Verbesserte Genverabreichung und -expression durch intraossäre Injektion von Chitosan-Nanopartikeln, verkapselten Adenin-Base-Editor-Plasmiden

Wir schlagen eine Gentherapiemethode vor, die Adenin-basiertes Editor Chitosan durch intraossäre Injektion direkt an das Knochenmark abgibt. Die Transfektionseffizienz exogener Plasmide in Versuchstiere ist relativ gering und die Einführung von Plasmiden für die langfristige Genexpression kann durch das Immunsystem beeinflusst werden. Wir verwenden das Totosan zur Verkapselung von Adenin-basierten Editor-Plasmiden und gaben den Komplex durch intraossäre Injektion direkt an das Knochenmark von Mäusen ab, wodurch er für Krankheiten geeignet ist, die durch eine abnormale Osteoklastenfunktion verursacht werden.

Unser Protokoll bietet eine hohe Transfektionseffizienz, geringe biologische Schäden und eine hohe Genexpressionseffizienz. Unsere neuartige Strategie eignet sich nicht nur für Krankheiten, die durch eine gestörte Osteoklastenfunktion verursacht werden, sondern hat auch ein erhebliches Potenzial, das Gebiet der Gentherapie voranzutreiben. Legen Sie zunächst eine euthanasierte Maus auf einen Arbeitstisch.

Entfernen Sie mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette das Schienbein und entfernen Sie das gesamte umgebende Muskelgewebe. Tränken Sie das gereinigte Schienbein in PBS und waschen Sie, bis nur noch der Knochen übrig ist. Ziehen Sie einen Milliliter PBS in eine Spritze und spülen Sie die Knochenmarkzellen von einem Ende der Tibia aus, bis der Knochen vollständig weiß wird.

Sammeln Sie anschließend die Zellsuspension in einem Röhrchen. Zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 800 g bei vier Grad Celsius. Geben Sie nach dem Pipettieren des Überstands 500 Mikroliter Lysepuffer für rote Blutkörperchen in das Pellet.

Fügen Sie nach einer Minute einen Milliliter Trennpuffer hinzu, um die Lyse zu beenden. Die Suspension wird erneut bei 800 G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und legen Sie das resultierende Zellpellet für die spätere Verwendung auf Eis.

Für die Chitosan-Transfektion lösen Sie vier Milligramm Chitosan in 20 Millilitern Essigsäurelösung. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 molaren Natriumhydroxid auf 5,5 ein. Geben Sie dann 500 Mikroliter der Chitosanlösung in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen ab.

Geben Sie nun zwei, drei, vier und fünf Mikrogramm ABE-Plasmide in einzelne Röhrchen. Lösen Sie die Plasmide in 500 Mikrolitern 30 millimolarem Natriumsulfat auf. Mischen Sie dann 500 Mikroliter Plasmidlösung mit 500 Mikrolitern Chitosanlösung in entsprechenden Röhrchen.

Inkubieren Sie die Röhren in einem Wasserbad bei 50 bis 55 Grad Celsius für 15 Minuten. Wirbeln Sie jedes Rohr 15 bis 30 Sekunden lang vor und lassen Sie es 30 Minuten lang ungestört stehen. Zur Charakterisierung analysieren Sie den Durchmesser und das Zetapotenzial von Chitosan mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung.

Halten Sie die Konzentration von Chitosan bei 0,1 Milligramm pro Milliliter in doppelt destilliertem Wasser. Als nächstes gießen Sie 0,1 Milligramm pro Milliliter Chitosanproben auf einen Siliziumchip. 20 Mikroliter der resuspendierten Proben auf 200-Mesh-Gitter geben und inkubieren.

Zentrifugieren Sie die Knochenmarkzellsuspension bei 800 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie dann 500 Mikroliter Lysat der roten Blutkörperchen hinzu. Fügen Sie nach einer Minute einen Milliliter Trennpuffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen.

Zählen Sie dann die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler. Übertragen Sie als Nächstes 1 Million Zellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Nach dem erneuten Zentrifugieren pipettieren Sie den Überstand heraus und resuspendieren die Zellen in 500 Mikrolitern PBS.

Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein Durchflusszytometrieröhrchen und messen Sie die Transfektionseffizienz mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Für die Injektion von Knochenmarkhöhlen fixieren Sie die anästhesierte Maus in Rückenlage auf dem Operationstisch. Verwenden Sie Klebeband, um das vordere Glied an Ort und Stelle zu befestigen.

Desinfizieren Sie das hintere Schienbein mit einem Alkoholtupfer. Laden Sie dann die Plasmidlösung in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Entfernen Sie alle Luftblasen und halten Sie die Spritze für die Injektion bereit.

Berühren und stabilisieren Sie anschließend mit den Fingern das Schienbein der Maus. Positionieren Sie die Injektionsnadel so, dass sie vom Tibiaplateau in der Nähe des Kniegelenks in den Tibiaschaft eintritt. Drehen Sie nun die Nadel parallel zur Tibia, führen Sie sie in die Knochenmarkhöhle ein und injizieren Sie langsam über drei Sekunden.

Ziehen Sie die Nadel nach der Injektion langsam über drei Sekunden zurück. Desinfizieren Sie die Einstichstelle sofort mit einem Alkoholtupfer, um Blutungen zu stoppen. Stellen Sie die Maus in eine warme Umgebung bei 37 Grad Celsius, um die Wiederherstellung zu erleichtern.

Nanopartikel, die mit den Plasmiden ABE und GRNA gebildet wurden, wiesen eine einheitliche sphärische Morphologie und eine enge Größenverteilung mit einer durchschnittlichen Größe von 202,9 Nanometern auf. Ein Zetapotential von 2,77 Millivolt und ein Polydispersitätsindex von 0,22. Das in Chitosan eingebettete ABE-Plasmid erhöhte signifikant das Fluoreszenzsignal in Knochenmarkzellen, was auf eine höhere Transfektionseffizienz im Vergleich zur Kontrollgruppe hinweist.

Die Durchflusszytometrie bestätigte, dass das Chitosan-kodierte ABE-Plasmid eine hohe Transfektionseffizienz in Knochenmarkzellen erreichte. Mit einer Spitzeneffizienz von 51,2 %, die bei einer Dosis von vier Mikrogramm beobachtet wurde, während drei Mikrogramm eine Ausgewogenheit der hohen Effizienz von 47,2 % ergabenSanger-Sequenzierung und PCR von genomischer DNA von Knochenmarkzellen zeigte sich in vivo eine Geneditierung an der Zielstelle A1 mit einer Effizienz von 14,27 % und an der Stelle A2 mit einer Effizienz von 10,69 %.