Name: Spatel Montevideo Gerät für die Vitrifizierung von Säugetierembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Vitrifizierung von Maus- und Schafembryonen mit dem Spatel-Montevideo-Protokoll. Diese kostengünstige Methode mit selbstgefertigten Werkzeugen ermöglicht reproduzierbare Kryokonservierung in der Reproduktionsbiologie.

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Tiere, die zur Gewinnung von Mausembryonen verwendet wurden, wurden gemäß dem nationalen Gesetz 18.611 und den internationalen Tierhaltungsrichtlinien11 untergebracht und behandelt. Das Versuchsprotokoll (Genehmigungsnummer #007-18) wurde zu gegebener Zeit vom Ausschuss für Tierpflege und -verwendung des Institut Pasteur de Montevideo genehmigt (schriftliche Zustimmung). Die Versuchsprotokolle für Eizellen/Embryonen von Schafen wurden vom Institutional Animal Care Committee Fundación IRAUy (Protokoll #001-2017) genehmigt, die den ARRIVE-Richtlinien12 entsprechen und in Übereinstimmung mit den internationalen Tierhaltungsrichtlinien11 durchgeführt wurden.
1. Vitrifikation (Abbildung 2)
<ol>
	<li>Spatel MVD Vorbereitung<ol>
		<li>Kürzen Sie die Spitze des Gelladers (siehe Materialtabelle), indem Sie die ersten 10 mm und den Spitzenkegel abschneiden. HINWEIS: Dadurch entsteht eine kürzere, gerade Spitze, die die endgültige Versiegelung mit dem 0,5-ml-Strohhalm erleichtert (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Halten Sie das Ende der Gelladerspitze mit der Pinzette #5 des Uhrmachers (siehe Materialtabelle) ca. 1,0 cm von der Spitze entfernt. Legen Sie die Spitze vorsichtig in die Flamme eines Bunsenbrenners (siehe Materialtabelle) und halten Sie sie 8-10 s lang, um eine blütenblattartige Plattform von ca. 1 mm2 zu bilden.</li>
		<li>Von der Flamme nehmen und mit der Pinzette 5 s fest halten.</li>
		<li>Überprüfen Sie mit einem Stereomikroskop (siehe Materialtabelle), ob die blütenblattartige Plattform (~ 1 mm2) gebildet und der distale Rand versiegelt ist. HINWEIS: Die Plattform muss am distalen Ende geschlossen werden, um eine Infiltration von LN2 während der Vitrifikation zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Plattform sauber und frei von Kunststofffäden ist. Wenn es zu klein ist oder Fäden hat, schneiden Sie die Spitze ab und wiederholen Sie den Vorgang.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.1.1-1.1.4, um die erforderliche Anzahl von Spateln vorzubereiten (1 Spatel = bis zu 40 Mausembryonen).</li>
		<li>Sterilisieren Sie die Spatel mit ultravioletten (UV) Strahlen oder Ethylenoxid und bewahren Sie sie in einer sterilen Tube oder Box auf.</li>
		<li>Nehmen Sie am Tag der Vitrifikation die Spatel und berühren Sie sie vom gegenüberliegenden Ende der Plattform. Führen Sie in jeden Spatel einen Identifikationsstab (siehe Materialtabelle) ein und legen Sie ihn auf die Stereomikroskopbasis. Beschriften Sie den Stab mit einem Permanentmarker oder einem Aufkleber mit flüssigem Stickstoff. HINWEIS: Vermeiden Sie immer, die Plattform zu berühren, wenn Sie mit den Spateln hantieren. Die Gesamtlänge des gesamten Geräts (Spatel + 0,5 ml Strohhalm + Identifikationsstab) sollte nicht mehr als 1 cm der Länge des Bechers überschreiten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Herstellung von Vitrifikationslösungen<ol>
		<li>Bereiten Sie die FS-Lösung vor: Lösen Sie 1,5 g Dichtegradientenmedium (siehe Materialtabelle) und 0,85 g Saccharose (siehe Materialtabelle) in 5 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; siehe Materialtabelle). In einem kochenden Wasserbad erhitzen, bis es sich vollständig aufgelöst hat, dann mit einem 0,22-μm-Filter sterilisieren (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Diese Lösung kann bis zu 6 Monate bei 4 °C gelagert werden.</li>
		<li>Bereiten Sie die Vor-Vitrifikationslösung (PV) vor: Mischen Sie am Tag der Vitrifikation 10 % Ethylenglykol (siehe Materialtabelle), 10 % Dimethylsulfoxid (siehe Materialtabelle) und 80 % M2 Medium (siehe Materialtabelle). Für 5 Spatel wird ein Gesamtvolumen von 100 μL benötigt.</li>
		<li>Bereiten Sie die Vitrifikationslösung (V) vor: Mischen Sie am Tag der Vitrifikation 15 % Ethylenglykol, 15 % Dimethylsulfoxid, 10 % M2 Medium und 60 % FS-Lösung. Für 5 Spatel wird ein Gesamtvolumen von 100 μL benötigt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dehydrierung und Vitrifikationsprozess des Embryos<ol>
		<li>LN2 vorbereiten: Gießen Sie LN2 in ein geeignetes Gefäß (z. B. einen isolierten Styroporbehälter von 10 cm x 30 cm x 20 cm) und legen Sie so viele 0,5-ml-Strohhalme wie Spatel zur Verwendung. HINWEIS: Um die Visualisierung der Spachtelplattform während der Manipulation unter LN2 zu erleichtern, wird empfohlen, einen farbigen, bodenisolierten Polystyrolbehälter zu verwenden, um einen Kontrasteffekt zu erzielen. ACHTUNG: Tragen Sie beim Umgang mit LN2 eine geeignete Schutzbrille und Handschuhe (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Lösungen vorbereiten: Geben Sie die folgenden Tropfen auf eine 100-mm-Petrischale aus Kunststoff (siehe Materialtabelle): 100 μl M2, 20 μl PV-Lösung und 20 μl V-Lösung für jeden Spatel.</li>
		<li>Vitrifizierende Embryonen: Legen Sie die zu vitrifizierenden Embryonen in den M2-Tropfen. Behandeln Sie 30-40 Embryonen auf einmal, inkubieren Sie sie 30 s lang in der PV-Lösung und dann weitere 30 s bei Raumtemperatur (RT) in der V-Lösung.</li>
		<li>Verwenden Sie eine gezogene Glaskapillare (siehe Materialtabelle) mit einer Aspiratorrohrbaugruppe (siehe Materialtabelle). Belasten Sie die Kapillare mit mindestens 1 μl der jeweiligen Lösung, bevor Sie die Embryonen einsetzen. HINWEIS: Die Embryonen befinden sich in den Tropfen auf unterschiedlichen Höhen, stellen Sie also das Stereomikroskop-Mikrometer ein, um sie zu lokalisieren. Entnehmen Sie Embryonen aus jedem Tropfen, wenn noch 10 s übrig sind. Alle Manipulationen an Embryonen müssen unter dem Stereomikroskop durchgeführt werden.</li>
		<li>Embryonen laden: Aspirieren Sie die Embryonen mit minimaler V-Lösung (z. B. ~ 0,1 μL) und legen Sie sie schnell auf die Spatelplattform.</li>
		<li>Eintauchen in LN2: Nach dem Laden der Embryonen tauchen Sie die Spatelplattform sofort für 5 s in LN2 ein (halten Sie den Spatel mit der Hand, an seinem Stab). Halten Sie den Spatel dann in LN2-Dämpfen und verschließen Sie ihn mit einem 0,5-ml-Strohhalm mit einer langen Pinzette aus Edelstahl (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Entfernen Sie LN2 vor dem Versiegeln aus dem Strohhalm, um eine Ausdehnung während der Erwärmung zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass der Spatel und der Strohhalm richtig ausgerichtet sind, um einen Kontakt zwischen dem Embryotropfen und der Strohhalmwand zu vermeiden. Der Einfachheit halber können versiegelte Spatel im LN2-Behälter verbleiben, bis alle Spatel mit Embryonen beladen sind, und bei Bedarf mit LN2 nachgefüllt werden.</li>
		<li>Wiederholen Sie das Verfahren: Wiederholen Sie die Schritte 1.3.3 bis 1.3.7 für jede Gruppe von Embryonen mit einem frischen Paar PV- und V-Tropfen.</li>
		<li>Lagerung: Füllen Sie den Spachtel in Becher (siehe Materialtabelle) und dann in einen LN2 Lagerdewar (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Schema des Vitrifikationsprozesses mit Spatel MVD. Weitere Informationen finden Sie im Text. Erstellt in BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/x96y902. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
2. Erwärmung (Abbildung 3)
<ol>
	<li>Vorbereitung der Lösung<ol>
		<li>Bereiten Sie eine 1 M Saccharoselösung vor, die 0,85 g Saccharose in 2,5 ml M2-Medium auflöst. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter. HINWEIS: Diese Lösung kann bis zu 1 Woche bei 4 °C zubereitet und gelagert werden.</li>
		<li>Bereiten Sie 0,5 M und 0,25 M Saccharoselösungen vor, indem Sie die 1 M Saccharoselösung mit dem entsprechenden Volumen M2 Medium verdünnen.</li>
		<li>Die Saccharoselösungen auf einer heißen Platte (siehe Materialtabellen) bis zum Beginn der Erwärmung bei 37 °C halten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung der Warmhalteplatte<ol>
		<li>Geben Sie auf eine 100 mm Petrischale aus Kunststoff die folgenden Lösungstropfen: einen 500 μl Tropfen 0,5 M Saccharose, einen 50 μl Tropfen 0,5 M Saccharose und einen 50 μl Tropfen 0,25 M Saccharose für jeden zu erwärmenden Spatel. Geben Sie drei Tropfen M2 Medium (je 100 μl) zum Waschen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prozess der Erwärmung HINWEIS: Der Erwärmungsprozess findet bei RT, z.B. 20-22 °C, an der Basis eines Stereomikroskops statt.<ol>
		<li>Nehmen Sie die versiegelten Spachtel aus dem Dewar. Platzieren Sie sie in einem geeigneten Behälter mit LN2. Siehe Abbildung 3.</li>
		<li>Legen Sie die Warmhalteplatte auf das Stereomikroskop. Halten Sie den Boden des Spatels nacheinander mit einer Edelstahlpinzette fest und ziehen Sie mit einer behandschuhten Hand den Identifikationsstab und dann den Strohhalm heraus. Tauchen Sie die Plattform mit den Embryonen schnell in den 0,5 M Saccharosetropfen von 500 μl.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass alle Embryonen in den Tropfen gefallen sind. Bewegen Sie den Spatel bei Bedarf vorsichtig, um das Lösen zu erleichtern. Laden Sie die Embryonen in eine gezogene Glaskapillare, legen Sie sie in den 50-μl-Tropfen 0,5 M Saccharoselösung und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang.</li>
		<li>Legen Sie die Embryonen in den 50 μl Tropfen 0,25 M Saccharoselösung und inkubieren Sie weitere 2 Minuten. HINWEIS: Bevor Sie die Embryonen in jede Lösung legen, laden Sie die Kapillare mit der zu verwendenden Lösung.</li>
		<li>Zum Schluss waschen Sie die Embryonen dreimal in verschiedenen Tropfen M2-Medium, um die Saccharose zu entfernen.</li>
		<li>Die Embryonen werden vor der Verwendung mindestens 1 Stunde lang unter für jede Art geeigneten Bedingungen inkubiert.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Schema des Spatel-MVD-Erwärmungsprozesses. Weitere Informationen finden Sie im Text. Erstellt in BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/k91k191. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<ol><li>Crispo, M., Meikle, M. N., Rülicke, T. Cryopreservation of Valuable Mouse and Rat Lines. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrispo%2C+M+%22Rodent+Quality+Control%3A+Genes+and+Bugs.+Laboratory+Animal+Science+and+Medicine%22">Rodent Quality Control: Genes and Bugs. Laboratory Animal Science and Medicine</a>. , Springer. Cham. (2024).</li>
<li>Lloyd, K., Franklin, C., Lutz, C., Magnuson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility%3A+use+mouse+biobanks+or+lose+them%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reproducibility: use mouse biobanks or lose them.</a> Nature. 522 (7555), 151-153 (2015).</li>
<li>Hart-Johnson, S., Mankelow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archiving+genetically+altered+animals%3A+a+review+of+cryopreservation+and+recovery+methods+for+genome-edited+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Archiving genetically altered animals: a review of cryopreservation and recovery methods for genome-edited animals.</a> Lab Anim. 56 (1), 26-34 (2022).</li>
<li>Shaw, J. M., Jones, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminology+associated+with+vitrification+and+other+cryopreservation+procedures+for+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Terminology associated with vitrification and other cryopreservation procedures for oocytes and embryos.</a> Hum Reprod Update. 9 (6), 583-605 (2003).</li>
<li>Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of oocytes and embryos.</a> Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).</li>
<li>dos Santos Neto, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryotolerance+of+Day+2+or+Day+6+in+vitro+produced+ovine+embryos+after+vitrification+by+Cryotop+or+Spatula+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryotolerance of Day 2 or Day 6 in vitro produced ovine embryos after vitrification by Cryotop or Spatula methods.</a> Cryobiology. 70 (1), 17-22 (2015).</li>
<li>Renard, J. P., Babinet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+survival+of+mouse+embryos+after+rapid+freezing+and+thawing+inside+plastic+straws+with+1-2+propanediol+as+cryoprotectant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">High survival of mouse embryos after rapid freezing and thawing inside plastic straws with 1-2 propanediol as cryoprotectant.</a> J Exp Zool. 230 (3), 443-448 (1984).</li>
<li>Tsang, W. H., Chow, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+cryopreservation+utilizing+a+novel+high-capacity+vitrification+spatula%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo cryopreservation utilizing a novel high-capacity vitrification spatula.</a> Biotechniques. 46 (7), 550-552 (2009).</li>
<li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos%3A+the+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).</li>
<li>Nakao, K., Nakagata, N., Katsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+vitrification+procedure+for+cryopreservation+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient vitrification procedure for cryopreservation of mouse embryos.</a> Exp Anim. 46 (3), 231-234 (1997).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).</li>
<li>du Sert, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARRIVE+guidelines+2.0%3A+Updated+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biol. 18 (7), e3000410(2020).</li>
<li>Meikle, M. N., Schlapp, G., Menchaca, A., Crispo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+volume+Spatula+MVD+vitrification+method+improves+embryo+survival+compared+to+traditional+slow+freezing%2C+both+for+in+vivo+and+in+vitro+produced+mice+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Minimum volume Spatula MVD vitrification method improves embryo survival compared to traditional slow freezing, both for in vivo and in vitro produced mice embryos.</a> Cryobiology. 84, 77-81 (2018).</li>
<li>Momozawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+vitrification+of+mouse+embryos+using+the+Kitasato+Vitrification+System+as+a+novel+vitrification+device%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Efficient vitrification of mouse embryos using the Kitasato Vitrification System as a novel vitrification device.</a> Reprod Biol Endocrinol. 15 (1), 29(2017).</li>
<li>Stringfellow, D. A., Givens, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStringfellow%2C+DA+%22Manual+of+the+International+Embryo+Transfer+Society%3A+A+Procedural+Guide+and+General+Information+for+the+use+of+Embryo+Transfer+Technology+Emphasizing+Sanitary+Procedures%22">Manual of the International Embryo Transfer Society: A Procedural Guide and General Information for the use of Embryo Transfer Technology Emphasizing Sanitary Procedures</a>. , International Embryo Transfer Society. (2010).</li>
<li>Dos Santos-Neto, P. C., Cuadro, F., Barrera, N., Crispo, M., Menchaca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+survival+and+birth+rate+after+minimum+volume+vitrification+or+slow+freezing+of+in+vivo+and+in+vitro+produced+ovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Embryo survival and birth rate after minimum volume vitrification or slow freezing of in vivo and in vitro produced ovine embryos.</a> Cryobiology. 78, 8-14 (2017).</li>
<li>Schlapp, G., Meikle, M. N., Pórfido, J. L., Menchaca, A., Crispo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygote+cryobanking+applied+to+CRISPR%2FCas9+microinjection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zygote cryobanking applied to CRISPR/Cas9 microinjection in mice.</a> PLoS One. 19 (7), e0306617(2024).</li>
<li>Kamoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+oocyte%2Fembryo+vitrification+in+mammals+from+rodents+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Sci+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances of oocyte/embryo vitrification in mammals from rodents and large animals.</a> Anim Sci J. 95 (1), e13931(2024).</li>
<li>Qiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos+using+low+concentrations+of+cryoprotectants%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos using low concentrations of cryoprotectants.</a> Cryobiology. 98, 127-133 (2021).</li>
<li>Tsang, W. H., Chow, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mammalian+embryos%3A+Advancement+of+putting+life+on+hold%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mammalian embryos: Advancement of putting life on hold.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 163-175 (2010).</li>
</ol>

Die Effizienz der Erzeugung gentechnisch veränderter (GV) Tiere hat sich durch die Entwicklung von Endonukleasen-basierten Methoden, insbesondere CRISPR/Cas9, erheblich erhöht. Viele Labore weltweit produzieren verschiedene gentechnisch veränderte Maus- und Rattenlinien, die kryokonserviert werden sollten, um genetische Drift zu verhindern und die Integrität des ursprünglichen Phänotyps1 zu erhalten. Darüber hinaus entfällt durch die Archivierung die Notwendigkeit einer ständigen Zucht, die oft zu einer übermäßigen Anzahl von Tieren führt. Einige Laboratorien senden gentechnisch veränderte Mauslinien als kryokonservierte Embryonen oder Spermien an internationale Repositorien, um den Austausch dieser Modelle zu erleichtern und gleichzeitig den Transport lebender Tiere zu vermeiden. Dies gewährleistet die Zugänglichkeit zu den Linien ohne die wiederholte Generierung identischer gentechnisch veränderter Tiermodelle2. Aus diesen Gründen ist die Kryokonservierung von Embryonen und Spermien in jeder GV-Tiereinrichtung von größter Bedeutung. Im Allgemeinen wird die Kryokonservierung von Embryonen für die Lagerung von GV-Linien bevorzugt, da Embryonen das vollständige diploide Genom mit Modifikationen enthalten und leicht durch Embryotransfer gewonnen werden können.
Die Vitrifikation ist ein Nichtgleichgewichtsprozess, der durch ein Ungleichgewicht zwischen Wasser, das in die Zelle eindringt, und Wasser, das extrazelluläre Kristalle um sie herum bildet, gekennzeichnet ist. Diese Methode verhindert die Bildung von intrazellulären Eiskristallen und unterscheidet sie von der Slow Freezing Method (SLF)3 (siehe Abbildung 1). Die hohe Konzentration an Kryoprotektiva und der direkte Kontakt mit flüssigem Stickstoff (LN2) ermöglichen eine ultraschnelle Abkühlung (~40 °C/s), wodurch innerhalb von Sekunden ein glasartiger Zustand der Proben erreicht wird. Darüber hinaus ist die Vitrifikation schneller, einfacher und kostengünstiger als das langsame Einfrieren4. Es werden nur minimale LN2 benötigt und in der Regel einfache Geräte verwendet, die kommerziell erworben oder selbst hergestellt werden können5 (siehe Abbildung 1).
Darüber hinaus ist der Erwärmungsprozess in der Regel schnell und replizierbar. Sie sollte schnell durchgeführt werden, um eine Toxizität des Kryoprotektivums zu vermeiden und den glasartigen Zustandaufrechtzuerhalten 3. Beim Einfrieren von Embryonen berücksichtigen viele Labore die Bequemlichkeit des Trägergeräts, seine Zuverlässigkeit, Robustheit, Haltekapazität und Kosten.
Wir bevorzugen die Vitrifikationsmethode mit Spachtel mit minimalem Volumen für die routinemäßige Kryokonservierung von Schaf- und Mausembryonen mit dem Spatel Montevideo (MVD) 6. Anfangs haben wir die Methode des langsamen Einfrierens7 angewendet, sind aber schnell zur Vitrifikation übergegangen. Um ein einfacheres und platzsparenderes Gerät für den LN2 Dewar zu schaffen, haben wir den selbstgemachten Spatel von Tsang and Chow (2009)8, der in ein Kryoröhrchen gesteckt wird, modifiziert, um den Spatel MVD zu entwickeln, der mit einem 0,5 mL Strohhalm verschlossen wird (siehe Materialtabelle). Der Spatel verfügt über eine Gelladerspitze (siehe Materialtabelle), bei der eine Plattform von ca. 1 mm² gebildet wird, indem die Spitze mit einer feinen Pinzette sanft geschmolzen wird, wodurch eine blütenblattartige Platte zum Laden der Embryonen entsteht. Diese Plattform kann bis zu 40 Mausembryonen in einem kleinen Vitrifikationstropfen aufnehmen. Eine Verschlussstange zur Identifizierung (siehe Materialtabelle) wird in das offene Ende der Gelladerspitze eingeführt.
Ziel dieser Methode ist es, Embryonen auf eine einfache, schnelle und kostengünstige Weise zu vitrifizieren, die zudem Platz im Stickstoffdewar spart. Dieses System wird seit vielen Jahren erfolgreich eingesetzt und bietet hervorragende Überlebensraten (~97%) und Fortpflanzungsergebnisse, insbesondere bei Mausembryonen. Da der Spatel MVD im Labor hergestellt wird, ist er im Vergleich zu kommerziellen Geräten eine kostengünstige Methode9. Darüber hinaus spart es im Vergleich zur Verwendung von Kryoröhrchen 8,10 Platz im Stickstoffdewar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Vergleich der beiden wichtigsten Techniken, die für die Kryokonservierung von Embryonen verwendet werden. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Crispo et al.1 geändert. Erstellt im BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Filter&nbsp;</td><td>Schneidermuskel</td><td>16534</td><td>Minisart Spritzenfilter 0,2 &Mikro; L</td></tr><tr><td>0,5 mL Strohhalm&nbsp;</td><td>Miniröhre</td><td>13408/0044</td><td>Mittlere Paillette französischer Typ</td></tr><tr><td>Montage des Absaugrohrs&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Nr. A5177</td><td></td></tr><tr><td>Bunsenbrenner&nbsp;</td><td>Indulab</td><td>7000134</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Nr. D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM70&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Nr. F2878</td><td>Dichtegradient mittel</td></tr><tr><td>Gellader-Spitze</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>10411193</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillare&nbsp;</td><td>Marienfeld</td><td>2900000</td><td>Mikrohämatokrit-Kapillarröhrchen</td></tr><tr><td>Handschuhe für LN2 Handhabung&nbsp;</td><td>Tempshield</td><td>CE0338</td><td>Kryohandschuhe</td></tr><tr><td>Kelchgläser</td><td>Miniröhre</td><td>16913/1133</td><td></td></tr><tr><td>Schutzbrille für LN2 Handhabung&nbsp; &nbsp;</td><td>3M</td><td>&nbsp; 40661-00000-10</td><td>Anti-Beschlag-, Anti-Kratz-Beschichtung</td></tr><tr><td>Kochplatte</td><td>Labec</td><td>LA-SH-II-5B</td><td>Digitales Modell</td></tr><tr><td>Identifikationsstab&nbsp;</td><td>IMV-Technologien</td><td>6326</td><td>Unsteril LG48 mm</td></tr><tr><td>Isolierter Styroporbehälter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN2 Dewar für Lagerung</td><td>Taylor-Wharton</td><td>XT21-AI</td><td>Kryowissenschaften</td></tr><tr><td>Lange Pinzette aus Edelstahl</td><td>Werkzeuge für die Feinwissenschaft</td><td>11000-25</td><td></td></tr><tr><td>M2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Nr. M7167</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Hausgemacht</td><td></td><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung. In der Regel wird 1 L konzentrierter 5x Puffer hergestellt und dann auf 1x verdünnt. Rezeptur: 40 g Natriumchlorid, 1 g Kaliumchlorid, 7,2 g wasserfreies Dinatriumphosphat, 1,2 g Monokaliumphosphat. Destilliertes Wasser hinzufügen und im Autoklaven sterilisieren.</td></tr><tr><td>Petrischale aus Kunststoff</td><td>Falke</td><td>&nbsp; &nbsp; 351029</td><td>Nicht TC-behandelte bakteriologische Petrischale</td></tr><tr><td>Stereomikroskop&nbsp;</td><td>Olymp</td><td>SZ2-LGB</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Nr. S1888</td><td></td></tr><tr><td>Uhrmacher" s #5 Pinzette&nbsp;</td><td>Werkzeuge für die Feinwissenschaft</td><td>11254-20</td><td></td></tr></tbody></table>

spatel montevideo gerät für die vitrifizierung von säugetierembryonen

Spatula Montevideo Device for the Vitrification of Mammalian Embryos

Spatel Montevideo Gerät für die Vitrifizierung von Säugetierembryonen

This study describes an efficient and cost-effective vitrification method for mouse and sheep embryo cryopreservation known as the Spatula Montevideo ...

Um genetisch veränderte Mausmodelle zu generieren und die Linien dann als Backup zu kryokonservieren. Dafür brauchen wir eine einfache, kostengünstige, effiziente und reproduzierbare Methode zur Vitrifizierung der Embryonen. Die Mikroinjektion oder Elektroporation von CRISPR-Cas9 könnte in vitrifizierten, aufgewärmten Maus- und Nutztierzygoten durchgeführt werden, was zu einem flexibleren Zeitplan führt und die Anzahl der verwendeten Tiere reduziert.Bei der Vitrifizierung von Embryonen wird eine ultraschnelle Abkühlung verwendet, um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern und die zelluläre Integrität zu erhalten. Diese Technik bringt die kryobiologische Forschung voran und ermöglicht Studien zur Lebensfähigkeit von Embryonen, zur genetischen Stabilität und zu den Ergebnissen der Langzeitlagerung. Sowohl der Spachtel MVD als auch die Lösungen sind hausgemacht. Der Spatel ist mit einem 0,5-Milliliter-Strohhalm verschlossen und nimmt so nur minimalen Platz im flüssigen Stickstoff-Dewar ein.[Dozent] Schneiden Sie zunächst die ersten 10 Millimeter und den Spitzenkegel einer Gelladerspitze ab. Halten Sie mit der Pinzette Nummer fünf des Uhrmachers das Ende der Gelladerspitze etwa ein

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Das Küken Chorioallantoismembran (CAM) ist eine einzigartige, natürlich immundefizienten unterstützende Kultur Umwelt, die Angiogenese und Tumorentstehung zu untersuchen. Dieses Video Artikel zeigt die verschiedenen Schritte in...

Küken Ex ovo Kultur und Ex ovo CAM-Assay: Wie es wirklich funktioniert

Dieses Video beschreibt die pronukleäre Injektion von lentiviralen Vektoren in den perivitellinen Raum eines befruchteten Mausembryos. Das Lentivirus enthält das Transgen, das in das Genom des befruchteten Embryos eingebaut wird und schließlich transgene Mäuse hervorbringt.

Lentivirale vektorbasierte Perivellin-Injektion: Eine Methode zur Transduktion des interessierenden Gens in befruchtete einzellige Maus-Eizellen

Utero-Eileiter-Embryo-Transfer verwendet die utero-Eileiter-Kreuzung als Barriere, um den Embryo Abfluss, die bei der Durchführung von Uterus Übertragung auftreten können, zu verhindern. Vasektomierten Männchen sind erforderlich, um pseudo-Empfänger für Embryotransfer erhalten. Beide Techniken werden diskutiert.

Utero-Tubenembryotransfer und Vasektomie im Maus-Modell

Neurale Vorläufer Mitose ist ein kritischer Parameter der Neurogenese. Viel von unserem Verständnis der neuralen Vorläufer Mitose basiert auf der Analyse von festen Gewebe basiert. Live-Bildgebung in der embryonalen Hirnschnitten ist eine vielseitige Technik zur Mitose mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in einer kontrollierten Umgebung zu beurteilen.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

MicroSecure Vitrification wurde als nicht-kommerzielles, aseptisches, geschlossenes Vitrifikationssystem entwickelt, das den guten Herstellungs- und Gewebehandhabungspraktiken der FDA entspricht. Aufgrund der Rücknahme von hydrophoben verstopften Embryonalhalmen aus der Industrie wurde das Vitrifikationsverfahren dahingehend geändert, dass eine innere Versiegelung vor dem standardmäßigen internen Baumwollstopfen vorgesehen ist.

Modifizierte MicroSecure Vitrifikation: Eine sichere, einfache und sehr effektive Kryokonservierung Verfahren für Human Blastozysten

Die assistierten Reproduktionstechniken (ARTs) werden kontinuierlich bewertet, um die Ergebnisse zu verbessern und die damit verbundenen Risiken zu reduzieren. Dieses Manuskript beschreibt ein minimal-invasives Embryotransfer-Verfahren mit einem effizienten Kryokonservierungsprotokoll, das die Verwendung von Kaninchen als ideales Tiermodell der menschlichen Fortpflanzung ermöglicht.

Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell

Hier präsentieren wir ein Time-Lapse morphometrische-Protokoll, um die Intensität der Blastozyste Schrumpfung und Re-Expansion während Previtrification Interventionen und Post-wärmende Erholung folgen. Die Anwendung des Protokolls ist möglich in in-vitro- Befruchtung Labors mit Zeitraffer Mikroskopen ausgestattet und wird bei der Entwicklung einer optimalen Blastozyste-Verglasung-Methode empfohlen.

Morphometrische Protokoll für die objektive Beurteilung der Blastozyste Verhalten während der Verglasung und wärmenden Schritte

Blastozystenbiopsie und Vitrifikation sind erforderlich, um Präimplantations-Gentests effizient durchzuführen. Ein Ansatz, der die sequenzielle Öffnung der Zona pellucida und die Rückgewinnung von 7-8 Trophektodermzellen in Tag 5-7 nach der Besamung einschließt, begrenzt sowohl die Anzahl der erforderlichen Manipulationen als auch die Exposition des Embryos gegenüber suboptimalen Umweltbedingungen.

Menschliche Blastozysten Biopsie und Vitrifikation

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.

Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen

Hier stellen wir eine optimierte Methode zur sofortigen Entfernung eines Teils der Kumulus-Eizell-Komplexe nach der Eizellentnahme vor, um den IVF-Beobachtungsprozess zu beschleunigen, die für die Entnahme von Granulosazellen erforderliche Zeit zu reduzieren, die Exposition der Eizellen gegenüber externen Elementen zu minimieren und die Embryonenentwicklung nicht zu behindern, was letztendlich die Effizienz der IVF-Laborverfahren verbessert.

Die sofortige partielle Entfernung von Kumulus-Eizell-Komplexen: Ein verfeinerter Ansatz für die schnelle Beobachtung der In-vitro-Fertilisation

Erfahren Sie die Vitrifizierung von Maus- und Schafembryonen mit dem Spatel-Montevideo-Protokoll. Diese kostengünstige Methode mit selbstgefertigten Werkzeugen ermöglicht reproduzierbare Kryokonservierung in der Reproduktionsbiologie.

Spatel Montevideo Gerät für die Vitrifizierung von Säugetierembryonen

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