiae+lag+phase+during+the+switch+between+different+carbon+sources%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The Crabtree Effect shapes the Saccharomyces cerevisiae lag phase during the switch between different carbon sources.</a> mBio. 9 (5), e01331-e01418 (2018).</li>
<li>Vermeersch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+duration+of+the+microbial+lag+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">On the duration of the microbial lag phase.</a> Curr Genet. 65 (3), 721-727 (2019).</li>
<li>New, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+catabolite+repression+optimize+growth+in+stable+and+variable+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Different levels of catabolite repression optimize growth in stable and variable environments.</a> PLoS Biol. 12 (1), e1001764(2014).</li>
<li>Molinet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+diauxic+shift+between+Patagonian+Saccharomyces+eubayanus+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Natural variation in diauxic shift between Patagonian Saccharomyces eubayanus Strains.</a> mSystems. 7 (6), e0064022(2022).</li>
<li>Libkind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe+domestication+and+the+identification+of+the+wild+genetic+stock+of+lager-brewing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Microbe domestication and the identification of the wild genetic stock of lager-brewing yeast.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (35), 14539-14544 (2011).</li>
<li>Peris, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+ancestries+of+lager-brewing+hybrids+were+shaped+by+standing+variation+in+the+wild+yeast+Saccharomyces+eubayanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Complex ancestries of lager-brewing hybrids were shaped by standing variation in the wild yeast Saccharomyces eubayanus.</a> PLoS Genet. 12 (7), e1006155(2016).</li>
<li>Mardones, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+beer+wort+fermentation+diversity+across+natural+Saccharomyces+eubayanus+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of beer wort fermentation diversity across natural Saccharomyces eubayanus isolates.</a> Microb Biotechnol. 13 (4), 1012-1025 (2020).</li>
<li>Brickwedde, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((physiological+and+regulatory+analysis+of+maltose+transporter+genes+in+Saccharomyces+eubayanus+CBS+12357T%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">physiological and regulatory analysis of maltose transporter genes in Saccharomyces eubayanus CBS 12357T.</a> Front Microbiol. 9, 1786(2018).</li>
<li>Brouwers, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recombination+of+Saccharomyces+eubayanus+maltose-transporter+genes+yields+a+chimeric+transporter+that+enables+maltotriose+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo recombination of Saccharomyces eubayanus maltose-transporter genes yields a chimeric transporter that enables maltotriose fermentation.</a> PLoS Genet. 15 (4), e1007853(2019).</li>
<li>Meurer, M., Chevyreva, V., Cerulus, B., Knop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulatable+MAL32+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+characteristics+and+tools+to+facilitate+its+use%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">The regulatable MAL32 promoter in Saccharomyces cerevisiae: characteristics and tools to facilitate its use.</a> Yeast. 34 (1), 39-49 (2017).</li>
<li>Mashruwala, A. A., Boyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+of+plasmids+using+yeast+recombinational+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">De novo assembly of plasmids using yeast recombinational cloning.</a> Methods Mol Biol. 1373, 33-41 (2016).</li>
<li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Baker, E. P., Hittinger, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+novel+chimeric+maltotriose+transporter+in+Saccharomyces+eubayanus+from+parent+proteins+unable+to+perform+this+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Evolution of a novel chimeric maltotriose transporter in Saccharomyces eubayanus from parent proteins unable to perform this function.</a> PLoS Genet. 15 (4), e1007786(2019).</li>
<li>Nespolo, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Out-of-Patagonia+migration+explains+the+worldwide+diversity+and+distribution+of+Saccharomyces+eubayanus+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An Out-of-Patagonia migration explains the worldwide diversity and distribution of Saccharomyces eubayanus lineages.</a> PLoS Genet. 16 (5), e1008777(2020).</li>
<li>Hohnholz, R., Pohlmann, K. J., Achstetter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+plasmid+architecture+on+stability+and+yEGFP3+reporter+gene+expression+in+a+set+of+isomeric+multicopy+vectors+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Impact of plasmid architecture on stability and yEGFP3 reporter gene expression in a set of isomeric multicopy vectors in yeast.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 101 (23-24), 8455-8463 (2017).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+efficient+expression+using+heterologous+GAL+promoters+and+transcriptional+activators+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering an efficient expression using heterologous GAL promoters and transcriptional activators in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synth Biol. 12 (6), 1859-1867 (2023).</li>
<li>Calvey, C. H., Willis, L. B., Jeffries, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transformation+protocol+for+Lipomyces+starkeyi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">An optimized transformation protocol for Lipomyces starkeyi.</a> Curr Genet. 60 (3), 223-230 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ampicillin, Natriumsalz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11593027</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>H-270-1</td><td></td></tr><tr><td>L-Luciferin</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>L-127-10</td><td></td></tr><tr><td>Maltose-Monohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47288</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Plus PCR Master</td><td>Mix ThermoFisher Scientific</td><td>F631S</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 PRO M</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA-Purirfizierungssystem</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep Hefe Plasmid Miniprep I</td><td>Zymo Research</td><td>D2001</td><td></td></tr></tbody></table>

im lebenden organismus Überwachung der transkriptionellen aktivität während des metabolischen Übergangs mit einem biolumineszierenden reporter in hefe

In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

Die folgenden Ergebnisse zeigen die Eignung des neu konstruierten lumineszierenden Reporters zur Überwachung des Glukose-zu-Maltose-Übergangs in Hefezellen in einem fermentativen Prozess. Die Reporterplasmide werden zunächst unter Verwendung der Hefe-Rekombinationskolonierung13 assembliert, um episomale Reporterkonstrukte zu erzeugen. Dieser Prozess erfordert eine Überlappung der Nukleotidsequenz von mindestens 30 Nukleotiden zwischen den verschiedenen Amplikons, die alle in A...

Im lebenden Organismus Überwachung der transkriptionellen Aktivität während des metabolischen Übergangs mit einem biolumineszierenden Reporter in Hefe

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is ...

in-vivo-monitoring-transcriptional-activity-during-metabolic

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Hier beschreiben wir die Methoden zu konstruieren, zu visualisieren und zu quantifizieren Biolumineszenzreaktionen sowohl Glühwürmchen und Renilla Luciferase Enzymen bei metastasierendem Brustkrebs-Zellen während deren Wachstum und Metastasierung...

In vivo Dual-Substrat Bioluminescent Imaging

Circadiane Uhren funktionieren innerhalb einzelner Zellen, dh sie sind zellautonome. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Zell-autonome Uhrenmodelle mit nicht-invasiven, Luciferase-basierte Echtzeit-Biolumineszenz-Technologie. Reporter Zellen bereitzustellen gefügig, funktionales Modell für das Studium zirkadianen Biologie.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren für die Durchführung...

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Wir beschreiben die Verwendung von zwei ratiometrischen, genetisch kodierte Biosensoren, die auf GFP basieren, zu mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in subzellulären Auflösung in lebenden Hefezellen überwachen.

Ratiometric Biosensors, dass die mitochondriale Redox Staats-und ATP in lebenden Hefezellen Messen

Zwei komplementäre Verfahren basierend auf Durchflusszytometrie und Mikroskopie vorgestellt, die die Quantifizierung auf der Ebene einer einzelnen Zelle, die Dynamik der Genexpression durch die Aktivierung eines MAPK-Weg in Hefe induziert ermöglichen.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren für die schnelle Konstruktion von künstliche Transkriptionsfaktoren (ATF) mit zugehörigen GFP-Reporter und Quantifizierung des ATF Fähigkeit GFP-Expression mittels Durchflusszytometrie stimulieren.

Rapid-Synthese und Screening von Chemisch aktivierte Transkriptionsfaktoren mit GFP-basierte Reporter

Es wird ein Protokoll für den in vivo Nachweis der Wirkungen von mitochondrialen Inhibitoren im Modellorganismus Caenorhabditis elegans und für die Identifizierung potenziell verstärkender Verbindungen beschrieben. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Arzneimittelbibliotheken auf Verbindungen zu untersuchen, die die mitochondriale Funktion modulieren.

Ein screenbaren<em&gt; In-vivo-</em&gt; Assay für Mitochondriale Modulatoren Verwendung transgener Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Ein in-vitro- Biolumineszenz-Assay zellulären zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen bestimmen wird vorgestellt. Diese Methode nutzt Säugerzelle Reporter Plasmide destabilisierte Luciferase unter der Kontrolle des Veranstalters Periode 2 gen zum Ausdruck zu bringen. Es kann zu anderen Zelltypen auszuwertende Organ-spezifischen Auswirkungen auf die zirkadianen Rhythmus angepasst werden.

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit RNA-Seq, um mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der hypoxischen Antwort von S. Cerevisiae Zellen zu überwachen. Diese Methode kann zu analysieren, gen-Expression in eine zelluläre Reaktion angepasst werden.

Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort

Neurale Stamm-/Vorläuferzellen weisen verschiedene Expressionsdynamiken von Notch-Signalkomponenten auf, die zu unterschiedlichen Ergebnissen zellulärer Ereignisse führen. Eine solche dynamische Expression kann durch Echtzeitüberwachung und nicht durch statische Analyse mit einem hochempfindlichen Biolumineszenz-Bildgebungssystem, das die Visualisierung schneller Veränderungen von Genausdrücken ermöglicht, aufgedeckt werden.

Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der murinen Neurogenese

Zirkadiane Rhythmen, die in den meisten Organismen vorkommen, regulieren die zeitliche Organisation biologischer Prozesse. 3D-Organoide haben sich in jüngster Zeit als physiologisch relevantes In-vitro-Modell herauskristallisiert. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von biolumineszierenden Reportern zur Beobachtung zirkadianer Rhythmen in Organoiden, was in vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen ermöglicht.

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Erfahren Sie die Überwachung transkriptioneller Aktivität in Hefe während des metabolischen Übergangs mit einem biolumineszierenden Reporter. Diese Methode ermöglicht Echtzeitanalysen für fermentationsbiologische Anwendungen.

Im lebenden Organismus Überwachung der transkriptionellen Aktivität während des metabolischen Übergangs mit einem biolumineszierenden Reporter in Hefe (Video) | JoVE Journal

Im lebenden Organismus Überwachung der transkriptionellen Aktivität während des metabolischen Übergangs mit einem biolumineszierenden Reporter in Hefe

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